Summary
Denne protokollen beskriver transposisjonsmodellen for tibial neurom, som innebærer en lesjon av tibialnerven med påfølgende transposisjon av den proksimale nerveenden mot en subkutan pretibial eller lateral stilling. Atferdstesting av nevromsmerter og plantar hyperalgesi kvantifiseres ved hjelp av Von Frey-monofilamenter.
Abstract
Tibial neuroma transposition (TNT) er en rottemodell hvor allodyni på nevromstedet (tibialnerven) kan evalueres uavhengig fra allodyni på plantaroverflaten av bakpoten innervert av den intakte surale nerven. Denne TNT-modellen er egnet til å teste terapier for nevroma smerte, for eksempel den potensielle overlegenheten til visse kirurgiske terapier som allerede brukes i klinikken, eller for å evaluere nye stoffer og deres effekt på begge smertemodaliteter i samme dyr. I denne modellen lages en distal lesjon (neurotmesis) i nervus tibia, og den proksimale nerveenden transponeres og fikseres subkutant og pretibialt for å muliggjøre vurderinger av nevromstedet med et 15 g Von Frey monofilament. For å vurdere allodyni over suralnerven kan Von Frey-monofilamenter brukes via opp-ned-metoden på plantarlateralområdet i bakpoten. Etter å ha kuttet tibialnerven, utvikler mekanisk overfølsomhet på nevromstedet innen 1 uke etter operasjonen og vedvarer minst til 12 uker etter operasjonen. Allodyni på den surale innerverte plantaroverflaten utvikler seg innen 3 uker etter operasjonen sammenlignet med den kontralaterale lemmen. Etter 12 uker dannes et neurom på den proksimale enden av den avskårne tibialnerven, indikert ved dispersjon og virvling av axoner. For TNT-modelloperasjonen må flere kritiske (mikro) kirurgiske trinn følges, og noen kirurgiske praksis under terminal anestesi anbefales. Sammenlignet med andre nevropatiske smertemodeller, som den sparte nerveskademodellen, kan allodyni over nevromstedet uavhengig testes fra sural nerveoverfølsomhet i TNT-modellen. Imidlertid kan neuroma-nettstedet bare testes hos rotter, ikke hos mus. Tipsene og instruksjonene i denne protokollen kan hjelpe forskningsgrupper som arbeider med smerte, med vellykket implementering av TNT-modellen i deres anlegg.
Introduction
Hvert sår, varierende fra enkle kuttskader til amputasjon av hele lemmer, ledsages av varierende grad av perifer nerveskade. Slike nerveskader kan resultere i dannelse av et nevrom, en uorganisert sammenfiltring av spirende nervefibre. Neuromer blir smertefulle hos 8% -30% av pasientene, noe som påvirker livskvaliteten deres 1,2,3,4,5. Etter amputasjon av lemmer utvikler nevrom smerte hos 50% av pasientene 6,7,8. Rapporterte symptomer inkluderer ømhet, spontan smerte, allodyni, hyperalgesi og mekanisk eller termisk overfølsomhet i det indre området9. Når det ikke behandles tilstrekkelig innen 1 år, kan nevrom smerte gå videre til en kronisk smertetilstand, noe som resulterer i høy samfunnsbelastning og tilhørende medisinske kostnader 10,11,12,13,14. På grunn av den dårlige effekten av dagens farmakologiske inngrep, behandles neuroma smerte fortrinnsvis ved kirurgisk fjerning av det smertefulle neuromet, og nerven behandles med ulike kirurgiske teknikker, som beskrevet i litteraturen15. Det er viktig å merke seg at fullstendig smertelindring er sjelden, smerte forverres ofte over tid, og 40% av pasientene har ikke nytte av operasjonen, noe som indikerer at nye behandlinger er nødvendig 1,16.
