Summary
Dit protocol beschrijft het tibiale neuroomtranspositiemodel, dat een laesie van de tibiale zenuw inhoudt met daaropvolgende transpositie van het proximale zenuwuiteinde naar een subcutane pretibiale of laterale positie. Gedragstesten van neuroompijn en plantaire hyperalgesie worden gekwantificeerd met behulp van Von Frey monofilamenten.
Abstract
De tibiale neuroomtranspositie (TNT) is een rattenmodel waarbij allodynie op de plaats van het neuroom (tibiale zenuw) onafhankelijk kan worden geëvalueerd van allodynie aan het plantaire oppervlak van de achterpoot geïnnerveerd door de intacte surale zenuw. Dit TNT-model is geschikt om therapieën voor neuroompijn te testen, zoals de potentiële superioriteit van bepaalde chirurgische therapieën die al in de kliniek worden gebruikt, of om nieuwe geneesmiddelen en hun effect op beide pijnmodaliteiten bij hetzelfde dier te evalueren. In dit model wordt een distale laesie (neurotmesis) gemaakt in de tibiale zenuw en wordt het proximale zenuwuiteinde getransponeerd en subcutaan en pretibiaal gefixeerd om beoordelingen van de neuroomplaats met een 15 g Von Frey-monofilament mogelijk te maken. Om allodynie over de surale zenuw te beoordelen, kunnen Von Frey monofilamenten worden gebruikt via de up-down methode op het plantaire laterale gebied van de achterpoot. Na het doorsnijden van de tibiale zenuw ontwikkelt zich mechanische overgevoeligheid op de neuroomplaats binnen 1 week na de operatie en blijft ten minste tot 12 weken na de operatie bestaan. Allodynie aan het surale geïnnerveerde plantaire oppervlak ontwikkelt zich binnen 3 weken na de operatie in vergelijking met de contralaterale ledemaat. Na 12 weken vormt zich een neuroom aan het proximale uiteinde van de doorgesneden tibiale zenuw, aangegeven door dispersie en werveling van axonen. Voor de TNT-modelchirurgie moeten meerdere kritische (micro)chirurgische stappen worden gevolgd en wordt enige chirurgische praktijk onder terminale anesthesie geadviseerd. In vergelijking met andere neuropathische pijnmodellen, zoals het gespaard zenuwbeschadigingsmodel, kan allodynie over de neuroomplaats onafhankelijk worden getest van surale zenuwovergevoeligheid in het TNT-model. De neuroomsite kan echter alleen bij ratten worden getest, niet bij muizen. De tips en aanwijzingen in dit protocol kunnen onderzoeksgroepen die werken aan pijn helpen om het TNT-model met succes in hun faciliteit te implementeren.
Introduction
Elke wond, variërend van eenvoudige scheuren tot amputatie van de hele ledematen, gaat gepaard met verschillende gradaties van perifeer zenuwletsel. Dergelijk zenuwletsel kan resulteren in de vorming van een neuroom, een ongeorganiseerde verstrengeling van ontkiemende zenuwvezels. Neuromen worden pijnlijk bij 8%-30% van de patiënten, wat een ernstige invloed heeft op hun kwaliteit van leven 1,2,3,4,5. Na amputatie van de ledematen ontwikkelt neuroompijn zich bij 50% van de patiënten 6,7,8. Gemelde symptomen zijn gevoeligheid, spontane pijn, allodynie, hyperalgesie en mechanische of thermische overgevoeligheid in het geïnnerveerde gebied9. Wanneer neuroompijn niet binnen 1 jaar adequaat wordt behandeld, kan het zich ontwikkelen tot een chronische pijntoestand, wat resulteert in een hoge maatschappelijke last en bijbehorende medische kosten 10,11,12,13,14. Vanwege de slechte werkzaamheid van de huidige farmacologische interventies wordt neuroompijn bij voorkeur behandeld door chirurgische verwijdering van het pijnlijke neuroom en de zenuw behandeld met verschillende chirurgische technieken, zoals beschreven in de literatuur15. Het is belangrijk op te merken dat volledige pijnverlichting zeldzaam is, pijn vaak in de loop van de tijd verergert en 40% van de patiënten geen baat heeft bij de operatie, wat aangeeft dat nieuwe behandelingen nodig zijn 1,16.
