Summary
이 프로토콜은 경골 신경의 병변과 근위 신경 말단이 피하 경골 전치 또는 측면 위치로 전이되는 것을 수반하는 경골 신경종 전이 모델을 설명합니다. 신경종 통증 및 족저통각과민의 행동 검사는 Von Frey 모노필라멘트를 사용하여 정량화됩니다.
Abstract
경골 신경종 전위(TNT)는 신경종 부위(경골 신경)의 이질통이 온전한 비골 신경에 의해 신경분포된 뒷발의 발바닥 표면에서 이질통과 독립적으로 평가될 수 있는 쥐 모델입니다. 이 TNT 모델은 클리닉에서 이미 사용되고 있는 특정 수술 요법의 잠재적 우월성과 같은 신경종 통증 치료법을 테스트하거나 동일한 동물의 두 통증 양식에 대한 신약 및 그 효과를 평가하는 데 적합합니다. 이 모델에서는 경골 신경에 원위 병변(신경망)이 만들어지고 근위 신경 말단이 전치되고 피하 및 경골로 고정되어 15g Von Frey 모노필라멘트로 신경종 부위를 평가할 수 있습니다. 비복 신경에 대한 이질통을 평가하기 위해 Von Frey 모노필라멘트는 뒷발의 발바닥 측면 영역에서 상하 방법을 통해 사용할 수 있습니다. 경골 신경을 절단한 후 수술 후 1주일 이내에 신경종 부위에 기계적 과민증이 발생하고 수술 후 최소 12주까지 지속됩니다. 비복 신경 분포 발바닥 표면의 이질통은 반대쪽 사지에 비해 수술 후 3주 이내에 발생합니다. 12 주에 절단 된 경골 신경의 근위 끝에 신경종이 형성되며, 축삭의 분산과 소용돌이로 나타납니다. TNT 모델 수술의 경우 여러 중요한 (미세) 수술 단계를 따라야 하며 말기 마취 하에 일부 수술 실습이 권장됩니다. 예비 신경 손상 모델과 같은 다른 신경병성 통증 모델과 비교하여 신경종 부위에 대한 이질통은 TNT 모델에서 비뇨 신경 과민증으로부터 독립적으로 테스트할 수 있습니다. 그러나 신경종 부위는 생쥐가 아닌 쥐에서만 검사할 수 있습니다. 이 프로토콜에 제공된 팁과 지침은 통증에 대해 연구하는 연구 그룹이 시설에서 TNT 모델을 성공적으로 구현하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
단순한 열상에서 사지 전체 절단에 이르기까지 다양한 상처에는 다양한 정도의 말초 신경 손상이 동반됩니다. 이러한 신경 손상은 발아 신경 섬유의 무질서한 얽힘인 신경종의 형성을 초래할 수 있습니다. 신경종은 환자의 8%-30%에서 통증이 나타나 삶의 질에 심각한 영향을 미칩니다 1,2,3,4,5. 사지 절단 후, 신경 종 통증은 환자의 50 %에서 발생합니다 6,7,8. 보고된 증상으로는 압통, 자발성 통증, 이질통, 통각과민, 신경분포 부위의 기계적 또는 열적 과민증등이 있다 9. 1년 이내에 적절하게 치료하지 않으면 신경종 통증이 만성 통증 상태로 진행되어 높은 사회적 부담과 관련 의료 비용이 발생할 수 있습니다10,11,12,13,14. 현재의 약리학적 개입의 빈약한 효능으로 인해, 신경종 통증은 바람직하게는 문헌15에 기재된 바와 같이 통증성 신경종의 외과적 제거에 의해 치료되고, 신경은 다양한 외과적 기법에 의해 치료된다. 완전한 통증 완화는 드물고, 통증은 종종 시간이 지남에 따라 악화되며, 환자의 40%가 수술의 혜택을 받지 못하므로 새로운 치료법이 필요하다는 점에 유의해야 합니다 1,16.