En standardisert rottemodell av neuroma smerte hjelpemidler i å forstå mekanismene som driver neuroma smerte, og kan bidra til å identifisere nye behandlinger eller evaluere eksisterende som brukes i klinikken. Tibial neuroma transposition (TNT) -modellen ble først beskrevet av Dorsi et al. i 200817 og har blitt brukt av ulike forskningsgrupper18,19,20. Det overordnede målet med denne metoden er å kunne teste ulike behandlingsteknikker for nevrom smerte. Fordelen med modellen over for eksempel den sparte nerveskaden (SNI) modell21, er at den gjør det mulig å teste allodyni på nevromstedet. Dette skyldes at modellen innebærer å transponere den proksimale nerveenden av tibialnerven til en subkutan pretibial posisjon, hvor den kan undersøkes med von Frey-monofilamenter. Videre utvikler allodyni på plantaroverflaten av bakpoten innervert av den intakte suralnerven, som kan vurderes uavhengig av nevromasmerten i samme dyr. Dette ligner symptomer på nevroma smerte hos pasienter, hvor vedvarende nevropatisk smerte etter fjerning av et smertefullt neurom noen ganger er forårsaket av nabonervene22. Videre er allodyni over en avskåret nerve med et neurom en annen smertemodalitet enn allodyni over den intakte nabonerven. Dermed letter denne modellen vurderingen av effekten av nye terapier på både allodyni tilstede på nevromstedet og mer utbredt nevropatisk smerte testet i plantaroverflaten av bakpoten. Siden operasjonen som utføres for å lage TNT-modellen kan være utfordrende, utdyper dette papiret prosedyren for å støtte forskere som implementerer modellen i deres anlegg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskningen ble utført i henhold til IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) og retningslinjene for dyreforsøk, prosjektnummer AVD1150020198824.
1. Von Frey baseline målinger
- Før operasjonen skal du utføre baselinemålinger i henhold til Von Freys testprosedyre, beskrevet nedenfor i avsnitt 5 og avsnitt 6.
2. Anestesi og forberedelse
MERK: Denne studien ble utført på 15 mannlige Sprague Dawley-rotter som var 12 uker gamle.
- Bedøv dyrene ved induksjon med 5% isofluran og oppretthold anestesi med 2%-3% isofluran.
MERK: Vedlikehold med 2 % isofluran resulterer vanligvis i tilstrekkelig anestesi og spontan pusting, uten behov for trakeal intubasjon eller mekanisk ventilasjon. - Sjekk dyrenes reflekser ved å klemme foten med pinsett. Forsikre deg om at dyret ikke reagerer før du fortsetter. Barber operasjonsfeltet fra kne til ankel med en elektrisk barbermaskin og bruk oftalmisk salve på øynene for å forhindre tørrhet. Injiser 0,5 mg/kg smertestillende karprofen subkutant i abdominalregionen.
- Plasser den bedøvede rotta på ryggen med hodet enten til venstre eller høyre og benet som skal opereres i nærheten av kirurgen. Exorotate nedre bakre lem slik at mediale malleolus vender oppover. Plasser rotta under et stereokirurgisk mikroskop med 6x forstørrelse.
- Desinfiser det barberte området med tre vekslende runder med jodbasert skrubb etterfulgt av alkohol. Plasser et sterilt ark med et operativt hull over beinet, slik at bare operasjonsfeltet er synlig. Sørg for å opprettholde disse sterile forholdene under operasjonen.
3. Kirurgi
- Legg en liten bomullspinne under ankelen for å holde operasjonsfeltet horisontalt. Finn kneet og lag forsiktig et langsgående snitt på 1-2 cm ved hjelp av en skalpell over medialsiden av bakpoten fra midten av leggen til ankelen. Hvis nødvendig, åpne huden og underhuden videre med mikrosaks til muskellagene er synlige.
- Identifiser den overfladiske nevrovaskulære bunten som to eller tre hvite og en tykkere lilla / rød linje, noen ganger med mindre grener, som kan bevege seg fritt over muskellagene. Ved hjelp av et elektrokauteri (se materialfortegnelse), koaguler enhver aktiv blødning eller oser i operasjonsfeltet. Vær forsiktig så du ikke skader nevrovaskulær bunt.
- Sløvt dissekere for å åpne fascia mellom gastrocnemius-musklene, like bakenfor den overfladiske nevrovaskulære bunten på 3,2. Mellom fascia av musklene, kan tibialnerven bli funnet. Tibialnerven er omtrent tre ganger størrelsen på overfladisk nerve i nevrovaskulær bunt. Bruk tibialbenet som et ekstra landemerke (tibialnerven ligger like bakenfor tibialbenet).