Een gestandaardiseerd rattenmodel van neuroompijn helpt bij het begrijpen van de mechanismen die neuroompijn veroorzaken en kan helpen bij het identificeren van nieuwe behandelingen of het evalueren van bestaande behandelingen die in de kliniek worden gebruikt. Het tibiale neuroomtranspositie (TNT) model werd voor het eerst beschreven door Dorsi et al. in 200817 en is gebruikt door verschillende onderzoeksgroepen18,19,20. Het algemene doel van deze methode is om verschillende behandeltechnieken voor neuroompijn te kunnen testen. Het voordeel van het model ten opzichte van bijvoorbeeld het gespaard zenuwletsel (SNI) model21, is dat het het mogelijk maakt om allodynie op de neuroomplaats te testen. Dit komt omdat het model gaat om het transponeren van het proximale zenuwuiteinde van de tibiale zenuw naar een onderhuidse preibiale positie, waar het kan worden onderzocht met von Frey monofilamenten. Bovendien ontwikkelt allodynie zich aan het plantaire oppervlak van de achterpoot geïnnerveerd door de intacte surale zenuw, die onafhankelijk van de neuroompijn bij hetzelfde dier kan worden beoordeeld. Dit is vergelijkbaar met symptomen van neuroompijn bij patiënten, waarbij aanhoudende neuropathische pijn na verwijdering van een pijnlijk neuroom soms wordt veroorzaakt door de naburige zenuwen22. Bovendien is allodynie over een doorgesneden zenuw met een neuroom een andere pijnmodaliteit dan allodynie over de intacte naburige zenuw. Dit model vergemakkelijkt dus de beoordeling van het effect van nieuwe therapieën op zowel allodynie aanwezig op de neuroomplaats als meer wijdverspreide neuropathische pijn getest in het plantaire oppervlak van de achterpoot. Omdat de operatie die wordt uitgevoerd om het TNT-model te maken een uitdaging kan zijn, gaat dit artikel dieper in op de procedure om onderzoekers te ondersteunen bij het implementeren van het model in hun faciliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit onderzoek is uitgevoerd conform de IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) en de richtlijnen voor dieronderzoek, projectnummer AVD1150020198824.
1. Von Frey nulmetingen
- Voer voorafgaand aan de operatie nulmetingen uit volgens de Von Frey-testprocedure, hieronder beschreven in sectie 5 en sectie 6.
2. Anesthesie en voorbereiding
OPMERKING: Deze studie werd uitgevoerd op 15 mannelijke Sprague Dawley-ratten die 12 weken oud waren.
- Verdoof de dieren door inductie met 5% isofluraan en onderhoud anesthesie met 2% -3% isofluraan.
OPMERKING: Onderhoud met 2% isofluraan resulteert meestal in voldoende anesthesie en spontane ademhaling, zonder de noodzaak van tracheale intubatie of mechanische beademing. - Controleer de reflexen van de dieren door met een pincet in de voet te knijpen. Zorg ervoor dat het dier niet reageert voordat u verder gaat. Scheer het operatieveld van knie tot enkel met een elektrisch scheerapparaat en breng oogheelkundige zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Injecteer 0,5 mg/kg analgetische carprofen subcutaan in de buikstreek.
- Plaats de verdoofde rat op zijn rug met zijn kop naar links of rechts en het te opereren been in de buurt van de chirurg. Exoroteer de onderste achterpoot zodat de mediale malleolus naar boven is gericht. Plaats de rat onder een stereo chirurgische microscoop met 6x vergroting.
- Desinfecteer het geschoren gebied met drie afwisselende rondes scrub op basis van jodium, gevolgd door alcohol. Plaats een steriel vel met een operatiegat over het been, zodat alleen het operatieveld zichtbaar is. Zorg ervoor dat u deze steriele omstandigheden tijdens de operatie handhaaft.
3. Operatie
- Plaats een klein wattenstaafje onder de enkel om het operatieveld horizontaal te houden. Lokaliseer de knie en maak voorzichtig een longitudinale incisie van 1-2 cm met behulp van een scalpel over de mediale kant van de achterpoot van halverwege de kuit tot de enkel. Open indien nodig de huid en subcutis verder met een microschaar totdat de spierlagen zichtbaar zijn.
- Identificeer de oppervlakkige neurovasculaire bundel als twee of drie witte en een dikkere paars/rode lijn, soms met kleine takken, die vrij over de spierlagen kunnen bewegen. Met behulp van een elektrocauterie (zie tabel met materialen) stolt u actieve bloedingen of sijpelingen in het operatieveld. Pas op dat u de neurovasculaire bundel niet beschadigt.
- Botweg ontleden om de fascia tussen de gastrocnemiusspieren te openen, net na de oppervlakkige neurovasculaire bundel van 3,2. Tussen de fascia van de spieren bevindt zich de tibiale zenuw. De tibiale zenuw is ongeveer drie keer zo groot als de oppervlakkige zenuw in de neurovasculaire bundel. Gebruik het tibiale bot als een extra oriëntatiepunt (de tibiale zenuw ligt net achter het tibiale bot).