신경종 통증의 표준화된 쥐 모델은 신경종 통증을 유발하는 메커니즘을 이해하는 데 도움이 되며 새로운 치료법을 식별하거나 클리닉에서 사용되는 기존 치료법을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 경골 신경종 전위(TNT) 모델은 Dorsi et al. 2008년17 및 다른 연구 그룹18,19,20에 의해 사용되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 신경종 통증에 대한 다양한 치료 기술을 테스트할 수 있도록 하는 것입니다. 예를 들어, 예비 신경 손상 (SNI) 모델(21)에 비해 모델의 장점은 신경종 부위에서 이질통을 테스트 할 수 있다는 것입니다. 이는 모델이 경골 신경의 근위 신경 종단을 von Frey 모노필라멘트로 조사할 수 있는 피하 경골 전치 위치로 전치하는 것을 포함하기 때문입니다. 또한, 이질통은 손상되지 않은 비골 신경에 의해 신경이 분포 된 뒷발의 발바닥 표면에서 발생하며, 이는 동일한 동물의 신경종 통증과 독립적으로 평가할 수 있습니다. 이는 환자의 신경종 통증의 증상과 유사하며, 통증성 신경종을 제거한 후 지속적인 신경병성 통증은 때때로 이웃 신경에 의해 유발된다22. 또한, 신경종이 있는 절단된 신경에 대한 이질통은 손상되지 않은 이웃 신경에 대한 이질통과는 다른 통증 양식입니다. 따라서 이 모델은 신경종 부위에 존재하는 이질통과 뒷발의 발바닥 표면에서 테스트된 보다 광범위한 신경병성 통증 모두에 대한 새로운 치료법의 효과 평가를 용이하게 합니다. TNT 모델을 만들기 위해 수행되는 수술이 어려울 수 있으므로 이 백서에서는 연구원이 시설에서 모델을 구현하는 것을 지원하는 절차에 대해 자세히 설명합니다.
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Protocol
본 연구는 IVD(Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) 및 동물 연구 가이드라인(프로젝트 번호 AVD1150020198824)에 따라 수행되었다.
1. Von Frey 기준선 측정
- 수술 전에 아래 섹션 5 및 섹션 6에 설명된 Von Frey 테스트 절차에 따라 기본 측정을 수행합니다.
2. 마취 및 준비
참고: 이 연구는 생후 15주령의 수컷 Sprague Dawley 쥐 12마리를 대상으로 수행되었습니다.
- 5% 이소플루란으로 유도하여 동물을 마취시키고 2%-3% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
알림: 2% 이소플루란으로 유지하면 일반적으로 기관 삽관이나 기계적 환기 없이 충분한 마취와 자발 호흡이 가능합니다. - 핀셋으로 발을 꼬집어 동물의 반사 신경을 확인하십시오. 계속하기 전에 동물이 반응하지 않는지 확인하십시오. 전기 면도기로 무릎에서 발목까지 수술 부위를 면도하고 안과 연고를 눈에 바르면 건조를 예방할 수 있습니다. 진통제 카르프로펜 0.5mg/kg을 복부에 피하 주사한다.
- 마취 된 쥐를 머리가 왼쪽이나 오른쪽으로 향하게하고 수술 할 다리를 외과 의사 근처에 놓습니다. 내측 복사뼈가 위쪽을 향하도록 하부 뒷다리를 외회전시킵니다. 쥐를 6배 배율의 실체 수술 현미경 아래에 놓습니다.
- 면도한 부위를 요오드 기반 스크럽을 세 번 번갈아 가며 소독한 다음 알코올을 바릅니다. 다리 위에 수술 구멍이 있는 멸균 시트를 놓아 수술 부위만 보이도록 합니다. 수술 중 이러한 무균 상태를 유지해야 합니다.
3. 수술
- 수술 부위를 수평으로 유지하기 위해 발목 아래에 작은 면봉을 놓습니다. 무릎을 찾아 종아리 중간에서 발목까지 뒷발의 내측 쪽에 메스를 사용하여 1-2cm의 세로 절개를 부드럽게 만듭니다. 필요한 경우 근육층이 보일 때까지 마이크로 가위로 피부와 피하를 더 엽니다.