- Identifiser tibialnerven og dens bifurkasjon.
MERK: Bifurkasjonen er vanligvis synlig med en lysere linje i lengderetningen over nerven. - Forsiktig dissekere tibialnerven fri fra de omkringliggende vaskulære bunter. Utfør disseksjonen ved å bevege tibialnerven stumpt og kutte det eksponerte vevet som viser litt strekk mens du beveger tibialnerven.
MERK: Hvis tibialnerven er festet til kryssende vener etter disseksjon, kan disse venene koaguleres for å eksponere hele tibialnerven. Vær forsiktig så du ikke koagulerer selve tibialbunten. - Eksponer tibialnerven proksimalt til den forsvinner under et kryssende muskellag. På dette tidspunktet ser tibialnerven ut til å dykke dypere inn i bakpoten mot kneet. Eksponer tibialnerven distalt opp til ankelen.
MERK: Når tibialnerven eksponeres mer distalt, vil mengden kryssende kollagenfibre (dvs. fibre vinkelrett på nervefibrenes retning) øke. Disse kollagenfibrene må kuttes for å muliggjøre nok lengde for transponering av tibialnerven.- Når hele tibialnerven er utsatt, plasser muskellagene tilbake for å unngå dehydrering av nerven. Hvis nerven dehydrerer (dvs. den blir stivere, kjedelig og rynkete), og det ikke er nok å dekke med muskellag, tilsett dråper saltvann for å hydrere det.
- Bruk et stumpt mikrokirurgisk verktøy, helst en mikronålholder, dissekere den pretibiale huden fra det subkutane muskellaget for å lage en subkutan tunnel. For å gjøre dette, hold huden opp og skyv den stumpe spissen inn i vevet, parallelt med huden. Pass på at enden av tunnelen er plassert pretibialt eller mer lateralt for å sikre enkel tilgjengelighet til området for testing av neuroma.
- Øk isofluran til 5 %. Gå tilbake til tibialnerven og eksponer den (dvs. gå tilbake til stedet beskrevet i trinn 3.6). Kutt tibialnerven (dvs. begge plantarvrener) på det mest distale nivået nær ankelen. Reduser isofluran til normalt nivå på 2-3 %.
- Endre mikroskopforstørrelsen til 10x eller 16x. Identifiser epineurium av tibialnerven proksimalt for kuttet som ble gjort i trinn 3.8, eller i tilfelle en mer proksimal bifurkasjon av tibialnerven, identifiser epineurium for både mediale og laterale plantarvgrener proksimalt for kuttet i trinn 3.8.
MERK: Epineurium er hvitere og fastere sammenlignet med nervefibrene innenfor, som er mer gule og myke. - Sett forsiktig en 8-0 nylonsutur (se materialfortegnelse) gjennom epineurium i den proksimale nerveenden ved å holde epineurium forsiktig med pinsett og sette nålen mellom nerve og epineurium med et bitt på ca. 0,5 mm. Trekk suturen gjennom og ta en bit med nålen subkutant i enden av den subkutane tunnelen laget i trinn 3.7. Lag en knute, som vil transponere nerven lateralt inn i den subkutane tunnelen.
MERK: Hvis begge plantarvgrenene deler et felles epineurium, bør en sutur være tilstrekkelig. Hvis begge plantargrenene har sitt eget epineurium, bør hvert epineurium fikseres individuelt. Unngå å plassere suturen gjennom huden; Bare fikse det subkutant. - Plasser en tykkere sutur med en mørk farge (helst en blå eller svart 4-0 sutur) skyll til den fikserte nerveenden, ikke penetrer huden. Pass på at suturen er synlig fra utsiden av huden. Sjekk om nerven holder seg på plass etter å ha flyttet poten og musklene. Klipp av suturen ender med en litt lengre suturende på 4-0 enn på 8-0 Sutur.
- Endre forstørrelsen av mikroskopet tilbake til 6x. Lukk huden med intraepidermale suturer ved hjelp av 8-0 sutur og rengjør huden forsiktig med 0,9% NaCl ved hjelp av en bomullspinne.