- Identificeer de tibiale zenuw en de bifurcatie ervan.
OPMERKING: De bifurcatie is meestal zichtbaar met een lichtere lijn in de lengterichting over de zenuw. - Ontleed voorzichtig de tibiale zenuw die vrij is van de omliggende vaatbundels. Voer de dissectie uit door de tibiale zenuw stomp te bewegen en het blootgestelde weefsel te snijden dat enige rek vertoont tijdens het bewegen van de tibiale zenuw.
OPMERKING: Als de tibiale zenuw na dissectie is bevestigd aan kruisende aderen, kunnen deze aderen worden gecoaguleerd om de hele tibiale zenuw bloot te leggen. Pas op dat u de tibiale bundel zelf niet stolt. - Stel de tibiale zenuw proximaal bloot totdat deze onder een kruisende spierlaag verdwijnt. Op dit punt lijkt de tibiale zenuw dieper in de achterpoot naar de knie te duiken. Stel de tibiale zenuw distaal bloot tot aan de enkel.
OPMERKING: Wanneer de tibiale zenuw meer distaal wordt blootgesteld, zal de hoeveelheid kruisende collageenvezels (d.w.z. vezels loodrecht op de richting van de zenuwvezels) toenemen. Deze collageenvezels moeten worden gesneden om voldoende lengte mogelijk te maken voor het transponeren van de tibiale zenuw.- Wanneer de hele tibiale zenuw wordt blootgesteld, plaatst u de spierlagen terug om uitdroging van de zenuw te voorkomen. Als de zenuw uitdroogt (d.w.z. het wordt stijver, doffer en rimpeliger) en bedekken met spierlagen niet voldoende is, voeg dan druppels zoutoplossing toe om het te hydrateren.
- Met behulp van een stomp microchirurgisch hulpmiddel, bij voorkeur een micronaaldhouder, ontleed je de pretibiale huid uit de onderhuidse spierlaag om een onderhuidse tunnel te maken. Om dit te doen, houdt u de huid omhoog en duwt u de stompe punt in het weefsel, parallel aan de huid. Zorg ervoor dat het uiteinde van de tunnel zich pretibiaal of meer zijdelings bevindt om ervoor te zorgen dat het gebied gemakkelijk toegankelijk is voor het testen van het neuroom.
- Verhoog de isofluraan tot 5%. Keer terug naar de tibiale zenuw en stel deze bloot (d.w.z. ga terug naar de plaats die wordt beschreven in stap 3.6). Snijd de tibiale zenuw (d.w.z. beide plantaire takken) op het meest distale niveau in de buurt van de enkel. Verlaag de isofluraan tot het normale niveau van 2% -3%.
- Verander de microscoopvergroting naar 10x of 16x. Identificeer het epineurium van de tibiale zenuw proximaal aan de snede gemaakt in stap 3.8, of in het geval van een meer proximale bifurcatie van de tibiale zenuw, identificeer het epineurium van zowel de mediale als laterale plantaire takken proximaal aan de snede in stap 3.8.
OPMERKING: Het epineurium is witter en steviger in vergelijking met de zenuwvezels binnenin, die meer geel en zacht zijn. - Plaats voorzichtig een 8-0 nylon hechting (zie tabel van materialen) door het epineurium van het proximale zenuwuiteinde door het epineurium voorzichtig vast te houden met een pincet en de naald tussen de zenuw en het epineurium te plaatsen met een beet van ongeveer 0,5 mm. Trek de hechting erdoor en neem een beet met de naald subcutaan aan het einde van de onderhuidse tunnel gemaakt in stap 3.7. Maak een knoop, die de zenuw lateraal in de onderhuidse tunnel zal transponeren.
OPMERKING: Als beide plantaire takken een gemeenschappelijk epineurium delen, zou één hechtdraad voldoende moeten zijn. Als beide plantaire takken hun eigen epineurium hebben, moet elk epineurium afzonderlijk worden gefixeerd. Vermijd het plaatsen van de hechting door de huid; repareer het alleen subcutaan. - Plaats een dikkere hechting met een donkere kleur (bij voorkeur een blauwe of zwarte 4-0 hechting) vlak op het gefixeerde zenuwuiteinde, niet doordringend in de huid. Zorg ervoor dat de hechting zichtbaar is vanaf de buitenkant van de huid. Controleer of de zenuw op zijn plaats blijft na het bewegen van de poot en spieren. Snijd de hechtingseinden af met een iets langer hechtingseind op de 4-0 dan op de 8-0 hechting.
- Verander de vergroting van de microscoop terug naar 6x. Sluit de huid met intra-epidermale hechtingen met behulp van de 8-0 hecht en reinig de huid voorzichtig met 0,9% NaCl met een wattenstaafje.