- 표재성 신경혈관 다발을 두세 개의 흰색과 더 두꺼운 보라색/빨간색 선으로 식별하며, 때로는 작은 가지가 있어 근육층 위로 자유롭게 이동할 수 있습니다. 전기 소작기( 재료 표 참조)를 사용하여 수술 부위의 활동성 출혈이나 진물을 응고시킵니다. 신경 혈관 다발이 손상되지 않도록주의하십시오.
- 비복근 근육 사이의 근막을 열기 위해 무뚝뚝하게 해부하여 3.2의 표재성 신경혈관 다발 바로 뒤쪽에 있습니다. 근육의 근막 사이에서 경골 신경이 발견 될 수 있습니다. 경골 신경은 신경 혈관 다발의 표재성 신경 크기의 약 3 배입니다. 경골을 추가 랜드마크로 사용하십시오(경골 신경은 경골 바로 뒤에 위치함).
- 경골 신경과 그 분기점을 확인하십시오.
참고: 분기점은 일반적으로 신경 위에 세로로 더 밝은 선으로 볼 수 있습니다. - 주변 혈관 다발에서 경골 신경을 조심스럽게 해부하십시오. 경골 신경을 무뚝뚝하게 움직이고 경골 신경을 움직이면서 약간의 스트레칭을 보이는 노출 된 조직을 절단하여 해부를 수행합니다.
참고: 해부 후 경골 신경이 교차 정맥에 부착되면 이 정맥을 응고시켜 경골 신경 전체를 노출시킬 수 있습니다. 경골 다발 자체가 응고되지 않도록 주의하십시오. - 경골 신경이 교차 근육층 아래에서 사라질 때까지 근위부로 노출시킵니다. 이 시점에서 경골 신경은 무릎을 향한 뒷발로 더 깊숙이 잠수하는 것처럼 보입니다. 경골 신경을 발목까지 말단에 노출시킵니다.
참고: 경골 신경이 더 말단으로 노출되면 교차하는 콜라겐 섬유(즉, 신경 섬유 방향에 수직인 섬유)의 양이 증가합니다. 이 콜라겐 섬유는 경골 신경을 전치하기에 충분한 길이를 허용하기 위해 절단해야 합니다.- 전체 경골 신경이 노출되면 신경의 탈수를 피하기 위해 근육층을 다시 배치하십시오. 신경이 탈수되고(즉, 더 뻣뻣하고 둔하고 주름이 생기는 경우) 근육층으로 덮는 것만으로는 충분하지 않은 경우 식염수 한 방울을 추가하여 수분을 공급하십시오.
- 무딘 미세 수술 도구, 바람직하게는 마이크로 바늘 홀더를 사용하여 피하 터널을 만들기 위해 피하 근육층에서 경골 전치 피부를 해부합니다. 이렇게하려면 피부를 위로 잡고 뭉툭한 팁을 피부와 평행 한 조직으로 밀어 넣으십시오. 터널의 끝이 신경종 검사를 위해 해당 부위에 쉽게 접근할 수 있도록 경골 전 또는 더 측면에 위치하는지 확인하십시오.
- 이소 플루 란을 5 %로 증가시킵니다. 경골 신경으로 돌아가 노출시킵니다(즉, 3.6단계에서 설명한 위치로 돌아가기). 발목 근처의 가장 말단 수준에서 경골 신경(즉, 두 발바닥 가지)을 자릅니다. 이소플루란을 2%-3%의 정상 수준으로 낮추십시오.
- 현미경 배율을 10x 또는 16x로 변경합니다. 3.8단계에서 절단된 근위부에 있는 경골 신경의 경골 신경을 확인하거나, 경골 신경의 근위 분기점의 경우 3.8단계에서 절단에 근접한 내측 및 외측 발바닥 가지 모두의 경막 신경을 식별합니다.