4. Postoperativ behandling
- Plasser rotta i et rent bur under et papirhåndkle i en komfortabel posisjon. Hvis rommet er kaldt, plasser en varmepute under en del av buret (bare under en del av buret, da dyret skal kunne unnslippe varmen når det trengs). Sørg for enkel tilgang til mat og vann.
- Ikke la rotta etter operasjonen være uten tilsyn før den har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Rotta kan returneres til selskap med andre dyr når den har fullstendig gjenopprettet fra anestesi etter operasjonen. Dette er vanligvis etter 1 time og når rotta viser sitt normale gangmønster og oppførsel.
- Ved 24 timer og 48 timer etter operasjonen, administrer en dose på 0,5 mg / kg karprofen subkutant (mageregionen) for å behandle postkirurgisk smerte.
5. Von Frey testing av plantarsiden av bakpotene
MERK: Von Frey testing (trinn 5 og 6) utføres før kirurgi (for baseline måling), og fra 3 dager etter operasjonen.
- Plasser rottene i nettingbunnbur 1 uke før baselinemåling, eller 2 uker før operasjonen, for å sikre akklimatisering til testmiljøet.
- Start med baseline tiltak minst 1 uke før operasjonen. Sørg for at tre uavhengige basislinjemålinger utføres på separate dager.
- Kontroller at rottene er rolige i de nettingkablede bunnburene. Påfør en serie Von Frey-monofilamenter med en logaritmisk skala vinkelrett på plantaroverflaten på bakpoten.
- For å stimulere suralnerven (overfølsomhet), bruk monofilamentet på sidesiden nær hårgrensen. Unngå å berøre fotputene, da disse er mer følsomme.
- For å stimulere tibialnerven (hyposensitivitet), bruk monofilamentet midt på plantaroverflaten på bakpoten. Dersom monofilamentet påføres i det mest mediale området, vil dette også kunne stimulere nervus saphenøs, en gren av nervus femoralis (figur 1). Unngå å berøre fotputene.
- Start med 4 g monofilament. Påfør tilstrekkelig kraft på monofilamentet slik at håret bøyer seg og holder i 3 s, og kontroller deretter dyrets respons på monofilamentet. En positiv respons er plutselig poteuttak, plutselig flinching, plutselig poteslikking eller vokalisering. I noen tilfeller beveger rotta seg og prøver å finne/angripe monofilamentet.
- Velg neste monofilament avhengig av responsen på stimulansen via opp-ned-metoden23. For eksempel, hvis rotta reagerer, stimuler neste med 2 g monofilamentet; Hvis rotta ikke reagerer, stimuler med 6 g monofilament, og så videre. Totalt gjelder 5-10 stimuli avhengig av reaksjonen.
6. Von Frey testing av neuroma stedet
- Håndter dyrene daglig i minst 5-7 dager før baseline tiltak eller 2 uker før operasjonen. Sørg for at dyrene holdes som beskrevet i trinn 6.2, slik at de er komfortable med stillingen.
- Hold rottene med nesen pekende mot albuefolden. Hvis rotta holdes i høyre hånd, skal venstre bakpote henge fritt mellom høyre tommel og pekefinger (første webhotell). Hvis rotta holdes i venstre hånd, skal høyre bakpote henge fritt mellom venstre tommel og pekefinger.
- Start med baseline tiltak minst 1 uke før operasjonen. Sørg for at tre uavhengige basislinjemålinger utføres på separate dager.
- Kontroller at rottene er rolige og komfortable mens de holdes. Ved baseline plasserer du monofilamentet på 15 g forsiktig på den pretibiale overflaten av den eksponerte bakpoten. Etter operasjonen, plasser 15 g monofilamentet på den synlige suturen (f.eks. På stedet for nevromet). Påfør tilstrekkelig kraft på monofilamentet slik at håret bøyer seg og holder i 1 s.
- Registrer reaksjonen på hver stimulus. Reaksjonsalternativene inkluderer ingen reaksjon, langsom tilbaketrekking, rask tilbaketrekking og vokalisering. Registrer svaret som 0 poeng for ingen reaksjon og ett poeng for langsom tilbaketrekking, rask tilbaketrekking eller vokalisering.