4. Postoperatieve behandeling
- Plaats de rat in een schone kooi onder een papieren handdoek in een comfortabele positie. Als de kamer koud is, plaats dan een warmtekussen onder een deel van de kooi (alleen onder een deel van de kooi, omdat het dier indien nodig aan de hitte moet kunnen ontsnappen). Zorg voor gemakkelijke toegang tot voedsel en water.
- Laat de postoperatieve rat niet onbeheerd achter totdat deze weer voldoende bij bewustzijn is gekomen om de sternale lighouding te behouden. De rat kan worden teruggebracht naar het gezelschap van andere dieren wanneer deze volledig is hersteld van de anesthesie na de operatie. Dit is meestal na 1 uur en wanneer de rat zijn normale looppatroon en gedrag vertoont.
- Dien 24 uur en 48 uur na de operatie een dosis van 0,5 mg/kg carprofen subcutaan toe (abdominale regio) om postoperatieve pijn te behandelen.
5. Von Frey testen van de plantaire zijde van de achterpoten
OPMERKING: Von Frey-testen (stap 5 en 6) worden uitgevoerd voorafgaand aan de operatie (voor nulmeting) en vanaf 3 dagen na de operatie.
- Plaats de ratten 1 week voor de nulmeting of 2 weken voor de operatie in kooien met gaasdraadbodem om te zorgen voor acclimatisatie aan de testomgeving.
- Begin met basislijnmetingen ten minste 1 week voor de operatie. Zorg ervoor dat drie onafhankelijke nulmetingen op verschillende dagen worden uitgevoerd.
- Controleer of de ratten rustig zijn in de met gaas bekabelde bodemkooien. Breng een reeks Von Frey-monofilamenten aan met een logaritmische schaal loodrecht op het plantaire oppervlak van de achterpoot.
- Om de nervus sural (overgevoeligheid) te stimuleren, breng je het monofilament aan de zijkant dicht bij de haarrand aan. Raak de voetzolen niet aan, omdat deze gevoeliger zijn.
- Om de tibiale zenuw (hyposensitiviteit) te stimuleren, brengt u het monofilament aan in het midden van het plantaire oppervlak van de achterpoot. Als het monofilament in het meest mediale gebied wordt aangebracht, kan dit ook de nervus saphenous stimuleren, een tak van de heupzenuw (figuur 1). Raak de voetzolen niet aan.
- Begin met het 4 g monofilament. Oefen voldoende kracht uit op het monofilament zodat het haar buigt en 3 s vasthoudt en controleer vervolgens de reacties van het dier op het monofilament. Een positieve reactie is plotselinge terugtrekking van de poot, plotselinge terugtrekking, plotseling likken van de poot of vocalisatie. In sommige gevallen beweegt de rat en probeert het monofilament te vinden/aanvallen.
- Kies het volgende monofilament afhankelijk van de reactie op de stimulus via de up-down methode23. Als de rat bijvoorbeeld reageert, stimuleer dan vervolgens met het monofilament van 2 g; Als de rat niet reageert, stimuleer dan met het 6 g monofilament, enzovoort. Breng in totaal 5-10 stimuli aan, afhankelijk van de reactie.
6. Von Frey testen van de neuroomsite
- Behandel de dieren dagelijks gedurende minimaal 5-7 dagen vóór de basislijnmetingen of 2 weken voor de operatie. Zorg ervoor dat de dieren worden vastgehouden zoals beschreven in stap 6.2, zodat ze zich comfortabel voelen met de positie.
- Houd de ratten vast met hun neus naar de elleboogplooi gericht. Als de rat in de rechterhand wordt gehouden, moet zijn linkerachterpoot vrij tussen de rechterduim en wijsvinger (eerste webruimte) hangen. Als de rat in de linkerhand wordt gehouden, moet zijn rechterachterpoot vrij tussen de linkerduim en wijsvinger hangen.
- Begin met basislijnmetingen ten minste 1 week voor de operatie. Zorg ervoor dat drie onafhankelijke nulmetingen op verschillende dagen worden uitgevoerd.
- Controleer of de ratten kalm en comfortabel zijn terwijl ze worden vastgehouden. Plaats bij baseline het monofilament van 15 g voorzichtig op het pretibiale oppervlak van de blootgestelde achterpoot. Plaats na de operatie het monofilament van 15 g op de zichtbare hechtdraad (bijvoorbeeld op de locatie van het neuroom). Oefen voldoende kracht uit op het monofilament zodat het haar buigt en houd het 1 s vast.