참고: 신경외염은 내부의 신경 섬유에 비해 더 하얗고 단단하며 더 노랗고 부드럽습니다. - 조심스럽게 8-0을 배치하십시오. 나일론 봉합사( 재료 표 참조)는 핀셋으로 신경외신경을 조심스럽게 잡고 약 0.5mm의 물린 상태로 신경과 외신경관 사이에 바늘을 넣어 근위 신경 말단의 상막신경을 통과합니다. 봉합사를 당겨 3.7단계에서 만든 피하 터널 끝에서 바늘로 피하 한 입 베어 물립니다. 매듭을 만들면 신경이 측면으로 피하 터널로 전치됩니다.
참고: 두 발바닥 가지가 공통 신경외신경을 공유하는 경우 하나의 봉합사로 충분합니다. 두 발바닥 가지에 자체 epineurium이있는 경우 각 epineurium은 개별적으로 고정되어야합니다. 봉합사를 피부에 넣지 마십시오. 피하로만 고정하십시오. - 어두운 색의 두꺼운 봉합사 (바람직하게는 파란색 또는 검은 색 4-0 봉합사)를 피부를 관통하지 않고 고정 된 신경 끝과 같은 높이로 놓습니다. 봉합사가 피부 바깥쪽에서 보이는지 확인하십시오. 발과 근육을 움직인 후 신경이 제자리에 있는지 확인하십시오. 봉합사 끝을 8-0보다 4-0에서 약간 더 긴 봉합사 끝으로 잘라냅니다 봉합 사.
- 현미경의 배율을 다시 6배로 변경합니다. 8-0을 사용하여 표피내 봉합사로 피부를 봉합합니다. 면봉을 사용하여 0.9% NaCl로 피부를 봉합하고 부드럽게 닦습니다.
4. 수술 후 치료
- 쥐를 종이 타월 아래 깨끗한 새장에 편안한 자세로 두십시오. 방이 차가우면 케이지의 일부 아래에 열 패드를 놓습니다 (필요할 때 동물이 열을 피할 수 있어야하므로 케이지의 일부 아래에만). 음식과 물에 쉽게 접근 할 수 있도록하십시오.
- 수술 후 쥐가 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 방치하지 마십시오. 쥐는 수술 후 마취에서 완전히 회복되었을 때 다른 동물의 회사로 돌아갈 수 있습니다. 이것은 일반적으로 1시간 후이며 쥐가 정상적인 보행 패턴과 행동을 보일 때입니다.
- 수술 후 24시간 및 48시간에 0.5mg/kg 카프로펜을 피하(복부)로 투여하여 수술 후 통증을 치료합니다.
5. 뒷발의 발바닥 쪽에 대한 Von Frey 테스트
참고: Von Frey 검사(5단계 및 6단계)는 수술 전(기준선 측정용)과 수술 후 3일부터 수행됩니다.
- 테스트 환경에 적응할 수 있도록 기준선 측정 1주 전 또는 수술 2주 전에 쥐를 메쉬 와이어 바닥 케이지에 넣습니다.
- 수술 최소 1주일 전에 기준선 측정으로 시작하십시오. 세 가지 독립적인 기준 측정이 별도의 날짜에 수행되는지 확인합니다.
- 쥐가 메쉬 유선 바닥 케이지에서 침착한지 확인하십시오. 뒷발의 발바닥 표면에 수직 인 로그 스케일을 가진 일련의 Von Frey 모노 필라멘트를 적용하십시오.
- 비복 신경 (과민증)을 자극하기 위해 모발 경계에 가까운 측면에 모노 필라멘트를 바르십시오. 발바닥은 더 민감하므로 만지지 마십시오.
- 경골 신경 (hyposensitivity)을 자극하려면 뒷발의 발바닥 표면 중앙에 모노 필라멘트를 바르십시오. 모노필라멘트가 가장 내측 영역에 적용되면 대퇴 신경의 한 가지인 복재 신경도 자극할 수 있습니다(그림 1). 발바닥을 만지지 마십시오.
- 4g 모노필라멘트로 시작합니다. 모노필라멘트에 충분한 힘을 가하여 머리카락이 구부러지도록 하고 3초 동안 유지한 다음 모노필라멘트에 대한 동물의 반응을 확인합니다. 긍정적인 반응은 갑작스러운 발 철수, 갑작스러운 움찔거림, 갑작스러운 발 핥기 또는 발성입니다. 어떤 경우에는 쥐가 움직여 모노필라멘트를 찾거나 공격하려고 합니다.