- Gjenta fem klynger med fem applikasjoner av monofilamentet, med 2-3 s mellom hver applikasjon og 2-3 min eller mer mellom de fem klyngene. Totalt skal hver bakpote ha 25 anvendelser av monofilamentet med registrerte responser.
7. Prøvegjenvinning for histologi og forberedelse
MERK: Histologisk undersøkelse utføres 12 uker etter første operasjon.
- Indusere anestesi og forberede dyrene som beskrevet i trinn 2.2, 2.3 og 2.4.
- Gjør forsiktig et snitt på 2-3 cm ved hjelp av en skalpell over arret som ble laget ved den første operasjonen, men vær forsiktig så du ikke kutter for dypt da nerven er overfladisk plassert.
- Bestem posisjonen til neuromet, dissekere forsiktig nevromet og nerven fri for omgivende arrvev, og plasser det høstede neuromet i fiksativ. For å evaluere nevrommorfologi er vevet fortrinnsvis langsgående innebygd i parafin eller epoksyharpiks som beskrevet av Tork et al.18.
- Etter høsting av vevet, avlive rottene under terminal anestesi (5% isofluran) via hjertepunksjon eller halshugging.
MERK: Det anbefales å først høste neuromet før du dreper rotter, for da er det lettere å skille nevromet fra det omkringliggende vevet in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering på nevromstedet viste økt følsomhet for påføring av 15 g von Frey monofilament. Ved baseline responderte rotter vanligvis på 10 %-15 % (± 13 %) av de 25 applikasjonene av et 15 g monofilament. Responsraten økte til 45%-50% (± 24%) 1 uke etter TNT-operasjonen. På kontralateral side var antall responser etter kirurgi tilsvarende som ved baseline (figur 2A). Rundt 20% av rottene utviklet ikke et smertefullt neurom; responsraten økte ikke sammenlignet med baseline (figur 2B). Dette er sammenlignbart med den menneskelige situasjonen, hvor ikke alle pasienter (50% etter amputasjon) utvikler smerte etter dannelsen av et neurom. Alle rottene utviklet et nevrom på slutten av den transekterte og transponerte tibialnervestubben 12 uker etter operasjonen (figur 3). Dette neuromet ble preget av virvlende aksoner og mikrofascikler i kollagenavsetninger.
Transeksjon av nervus tibia reduserte mekanisk følsomhet midt på plantarsiden av baklabben, innervert av nervus tibia (figur 1). Hyposensitiviteten forelå 1 uke etter operasjonen, var signifikant forskjellig fra kontralateral side og baseline fra 3 uker etter operasjon og vedvarte til minst 12 uker etter operasjon (figur 4). På lateral del av plantarsiden av baklabben innervert av intakt suralnerve utviklet rottene mekanisk overfølsomhet som var signifikant forskjellig fra kontralateral side og baseline fra 1 uke etter operasjon (figur 4). Denne overfølsomheten vedvarte i minst 12 uker etter operasjonen. Ved kontralateral labb ble ikke mekanisk sensitivitet påvirket sammenlignet med baseline i områdene enten innervert av nervus sural eller tibial (figur 4).