- Noteer de reactie op elke stimulus. De reactieopties omvatten geen reactie, langzame terugtrekking, snelle terugtrekking en vocalisatie. Noteer de reactie als 0 punten voor geen reactie en één punt voor langzame terugtrekking, snelle terugtrekking of vocalisatie.
- Herhaal vijf clusters van vijf toepassingen van het monofilament, met 2-3 s tussen elke toepassing en 2-3 minuten of meer tussen de vijf clusters. In totaal moet elke achterpoot 25 toepassingen van het monofilament hebben met geregistreerde reacties.
7. Specimenherstel voor histologie en voorbereiding
OPMERKING: Histologisch onderzoek wordt 12 weken na de eerste operatie uitgevoerd.
- Induceer anesthesie en bereid de dieren voor zoals beschreven in stap 2.2, 2.3 en 2.4.
- Maak voorzichtig een incisie van 2-3 cm met behulp van een scalpel over het litteken dat is gemaakt door de eerste operatie, maar pas op dat u niet te diep snijdt omdat de zenuw oppervlakkig is geplaatst.
- Bepaal de positie van het neuroom, ontleed zorgvuldig het neuroom en de zenuw vrij van het omliggende littekenweefsel en plaats het geoogste neuroom in fixatief. Om de morfologie van neuromen te evalueren, is het weefsel bij voorkeur longitudinaal ingebed in paraffine of epoxyhars zoals beschreven door Tork et al.18.
- Na het oogsten van het weefsel, euthanaseer de ratten onder terminale anesthesie (5% isofluraan) via hartpunctie of onthoofding.
OPMERKING: Het wordt geadviseerd om eerst het neuroom te oogsten voordat de ratten worden gedood, omdat het dan gemakkelijker is om het neuroom in vivo van het omliggende weefsel te onderscheiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beoordeling op de plaats neuroom toonde een verhoogde gevoeligheid voor de toepassing van het 15 g von Frey monofilament. Bij baseline reageerden ratten doorgaans op 10%-15% (± 13%) van de 25 toepassingen van een monofilament van 15 g. Het responspercentage steeg tot 45%-50% (± 24%) 1 week na de TNT-operatie. Aan de contralaterale zijde was het aantal responsen na de operatie vergelijkbaar met dat bij baseline (figuur 2A). Ongeveer 20% van de ratten ontwikkelde geen pijnlijk neuroom; het responspercentage nam niet toe ten opzichte van de uitgangswaarde (figuur 2B). Dit is vergelijkbaar met de menselijke situatie, waar niet alle patiënten (50% na amputatie) pijn ontwikkelen na de vorming van een neuroom. Alle ratten ontwikkelden 12 weken na de operatie een neuroom aan het einde van de getransecteerde en getransponeerde tibiale zenuwstomp (figuur 3). Dit neuroom werd gekenmerkt door wervelende axonen en microfascicles binnen collageenafzettingen.
Transsectie van de tibiale zenuw verminderde de mechanische gevoeligheid in het midden van de plantaire zijde van de achterpoot, geïnnerveerd door de tibiale zenuw (figuur 1). De hyposensitiviteit was aanwezig 1 week na de operatie, verschilde significant van de contralaterale zijde en baseline vanaf 3 weken na de operatie en bleef tot ten minste 12 weken na de operatie (figuur 4). Aan het laterale deel van de plantaire zijde van de achterpoot, geïnnerveerd door de intacte surale zenuw, ontwikkelden de ratten mechanische overgevoeligheid die significant verschilde van de contralaterale kant en baseline vanaf 1 week na de operatie (figuur 4). Deze overgevoeligheid hield aan tot ten minste 12 weken na de operatie. Bij de contralaterale poot werd de mechanische gevoeligheid niet beïnvloed in vergelijking met de uitgangswaarde in de gebieden die ofwel geïnnerveerd werden door de surale of tibiale zenuw (figuur 4).