- 업-다운 방법23을 통한 자극에 대한 반응에 따라 다음 모노필라멘트를 선택합니다. 예를 들어, 쥐가 반응하면 2g 모노필라멘트로 다음을 자극하십시오. 쥐가 반응하지 않으면 6g 모노필라멘트로 자극하십시오. 반응에 따라 총 5-10 개의 자극을 가하십시오.
6. 신경종 부위의 Von Frey 검사
- 기준선 측정 전 최소 5-7일 또는 수술 전 2주 동안 동물을 매일 취급하십시오. 동물이 6.2 단계에 설명 된대로 동물이 자세에 익숙해 지도록하십시오.
- 코가 팔꿈치 주름을 향하도록 쥐를 잡습니다. 쥐가 오른손에 쥐고 있다면, 왼쪽 뒷발은 오른손 엄지 손가락과 집게 손가락 (첫 번째 웹 공간) 사이에 자유롭게 매달려 있어야합니다. 쥐가 왼손에 쥐고 있으면 오른쪽 뒷발이 왼쪽 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 자유롭게 매달려 있어야합니다.
- 수술 최소 1주일 전에 기준선 측정으로 시작하십시오. 세 가지 독립적인 기준 측정이 별도의 날짜에 수행되는지 확인합니다.
- 쥐가 안고 있는 동안 침착하고 편안한지 확인하십시오. 베이스라인에서 15g 모노필라멘트를 노출된 뒷발의 경골 표면에 부드럽게 놓습니다. 수술 후 15g 모노필라멘트를 눈에 보이는 봉합사(예: 신경종 위치)에 놓습니다. 모노필라멘트에 충분한 힘을 가하여 머리카락이 구부러지도록 하고 1초 동안 유지합니다.
- 각 자극에 대한 반응을 기록합니다. 반응 옵션에는 반응 없음, 느린 철수, 빠른 철수 및 발성이 포함됩니다. 응답을 반응 없음의 경우 0점, 느린 철수, 빠른 철수 또는 발성의 경우 1점으로 기록합니다.
- 모노필라멘트의 5개 도포에 대해 5개의 클러스터를 반복하며, 각 도포 사이에는 2-3초, 5개 클러스터 사이에는 2-3분 이상 걸립니다. 전체적으로 각 뒷발에는 기록된 반응과 함께 모노필라멘트를 25번 적용해야 합니다.
7. 조직학 및 준비를 위한 검체 회수
참고: 조직학적 검사는 초기 수술 후 12주에 수행됩니다.
- 마취를 유도하고 단계 2.2, 2.3 및 2.4에 설명된 대로 동물을 준비합니다.
- 초기 수술로 생긴 흉터 위에 메스를 사용하여 2-3cm의 절개를 부드럽게 하되 신경이 표면적으로 위치하므로 너무 깊게 자르지 않도록 주의하십시오.
- 신경종의 위치를 결정하고 주변 흉터 조직이 없는 신경종과 신경을 조심스럽게 해부하고 수확한 신경종을 고정액에 넣습니다. 신경종 형태를 평가하기 위해, 조직은 Tork et al.18에 의해 기술된 바와 같이 파라핀 또는 에폭시 수지에 세로로 포매되는 것이 바람직하다.
- 조직을 채취한 후 심장 천자 또는 참수를 통해 말단 마취(5% 이소플루란) 하에 쥐를 안락사시킵니다.
참고: 쥐를 죽이기 전에 먼저 신경종을 채취하는 것이 좋습니다., 그러면 생체 내에서 신경종을 주변 조직과 구별하는 것이 더 쉽기 때문입니다.