Figur 1 Nervefordeling på plantarsiden av bakpoten. Rød = sural nervefordeling (lateral); lilla = tibial nervefordeling (midten); grønn = saphenøs nervefordeling (medial). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Von Frey fra nevromstedet. Nervus tibia ble transektert, og forløpet av mekanisk følsomhet over nevromstedet ble vurdert med et 15 g monofilament påført i fem klynger med fem applikasjoner hver, med totalt 25 påføringer. Et svar blir scoret som ett poeng. (A) Nevromstedet viste en signifikant høyere respons 1 uke etter operasjonen sammenlignet med baseline og kontralateral side. N = 15; feilfelt: standardfeil av gjennomsnittet (SEM); blandet modellanalyse med flere sammenligninger og Tukey-test. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. (B) Individuelle verdier av det ipsilaterale nettstedet viser mangfold i reaksjon. Tre rotter (20 %) hadde en relativt høy baseline score, og tre rotter (20 %) viste ingen endringer i pretibial sensitivitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Morfologi av neuromet. Histologiske bilder av et 12 uker gammelt neurom. (A) Hematoksylin-Eosin-farging, (B) Massons trichrome-farging og (C) Neurofilamentfarging. Grønn pil = tibialnerven bare proksimal for nevromet. Oransje pil = neurom, identifisert ved virvling av aksoner og diffusjon av fasciklene. Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Von Frey av plantarbaklabben (nervus tibial og sural). Nervus tibia ble transektert, og forløpet av mekanisk følsomhet ble vurdert ved Von Frey-testing på bakpotens plantaroverflate. Midtre del av den ipsilaterale opererte baklabben innervert av nervus tibia viste hyposensitivitet. Den laterale delen av den ipsilaterale opererte baklabben innervert av suralnerven viste overfølsomhet. Den midtre og laterale delen av plantarens kontralaterale bakpote viste ingen endringer i sensitivitet sammenlignet med baseline. N = 15; feilfelt: standardfeil av gjennomsnittet (SEM); blandet modellanalyse med flere sammenligninger og Tukey-test. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
TNT-modellen innebærer å kutte tibialnerven og transponere den lateralt og subkutant til en pretibial plassering for å muliggjøre følsomhetstesting av nevromet, i tillegg til plantar hyperalgesi over suralnerven. I TNT-modellen er det viktig at nevromets sted er synlig for forskerne. Derfor foretrekkes en albino rottestamme fordi subkutane suturer er lett synlige gjennom huden og fargen på suturen skal helst være mørkblå eller svart.
Når operasjonen utføres og tibialnerven eksponeres, er det variasjon i stedet (f.eks. proksimalt eller distalt) av bifurkasjonen av tibialnerven. Hvis rotter har en proksimal bifurkasjon, er det mulig at man finner to nerver (mediale og laterale plantarnerver) proksimalt for ankelen (figur 5A), i stedet for bare én tibialnerve (figur 5B). Det er viktig at begge grenene kuttes og transponeres for å indusere plantarhyperalgesi over suralnerven. Man kunne velge å bare transponere en plantarnerve; Det skilles imidlertid ikke lett mellom lateral og medial plantarnerve på dette nivået og kan påvirke resultatene. Derfor anbefales det å transponere begge nerver. Videre kan noen rotter ha en mer distal bifurkasjon av tibialnerven, og transponering av bare en plantarnerve kan være umulig.
Figur 5 Proksimal og distal bifurkasjon av nervus tibia. Anatomisk variasjon i nivået av bifurkasjon (*) av tibialnerven. (A) Proksimal bifurkasjon av tibialnerven; (B) distal bifurkasjon av tibialnerven. Forkortelser: MPN = medial plantarnerve, LPN = lateral plantarnerve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I den opprinnelige artikkelen av Dorsi et al.17 er en ligatur plassert rundt den proksimale tibiale nerveenden, og nerven transponeres og fikseres via denne ligatursuturen. Siden ligaturen rundt nerven kan indusere innsnevringssmerter24, er et alternativ beskrevet i denne metoden å fikse nerven ved hjelp av epineurinal suturer. Hvis tibialnerven kuttes og transponeres, er det viktig at suturen for å fikse nerven subkutant plasseres gjennom epineurium og ikke nervefasciklene selv, da dette også kan påvirke smertetiltak. I tillegg bør man unngå å plassere suturen gjennom huden, da rotter har en tendens til å gnave noen synlige suturer, noe som resulterer i forskyvning av nevromet og dermed ikke-pålitelige resultater av smertetiltak.
Når huden er lukket, er det også viktig å bruke intraepidermale suturer for å unngå gnaging som vil resultere i et åpent sår. Videre, etter å ha transponert tibialnerven, vil den ligge i et mer overfladisk lag like under huden. Et åpent sår i kombinasjon med en overfladisk plassert nerve er uønsket.