Figuur 1: Zenuwverdeling aan de plantaire zijde van de achterpoot. Rood = surale zenuwverdeling (lateraal); paars = tibiale zenuwverdeling (midden); groen = sapheneuze zenuwverdeling (mediaal). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Von Frey van de neuroomplaats. De tibiale zenuw werd getransecteerd en het verloop van de mechanische gevoeligheid over de neuroomplaats werd beoordeeld met een monofilament van 15 g toegepast in vijf clusters van elk vijf toepassingen, met in totaal 25 toepassingen. Een reactie wordt gescoord als één punt. (A) De neuroomplaats vertoonde 1 week na de operatie een significant hogere respons in vergelijking met baseline en de contralaterale zijde. N = 15; foutbalken: standaardfout van het gemiddelde (SEM); gemengde modelanalyse met meerdere vergelijkingen en Tukey-test. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. (B) Individuele waarden van de ipsilaterale site vertonen diversiteit in reactie. Drie ratten (20%) hadden een relatief hoge baseline score en drie ratten (20%) vertoonden geen veranderingen in pretibiale gevoeligheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Morfologie van het neuroom. Histologische beelden van een 12 weken oud neuroom. (A) Hematoxyline-Eosine kleuring, (B) Masson's trichrome kleuring, en (C) Neurofilament kleuring. Groene pijl = tibiale zenuw net proximaal van het neuroom. Oranje pijl = neuroom, geïdentificeerd door werveling van axonen en diffusie van de fascikels. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Von Frey van de plantaire achterpoot (tibiale en surale zenuw). De tibiale zenuw werd doorgesneden en het verloop van de mechanische gevoeligheid werd beoordeeld door Von Frey-testen aan het plantaire oppervlak van de achterpoot. Het middelste deel van de ipsilateraal geopereerde achterpoot geïnnerveerd door de tibiale zenuw vertoonde hyposensitiviteit. Het laterale deel van de ipsilateraal geopereerde achterpoot geïnnerveerd door de nervus sural vertoonde overgevoeligheid. De middelste en laterale delen van de plantaire contralaterale achterpoot vertoonden geen veranderingen in gevoeligheid in vergelijking met de uitgangswaarde. N = 15; foutbalken: standaardfout van het gemiddelde (SEM); gemengde modelanalyse met meerdere vergelijkingen en Tukey-test. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritieke stappen in het protocol
Het TNT-model omvat het doorsnijden van de tibiale zenuw en het lateraal en subcutaan transponeren naar een pretibiale locatie om gevoeligheidstests van het neuroom mogelijk te maken, naast plantaire hyperalgesie over de surale zenuw. In het TNT-model is het belangrijk dat de plaats van het neuroom zichtbaar is voor de onderzoekers. Daarom heeft een albino-rattenstam de voorkeur omdat onderhuidse hechtingen gemakkelijk zichtbaar zijn door de huid en de kleur van de hechting bij voorkeur donkerblauw of zwart moet zijn.
Wanneer de operatie wordt uitgevoerd en de tibiale zenuw wordt blootgesteld, is er variatie in de plaats (bijvoorbeeld proximaal of distaal) van de bifurcatie van de tibiale zenuw. Als ratten een proximale bifurcatie hebben, is het mogelijk dat twee zenuwen (de mediale en laterale plantaire zenuw) proximaal aan de enkel kunnen worden gevonden (figuur 5A), in plaats van slechts één tibiale zenuw (figuur 5B). Het is belangrijk dat beide takken worden gesneden en getransponeerd om plantaire hyperalgesie over de surale zenuw te induceren. Men zou ervoor kunnen kiezen om slechts één plantaire zenuw te transponeren; Een onderscheid tussen de laterale en mediale plantaire zenuw is echter niet gemakkelijk te maken op dit niveau en kan de resultaten beïnvloeden. Daarom wordt geadviseerd om beide zenuwen te transponeren. Bovendien kunnen sommige ratten een meer distale bifurcatie van de tibiale zenuw hebben en kan het transponeren van slechts één plantaire zenuw onmogelijk zijn.
Figuur 5: Proximale en distale bifurcatie van de tibiale zenuw. Anatomische variatie in het niveau van bifurcatie (*) van de tibiale zenuw. (A) Proximale bifurcatie van de tibiale zenuw; (B) distale bifurcatie van de tibiale zenuw. Afkortingen: MPN = mediale plantaire zenuw, LPN = laterale plantaire zenuw. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In het oorspronkelijke artikel van Dorsi et al.17 wordt een ligatuur rond het proximale tibiale zenuwuiteinde geplaatst en wordt de zenuw getransponeerd en gefixeerd via deze ligatuurhechting. Omdat de ligatuur rond de zenuw vernauwingspijn kan veroorzaken24, is een alternatief dat in deze methode wordt beschreven, het fixeren van de zenuw met behulp van epineurinale hechtingen. Als de tibiale zenuw wordt doorgesneden en getransponeerd, is het belangrijk dat de hechtdraad om de zenuw subcutaan te fixeren door het epineurium wordt geplaatst en niet door de zenuw zelf, omdat dit ook pijnmaatregelen kan beïnvloeden. Bovendien moet men voorkomen dat de hechting door de huid wordt geplaatst, omdat ratten de neiging hebben om zichtbare hechtingen te knagen, wat resulteert in verplaatsing van het neuroom en dus niet-betrouwbare uitkomsten van pijnmaatregelen.