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Representative Results
신경종 부위에서의 평가는 15g von Frey 모노필라멘트의 적용에 대한 민감도가 증가한 것으로 나타났습니다. 기준선에서 쥐는 일반적으로 15g 모노필라멘트의 25회 적용 중 10%-15%(± 13%)에 반응했습니다. 반응률은 TNT 수술 1주일 후 45%-50%(± 24%)로 증가했습니다. 반대쪽 측면에서 수술 후 반응 수는 기준선에서의 반응 수와 유사했습니다(그림 2A). 쥐의 약 20 %는 고통스러운 신경종을 일으키지 않았습니다. 응답률은 기준선에 비해 증가하지 않았습니다(그림 2B). 이것은 신경종 형성 후 모든 환자 (절단 후 50 %)가 통증을 유발하지 않는 인간의 상황과 비슷합니다. 모든 쥐는 수술 후 12주 후에 절제되고 전치된 경골 신경 그루터기의 끝에서 신경종이 발생했습니다(그림 3). 이 신경종은 콜라겐 침착 내에서 소용돌이치는 축삭과 미세다발이 특징입니다.
경골 신경의 절개는 경골 신경에 의해 신경이 분포된 뒷발의 발바닥 쪽 중앙에서 기계적 민감도를 감소시켰습니다(그림 1). 과민증은 수술 후 1주일에 나타났고, 수술 후 3주부터 반대측 및 기준선과 유의하게 달랐으며, 수술 후 최소 12주까지 지속되었습니다(그림 4). 온전한 비골 신경에 의해 신경이 분포된 뒷발의 발바닥 측면 부분에서 쥐는 수술 후 1주일부터 반대쪽 및 기준선과 유의하게 다른 기계적 과민증이 발생했습니다(그림 4). 이 과민증은 수술 후 최소 12주 동안 지속되었습니다. 반대쪽 발에서 기계적 민감도는 비복 또는 경골 신경에 의해 신경이 분포된 영역에서 기준선과 비교하여 영향을 받지 않았습니다(그림 4).
그림 1: 뒷발의 발바닥 쪽의 신경 분포. 적색 = 비뇨 신경 분포 (외측); 보라색 = 경골 신경 분포 (중간); 녹색 = 복재 신경 분포(내측). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 신경종 부위의 Von Frey. 경골 신경을 절제하고 신경종 부위에 대한 기계적 민감도 과정을 각각 5개의 응용 프로그램으로 구성된 5개의 클러스터에 적용된 15g 모노필라멘트로 총 25개의 응용 프로그램으로 평가했습니다. 응답은 1점으로 채점됩니다. (A) 신경종 부위는 기준선과 반대쪽에 비해 수술 1주 후 유의하게 더 높은 반응을 보였다. N = 15; 오차 막대: 평균의 표준 오차(SEM); 다중 비교 및 Tukey 테스트를 통한 혼합 모델 분석. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001. (B) 동측 부위의 개별 값은 반응의 다양성을 보여줍니다. 3마리의 쥐(20%)는 상대적으로 높은 기준선 점수를 가졌고, 3마리의 쥐(20%)는 경골전 민감도에서 어떠한 변화도 나타내지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 신경종의 형태. 12주 된 신경종의 조직학적 이미지. (A) 헤마톡실린-에오신 염색, (B) Masson's trichrome 염색, 및 (C) 신경필라멘트 염색. 녹색 화살표 = 신경종에 바로 근접한 경골 신경. 주황색 화살표 = 축삭의 소용돌이와 다발의 확산으로 식별되는 신경종. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 발바닥 뒷발 (경골 및 비골 신경)의 Von Frey. 경골 신경을 절제하고 기계적 감도 과정을 뒷발의 발바닥 표면에서 Von Frey 테스트로 평가했습니다. 경골 신경에 의해 신경이 분포된 동측 수술 뒷발의 중간 부분은 저과민성을 보였다. 비복 신경에 의해 신경이 분포된 동측 수술 뒷발의 측면 부분은 과민증을 보였다. 발바닥 반대쪽 뒷발의 중간 및 측면 부분은 기준선에 비해 민감도에 변화가 없었습니다. N = 15; 오차 막대: 평균의 표준 오차(SEM); 다중 비교 및 Tukey 테스트를 통한 혼합 모델 분석. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜의 중요한 단계
TNT 모델은 경골 신경을 절단하고 측면 및 피하로 경골 전 위치로 전치하여 비복 신경에 대한 발바닥 통각과민 외에도 신경종의 민감도 테스트를 가능하게 합니다. TNT 모델에서는 신경종의 위치를 연구자가 볼 수 있어야합니다. 따라서 피하 봉합사가 피부를 통해 쉽게 보이고 봉합사의 색이 짙은 파란색 또는 검은 색이어야하기 때문에 알비노 쥐 균주가 바람직합니다.