Von Frey-målinger kan utføres for å teste nevromsmerter på nevromstedet og for å teste plantar hyperalgesi over suralnerven, på lateral side av bakpoten. Neuromastedet er synlig etter operasjonen på grunn av suturens mørke farge. For testing av sural nerveoverfølsomhet bør det velges ett sted hvor Von Frey-monofilamentet påføres. Dette kan være proksimalt eller distalt for matputen sideveis, men bør være omtrent samme sted ved baselinemålinger og målinger i ukene etter operasjonen.
Feilsøking av metoden
Hvis rottene reagerer på alle stimuli som påføres det pretibiale området allerede under baselinemålinger, må du sørge for at de er rolige og avslappede, og at de er riktig akklimatisert til testområdet. Gjenta baselinemåling til rottene reagerer mindre på stimuli. I tillegg er det å foretrekke å ikke bruke parfyme mens du utfører målinger. Ideelt sett reagerer ikke rotter på pretibial stimulans når en 15 g monofilament påføres før kirurgi. Men hvis rottene er rolige, og 50%-100% av rottene fortsatt reagerer på 15 g monofilamentet, bytt det til et monofilament som har en 10% -20% responsrate under baseline. Imidlertid, hvis monofilamentet endres, anbefales det først å utføre et piloteksperiment for å teste om TNT-rottene reagerer på denne lavere styrken av monofilament. I den første artikkelen i TNT-modellen ble nevromstedet målt ved å påføre monofilamentet gjennom en åpning i bunnen av en Perspex boks17. I pilotforsøk ble rotter funnet å reagere på hver stimulus når de ble påført via bunnen av buret og hadde en tendens til å angripe monofilamentet. Når de ble holdt tett av forskeren, var rottene i en rolig tilstand, noe som resulterte i en lavere responsrate på monofilamentet under baselinemåling.
Hvis den proksimale tibialnerveenden ikke kan nå langt nok i den subkutane tunnelen, følg kursen til tibialnerven mer proksimalt og fjern eventuelt kollagenøst og fettvev rundt nerven. Klipp noen mindre nervegrener eller fartøy som holder nerven fast til omgivelsene. Dette vil gi nerven et bredere bevegelsesområde som skal transponeres mer lateralt. Merk at i den opprinnelige artikkelen av Dorsi et al.17 ble nerven transponert mer lateralt. I pilotforsøk ble det funnet å være umulig å nå sideleie. Derfor beskriver denne metoden en pretibial posisjon av nevromstedet.
Begrensninger av metoden
En begrensning av TNT-modellen er at operasjonen innebærer flere (mikro)kirurgiske trinn som skal følges. En annen begrensning er at TNT-modellen ikke lett lar seg oversette til mus. Av erfaring har mus en tendens til å være ganske følsomme for stimuli som brukes på et pretibialt område, selv ved påføring av et 0,008 g monofilament.
Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder
I TNT-modellen kan nevromasmerter testes uavhengig av plantar hyperalgesi over suralnerven. Sistnevnte er også indusert i andre nevropatiske smertemodeller som SNI-modellen, men her kan nevromsmerter ikke testes uavhengig21. I tillegg kuttes både tibial- og peronealnerven i SNI-modellen, noe som resulterer i mer tap av motorisk funksjon som resulterer i lammede indre muskler i pote21. Fordi bare tibialnerven er kuttet på et distalt nivå i TNT-modellen, viser de indre musklene i føttene bare et ubetydelig tap av motorisk funksjon.
Potensielle anvendelser av metoden
Tidligere forskning har allerede vist at TNT-modellen kan brukes til å teste ulike smertestillende medisiner, nervehetter eller andre kirurgiske verktøy for nevrombehandling18,19,20. Imidlertid kan alle forskningsgrupper som er interessert i smerte ha potensiell nytte av å bruke TNT-modellen, da to forskjellige smertemodaliteter kan testes på samme dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir å ikke ha noen interessekonflikt. Selv om dette forskningsarbeidet delvis ble finansiert av Axogen, hadde selskapet ingen innflytelse på gjennomføringen av studien og resultatene.
Acknowledgments
Vi takker Sabine Versteeg for hjelp under mikrokirurgi og Anja van der Sar og Trudy Oosterveld-Romijn fra Common Animal Laboratory (Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium) for deres hjelp med å forberede mikroskop og kirurgisk rom og ta vare på dyrene.