Wanneer de huid gesloten is, is het ook belangrijk om intra-epidermale hechtingen te gebruiken om knagen te voorkomen die zullen resulteren in een open wond. Bovendien zal deze zich na transponering van de tibiale zenuw in een meer oppervlakkige laag net onder de huid bevinden. Een open wond in combinatie met een oppervlakkig geplaatste zenuw is ongewenst.
Von Frey-metingen kunnen worden uitgevoerd om neuroompijn op de neuroomplaats te testen en om plantaire hyperalgesie te testen over de surale zenuw, aan de laterale kant van de achterpoot. De plaats van het neuroom is zichtbaar na de operatie vanwege de donkere kleur van de hechting. Voor het testen van de overgevoeligheid van de surale zenuw moet één locatie worden gekozen waar het Von Frey-monofilament wordt aangebracht. Dit kan proximaal of distaal zijn van het laterale voedselkussen, maar moet ongeveer dezelfde plaats zijn tijdens basislijnmetingen en metingen in de weken na de operatie.
Probleemoplossing van de methode
Als de ratten reageren op alle stimuli die al tijdens de basislijnmetingen op het pretibiale gebied zijn aangebracht, zorg er dan voor dat ze kalm en ontspannen zijn en dat ze goed zijn geacclimatiseerd aan het testgebied. Herhaal de nulmeting totdat de ratten minder reageren op de prikkels. Daarnaast heeft het de voorkeur om geen parfum te dragen tijdens het uitvoeren van metingen. Idealiter reageren ratten niet op de pretibiale stimulus wanneer een monofilament van 15 g vóór de operatie wordt aangebracht. Als de ratten echter kalm zijn en 50% -100% van de ratten nog steeds reageert op het monofilament van 15 g, verander het dan in een monofilament met een responspercentage van 10% -20% tijdens de baseline. Als het monofilament echter wordt vervangen, wordt geadviseerd om eerst een proefexperiment uit te voeren om te testen of de TNT-ratten reageren op deze lagere sterkte van monofilament. In het eerste artikel van het TNT-model werd de neuroomplaats gemeten door het monofilament aan te brengen via een opening aan de onderkant van een perspex doos17. In proefexperimenten bleken ratten op elke stimulus te reageren wanneer ze via de bodem van de kooi werden toegepast en hadden ze de neiging om het monofilament aan te vallen. Wanneer ze door de onderzoeker van dichtbij werden vastgehouden, waren de ratten in een kalme toestand, wat resulteerde in een lagere respons op het monofilament tijdens de basislijnmeting.
Als het proximale tibiale zenuwuiteinde niet ver genoeg kan reiken in de onderhuidse tunnel, volg dan de loop van de tibiale zenuw meer proximaal en verwijder collageen en vetweefsel rond de zenuw. Knip kleine zenuwtakken of bloedvaten af die de zenuw aan de omgeving houden. Dit geeft de zenuw een breder bewegingsbereik om meer lateraal te worden getransponeerd. Merk op dat in het oorspronkelijke artikel van Dorsi et al.17 de zenuw meer lateraal werd getransponeerd. In pilotexperimenten bleek het onmogelijk om de laterale positie te bereiken. Daarom beschrijft deze methode een pretibiale positie van de neuroomplaats.
Beperkingen van de methode
Een beperking van het TNT-model is dat de operatie meerdere (micro)chirurgische stappen omvat die moeten worden gevolgd. Een andere beperking is dat het TNT-model niet gemakkelijk te vertalen is naar muizen. Uit ervaring zijn muizen nogal gevoelig voor stimuli die op een pretibiaal gebied worden aangebracht, zelfs met de toepassing van een monofilament van 0,008 g.
Betekenis van de methode ten opzichte van bestaande/alternatieve methoden
In het TNT-model kan neuroompijn onafhankelijk van plantaire hyperalgesie over de surale zenuw worden getest. Dit laatste wordt ook geïnduceerd in andere neuropathische pijnmodellen zoals het SNI-model, maar hier kan neuroompijn niet onafhankelijk worden getest21. Bovendien worden zowel de tibiale als de peroneale zenuw in het SNI-model doorgesneden, wat resulteert in meer verlies van motorische functie, wat resulteert in verlamde intrinsieke spieren van de poot21. Omdat in het TNT-model alleen de tibiale zenuw op distale niveau wordt doorgesneden, vertonen de intrinsieke spieren van de voeten slechts een verwaarloosbaar verlies van motorische functie.
Mogelijke toepassingen van de methode
Eerder onderzoek heeft al aangetoond dat het TNT-model kan worden gebruikt om verschillende pijnmedicatie, zenuwkappen of andere chirurgische hulpmiddelen voor neuroombehandeling te testen18,19,20. Alle onderzoeksgroepen die geïnteresseerd zijn in pijn kunnen echter potentieel voordeel hebben van het gebruik van het TNT-model, omdat twee verschillende pijnmodaliteiten in hetzelfde dier kunnen worden getest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs geven aan geen belangenverstrengeling te hebben. Hoewel dit onderzoek deels door Axogen werd gefinancierd, had het bedrijf geen invloed op de uitvoering van het onderzoek en op de resultaten.