수술이 진행되고 경골 신경이 노출되면 경골 신경의 분기점의 위치(예: 근위 또는 원위)에 변화가 있습니다. 쥐가 근위 분기점을 가지고 있는 경우, 하나의 경골 신경(그림 5B) 대신 발목 근위부에 있는 두 개의 신경(내측 및 외측 족저신경)을 찾을 수 있습니다(그림 5A). 비복 신경에 발바닥 통각과민을 유도하기 위해 두 가지를 모두 자르고 전치하는 것이 중요합니다. 하나의 족저 신경만 전치하도록 선택할 수 있습니다. 그러나 이 수준에서는 측족저신경과 내측 족저신경을 구분하기가 쉽지 않아 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 두 신경을 모두 조옮김하는 것이 좋습니다. 더욱이 일부 쥐는 경골 신경의 원위 분기점을 가질 수 있으며 하나의 발바닥 신경만 전치하는 것이 불가능할 수 있습니다.
그림 5: 경골 신경의 근위 및 원위 분기점. 경골 신경의 분기 수준 (*)의 해부학 적 변화. (A) 경골 신경의 근위 분기점; (B) 경골 신경의 원위 분기. 약어: MPN = 내측 족저신경, LPN = 외측 족저신경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Dorsi et al.17의 원본 논문에서 근위 경골 신경 말단 주위에 합자가 배치되고 이 합자 봉합사를 통해 신경이 전치되고 고정됩니다. 신경 주위의 합자가 수축 통증을 유발할 수 있기 때문에(24), 이 방법에서 설명하는 대안은 상복부 봉합사를 사용하여 신경을 고정하는 것이다. 경골 신경을 절단하여 전치하는 경우 신경을 피하로 고정하는 봉합사는 신경 다발 자체가 아닌 신경외막을 통해 삽입하는 것이 중요한데, 이는 통증 측정에도 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 또한 쥐가 눈에 보이는 봉합사를 갉아 먹는 경향이 있으므로 신경종의 변위와 통증 측정의 신뢰할 수없는 결과를 초래하므로 피부를 통해 봉합사를 배치하는 것을 피해야합니다.
피부가 닫힐 때 상처를 입을 수 있는 갉아먹는 것을 피하기 위해 표피내 봉합사를 사용하는 것도 중요합니다. 또한, 경골 신경을 전치한 후에는 피부 바로 아래의 더 표면적인 층에 위치하게 됩니다. 표면적으로 배치 된 신경과 함께 열린 상처는 바람직하지 않습니다.
Von Frey 측정은 신경종 부위의 신경종 통증을 테스트하고 뒷발의 측면 비뇨 신경에 대한 발바닥 통각과민을 테스트하기 위해 수행할 수 있습니다. 신경종 부위는 봉합사의 어두운 색으로 인해 수술 후 볼 수 있습니다. 비뇨 신경 과민증을 테스트하려면 Von Frey 모노필라멘트가 적용되는 한 위치를 선택해야 합니다. 이것은 측면 푸드 패드의 근위 또는 원위일 수 있지만 기준선 측정 및 수술 후 몇 주 동안의 측정 동안 거의 동일한 위치에 있어야 합니다.