Denne forskningen ble finansiert av Axogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
- Stokvis, A., vander Avoort, D. J., van Neck, J. W., Hovius, S. E., Coert, J. H. Surgical management of neuroma pain: a prospective follow-up study. Pain. 151 (3), 862-869 (2010).
- Domeshek, L. F., et al. Surgical treatment of neuromas improves patient-reported pain, depression, and quality of life. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (2), 407-418 (2017).
- Lame, I. E., Peters, M. L., Vlaeyen, J. W., Kleef, M., Patijn, J. Quality of life in chronic pain is more associated with beliefs about pain, than with pain intensity. European Journal of Pain. 9 (1), 15-24 (2005).
- Koch, H., Haas, F., Hubmer, M., Rappl, T., Scharnagl, E. Treatment of painful neuroma by resection and nerve stump transplantation into a vein. Annals of Plastic Surgery. 51 (1), 45-50 (2003).
- Fisher, G. T., Boswick, J. A. Neuroma formation following digital amputations. Journal of Trauma. 23 (2), 136-142 (1983).
- Bowen, J. B., Ruter, D., Wee, C., West, J., Valerio, I. L. Targeted muscle reinnervation technique in below-knee amputation. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (1), 309-312 (2019).
- Jensen, T. S., Krebs, B., Nielsen, J., Rasmussen, P. Phantom limb, phantom pain and stump pain in amputees during the first 6 months following limb amputation. Pain. 17 (3), 243-256 (1983).
- Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 4 (12), 1038 (2016).
- Arnold, D. M. J., et al. Diagnostic criteria for symptomatic neuroma. Annals of Plastic Surgery. 82 (4), 420-427 (2019).
- Liedgens, H., Obradovic, M., De Courcy, J., Holbrook, T., Jakubanis, R. A burden of illness study for neuropathic pain in Europe. Clinicoeconomics and Outcomes Research. 8, 113-126 (2016).
- Langley, P. C., Van Litsenburg, C., Cappelleri, J. C., Carroll, D. The burden associated with neuropathic pain in Western Europe. Journal of Medical Economics. 16 (1), 85-95 (2013).
- Dworkin, R. H., et al. Interpreting the clinical importance of group differences in chronic pain clinical trials: IMMPACT recommendations. Pain. 146 (3), 238-244 (2009).
- Mackinnon, S. E., Dellon, A. L. Results of treatment of recurrent dorsoradial wrist neuromas. Annals of Plastic Surgery. 19 (1), 54-61 (1987).
- Harden, R. N. Chronic neuropathic pain. Mechanisms, diagnosis, and treatment. Neurologist. 11 (2), 111-122 (2005).
- Poppler, L. H., et al. Surgical interventions for the treatment of painful neuroma: a comparative meta-analysis. Pain. 159 (2), 214-223 (2018).
- Eberlin, K. R., Ducic, I. Surgical algorithm for neuroma management: a changing treatment paradigm. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (10), 1952 (2018).
- Dorsi, M. J., et al. The tibial neuroma transposition (TNT) model of neuroma pain and hyperalgesia. Pain. 134 (3), 320-334 (2008).
- Tork, S., et al. Application of a porcine small intestine submucosa nerve cap for prevention of neuromas and associated pain. Tissue Engineering Part A. 26 (9-10), 503-511 (2020).
- Miyazaki, R., Yamamoto, T. The efficacy of morphine, pregabalin, gabapentin, and duloxetine on mechanical allodynia is different from that on neuroma pain in the rat neuropathic pain model. Anesthesia and Analgesia. 115 (1), 182-188 (2012).
- Tian, J., et al. Swimming training reduces neuroma pain by regulating neurotrophins. Medicine and Science in Sports Exercise. 50 (1), 54-61 (2018).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
- Poublon, A. R., et al. The anatomical relationship of the superficial radial nerve and the lateral antebrachial cutaneous nerve: A possible factor in persistent neuropathic pain. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 68 (2), 237-242 (2015).
- Dixon, W. J.
- Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats. Journal of Visualized Experiments. (61), e3393 (2012).