Acknowledgments
We willen Sabine Versteeg bedanken voor het assisteren bij de microchirurgie en Anja van der Sar en Trudy Oosterveld-Romijn van het Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium voor hun hulp bij het klaarmaken van de microscoop en operatiekamer en het verzorgen van de dieren.
Dit onderzoek werd gefinancierd door Axogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
- Stokvis, A., vander Avoort, D. J., van Neck, J. W., Hovius, S. E., Coert, J. H. Surgical management of neuroma pain: a prospective follow-up study. Pain. 151 (3), 862-869 (2010).
- Domeshek, L. F., et al. Surgical treatment of neuromas improves patient-reported pain, depression, and quality of life. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (2), 407-418 (2017).
- Lame, I. E., Peters, M. L., Vlaeyen, J. W., Kleef, M., Patijn, J. Quality of life in chronic pain is more associated with beliefs about pain, than with pain intensity. European Journal of Pain. 9 (1), 15-24 (2005).
- Koch, H., Haas, F., Hubmer, M., Rappl, T., Scharnagl, E. Treatment of painful neuroma by resection and nerve stump transplantation into a vein. Annals of Plastic Surgery. 51 (1), 45-50 (2003).
- Fisher, G. T., Boswick, J. A. Neuroma formation following digital amputations. Journal of Trauma. 23 (2), 136-142 (1983).
- Bowen, J. B., Ruter, D., Wee, C., West, J., Valerio, I. L. Targeted muscle reinnervation technique in below-knee amputation. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (1), 309-312 (2019).
- Jensen, T. S., Krebs, B., Nielsen, J., Rasmussen, P. Phantom limb, phantom pain and stump pain in amputees during the first 6 months following limb amputation. Pain. 17 (3), 243-256 (1983).
- Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 4 (12), 1038 (2016).
- Arnold, D. M. J., et al. Diagnostic criteria for symptomatic neuroma. Annals of Plastic Surgery. 82 (4), 420-427 (2019).
- Liedgens, H., Obradovic, M., De Courcy, J., Holbrook, T., Jakubanis, R. A burden of illness study for neuropathic pain in Europe. Clinicoeconomics and Outcomes Research. 8, 113-126 (2016).
- Langley, P. C., Van Litsenburg, C., Cappelleri, J. C., Carroll, D. The burden associated with neuropathic pain in Western Europe. Journal of Medical Economics. 16 (1), 85-95 (2013).
- Dworkin, R. H., et al. Interpreting the clinical importance of group differences in chronic pain clinical trials: IMMPACT recommendations. Pain. 146 (3), 238-244 (2009).
- Mackinnon, S. E., Dellon, A. L. Results of treatment of recurrent dorsoradial wrist neuromas. Annals of Plastic Surgery. 19 (1), 54-61 (1987).
- Harden, R. N. Chronic neuropathic pain. Mechanisms, diagnosis, and treatment. Neurologist. 11 (2), 111-122 (2005).
- Poppler, L. H., et al. Surgical interventions for the treatment of painful neuroma: a comparative meta-analysis. Pain. 159 (2), 214-223 (2018).
- Eberlin, K. R., Ducic, I. Surgical algorithm for neuroma management: a changing treatment paradigm. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (10), 1952 (2018).
- Dorsi, M. J., et al. The tibial neuroma transposition (TNT) model of neuroma pain and hyperalgesia. Pain. 134 (3), 320-334 (2008).
- Tork, S., et al. Application of a porcine small intestine submucosa nerve cap for prevention of neuromas and associated pain. Tissue Engineering Part A. 26 (9-10), 503-511 (2020).
- Miyazaki, R., Yamamoto, T. The efficacy of morphine, pregabalin, gabapentin, and duloxetine on mechanical allodynia is different from that on neuroma pain in the rat neuropathic pain model. Anesthesia and Analgesia. 115 (1), 182-188 (2012).
- Tian, J., et al. Swimming training reduces neuroma pain by regulating neurotrophins. Medicine and Science in Sports Exercise. 50 (1), 54-61 (2018).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
- Poublon, A. R., et al. The anatomical relationship of the superficial radial nerve and the lateral antebrachial cutaneous nerve: A possible factor in persistent neuropathic pain. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 68 (2), 237-242 (2015).
- Dixon, W. J.
- Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats. Journal of Visualized Experiments. (61), e3393 (2012).