메서드의 문제 해결
쥐가 기준선 측정 중에 이미 경골 전부에 가해진 모든 자극에 반응하는 경우, 쥐가 차분하고 편안한지, 테스트 영역에 적절하게 순응했는지 확인하십시오. 쥐가 자극에 덜 반응할 때까지 기준선 측정을 반복합니다. 또한 측정을 수행하는 동안 향수를 착용하지 않는 것이 좋습니다. 이상적으로, 쥐는 수술 전에 15g의 모노필라멘트를 적용 할 때 경골 전 자극에 반응하지 않습니다. 그러나 쥐가 침착하고 쥐의 50%-100%가 여전히 15g 모노필라멘트에 반응하는 경우 기준선 동안 반응률이 10%-20%인 모노필라멘트로 변경합니다. 그러나 모노필라멘트가 변경되면 먼저 TNT 쥐가 이 낮은 강도의 모노필라멘트에 반응하는지 테스트하기 위해 파일럿 실험을 수행하는 것이 좋습니다. TNT 모델의 초기 논문에서, 신경종 부위는 방풍 상자17의 바닥에 있는 개구부를 통해 모노필라멘트를 적용하여 측정되었습니다. 파일럿 실험에서 쥐는 케이지 바닥을 통해 적용될 때 각 자극에 반응하고 모노필라멘트를 공격하는 경향이 있는 것으로 나타났습니다. 연구원이 밀접하게 잡았을 때, 쥐는 평온한 상태에 있었고, 그 결과 기준선 측정 동안 모노필라멘트에 대한 반응률이 낮아졌습니다.
근위 경골 신경 말단이 피하 터널에서 충분히 멀리 도달 할 수없는 경우, 경골 신경의 근위 경로를 따라 신경 주변의 콜라겐 및 지방 조직을 제거하십시오. 신경을 주변에 고정시키는 작은 신경 가지나 혈관을 잘라냅니다. 이것은 신경이 더 측면으로 전치될 수 있는 더 넓은 범위의 운동을 제공할 것입니다. Dorsi et al.17의 원본 논문에서 신경은 더 측면으로 전치되었습니다. 파일럿 실험에서 측면 위치에 도달하는 것이 불가능한 것으로 나타났습니다. 따라서 이 방법은 신경종 부위의 경골 전 위치를 설명합니다.
방법의 한계
TNT 모델의 한계는 수술에 여러 (미세) 수술 단계를 따라야 한다는 것입니다. 또 다른 한계는 TNT 모델이 마우스로 쉽게 변환되지 않는다는 것입니다. 경험에 비추어 볼 때, 마우스는 0.008g 모노필라멘트를 적용하더라도 경골 부위에 가해지는 자극에 다소 민감한 경향이 있습니다.
기존/대체 방법에 대한 방법의 중요성
TNT 모델에서 신경종 통증은 비복 신경에 대한 발바닥 통각과민과 독립적으로 테스트할 수 있습니다. 후자는 SNI 모델과 같은 다른 신경병증성 통증 모델에서도 유도되지만, 여기서는 신경종 통증을 독립적으로 시험할 수 없다21. 또한, 경골 및 비골 신경 둘 다 SNI 모델에서 절단되어, 발의 내인성 근육이 마비되는 운동 기능의 더 많은 손실을 초래한다21. TNT 모델에서는 경골 신경만 원위 수준에서 절단되기 때문에 발의 고유 근육은 운동 기능의 무시할 수 있는 손실만 보여줍니다.
이 방법의 잠재적 응용
이전 연구는 TNT 모델이 신경종 치료를 위한 다양한 진통제, 신경 캡 또는 기타 수술 도구를 테스트하는 데 사용될 수 있음을 이미 보여주었습니다18,19,20. 그러나 통증에 관심이 있는 모든 연구 그룹은 동일한 동물에서 두 가지 다른 통증 양식을 테스트할 수 있기 때문에 TNT 모델을 사용하면 잠재적인 이점을 얻을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다. 이 연구 작업은 Axogen에서 부분적으로 자금을 지원했지만 회사는 연구 실행 및 결과에 영향을 미치지 않았습니다.
Acknowledgments
현미경과 수술실을 준비하고 동물을 돌보는 데 도움을 준 미세 수술을 도와준 Sabine Versteeg와 Common Animal Laboratory(Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium)의 Anja van der Sar와 Trudy Oosterveld-Romijn에게 감사드립니다.
이 연구는 Axogen의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
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