Summary
这是使用最少的试剂和常用实验室设备（包括基本的智能手机）进行大麦叶鞘测定的简单方案。目的是在没有先进显微镜设备的实验室中可视化原始疾病的早期感染过程。
Abstract
了解植物和病原体如何相互作用，以及这种相互作用是否最终导致防御或疾病，需要制定更强大，更可持续的植物健康策略。在感染和定植期间更有效地对植物病原体样品进行成像的方法的进步已经产生了诸如水稻叶鞘测定之类的工具，该测定可用于监测水稻与真菌病原体 Magnaporthe oryzae之间的感染和早期定植事件。这种半生物营养病原体导致水稻和相关单子叶植物（包括小米、黑麦、大麦以及最近的小麦）的严重疾病损失。如果正确执行叶鞘测定，会产生光学透明的植物切片，几层厚，这使得研究人员能够在病原体攻击期间进行活细胞成像或生成针对特定特征染色的固定样品。对大麦-米曲霉 相互作用的详细细胞研究落后于水稻宿主，尽管这种谷物作为动物和人类的食物来源以及发酵饮料的重要性日益增加。这里报道的是大麦叶鞘测定法的发展，用于接种后前48小时内米 曲霉 相互作用的复杂研究。无论正在研究哪种物种，叶鞘测定都是微妙的;提供的协议涵盖了从大麦生长条件和获得叶鞘到植物叶片上病原体的接种、孵育和成像的所有内容。该协议可以针对高通量筛选进行优化，使用智能手机等简单的东西进行成像。
Introduction
稻瘟病真菌可感染各种谷物作物，包括大麦、小麦和水稻1。这种病原体会导致毁灭性的疾病，并对这些有价值的作物构成世界性的威胁，如果不加以控制，会导致作物完全损失。世界各地的许多实验室都关注稻瘟病，因为它具有全球威胁，并且是植物-真菌相互作用的优秀模型2。它已被完全测序，其感染周期的遗传学，特别是早期事件，已经确定3，4。生命周期从孢子在叶子表面萌发开始，形成称为顶膜的特殊渗透结构。蝾螈穿透叶片组织，感染继续发展病变，开始孢子形成过程并传播疾病4。预防这些早期事件中的任何一个都将极大地抑制这种毁灭性的疾病。因此，目前大多数关于原始细胞病的研究都集中在早期感染步骤上，从形成压迫层的发芽分生孢子到侵袭性菌丝和生物营养界面复合物（BIC）的发展5。
尽管 米曲霉 菌是多种作物的重要病原体，但对稻瘟病害进行了大量研究，新进化的菌株正在成为小麦的全球威胁6。虽然水稻是用于养活人口的三大主食作物之一，与小麦和玉米一起，但就牲畜饲料和啤酒生产而言，大麦是第四大谷物7。随着精酿啤酒行业的发展，大麦的经济价值也在增长。使用 米曲霉菌 和大麦作为病理系统来研究原始细胞病有明显的优势。首先，有些米 分枝杆菌 菌株只能感染大麦，也有可以感染多种草的菌株。例如，4091-5-8主要只感染大麦，而Guy11和70-15可以感染大麦和大米8。这些菌株在基因上相似，感染过程相当9。其次，在标准的实验室和温室条件下，大麦更容易种植，因为它没有水稻的复杂要求（简洁的温度控制，高湿度，特定的光谱）。由于叶子表面的疏水性，水稻也存在成像挑战，大麦没有表现出10。
该协议提供了一种简单的方法，用于分离和有效利用大麦叶鞘进行多个感染阶段的显微镜分析，使用常见的实验室用品和智能手机进行数据收集。这种用于大麦叶鞘测定的方法适用于世界各地的实验室，因为它需要最少的供应，但提供了病原体与其感染的前几个细胞之间微观相互作用的清晰图像。虽然致病性测定（例如喷雾或飞沫接种）可以提供病原体形成病变能力的宏观视图，但该测定允许研究人员可视化早期感染的特定步骤，从渗透前事件到表皮细胞定植。此外，研究人员可以很容易地将野生型真菌的感染与毒力降低的突变体的感染进行比较。
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Protocol
1.实验材料的制备
- 通过将燕麦片混合至细粉来制备燕麦琼脂 （OMA）。将25g燕麦粉和15g琼脂加入500mL ddH2O中，并在培养基循环中高压灭菌（或者煮沸20分钟）。将培养基倒入无菌60毫米培养皿中。
注意：诱导孢子形成的其他培养基类型，例如V8琼脂，对于此协议是可接受的。 - 使用无菌镊子将原料直接过滤到OMA板上，并允许它们覆盖整个板（9-12天）。将板置于25°C的生长培养箱中，昼夜循环12：12小时，以帮助诱导孢子形成。
注意：一些突变体生长较慢，需要额外的护理（例如，首先完成培养基，然后转移到OMA），并且可能需要额外的一周才能产生足够的分生孢子。 - 直接在潮湿的生长培养基（例如，无土盆栽介质）中种植大麦（Hordeum vulgare Lacey）种子，每6英寸盆栽10-15颗种子。将锅放入装有 1-2 英寸水的托盘中。
- 将大麦生长室条件设置为22°C12小时（日光）和19°C12小时（黑暗），相对湿度为60%。继续从底部浇水，以免打扰种子。
- 种植大麦直到第二个叶期，大约 14 天。使用无菌剪刀，在土壤线上方剪下大麦植株。使用镊子和剃刀/手术刀，小心地切开纵向打开的第一片叶子的叶鞘，然后用镊子将其从第二片叶子的基部取出。
注意：使用前用75%-80%乙醇清洁工具（镊子，手术刀等）。鞘是薄表皮层，提供从第一叶到第二叶（第二到第三片叶等;见 图1）的附着。 - 将第一片叶子平放在无菌的60毫米培养皿中，其中包含湿纸巾以保持板内的湿度。使用手术刀，将第一片叶子的大部分从鞘中切开，只留下 0.5 英寸的叶子组织用于安装。
- 将叶组织粘在培养皿的底部。
注意：鞘卷曲，但这是可以接受的，因为卷曲的鞘更容易夹住分生孢子液滴。 - 收集 9-12 天大的 米曲霉 菌平板，并向平板中加入 0.5-2 mL 无菌水。使用无菌接种环，轻轻刮擦菌丝体以释放附着的分生孢子。小心地将分生孢子悬浮液移液到含有一小块粗棉布的微量离心管中，以过滤掉分生孢子悬浮液中的任何大块菌丝体。
注意：如果生长和孢子形成足以达到所需的孢子浓度，则可以最早在 7 天收集孢子。如果使用生长缓慢的基因突变体，收集可以延迟不超过 14 天 - 所需的孢子浓度为每毫升 5 x 10 4 个孢子，但范围 （1 x 10 4-1 x 10 5） 是可以接受的。浓度过高会使单个感染部位成像具有挑战性;如有必要，用无菌水稀释孢子浓度。
- 小心地移液卷叶鞘内的分生孢子悬浮液。从 25 μL 开始（液滴尺寸可根据护套的大小增加，最高可达 50 μL）。
注意：建议对每个突变菌株或大麦系进行三到五次重复。染色过程中通常会发生损坏，因此建议进行额外的护套复制。 - 用 ddH2O 填充四个或五个 500 mL 烧杯，加热至蒸熟（使用微波炉或加热板）。移动热水烧杯时要小心。将培养皿的盖子放在其中一个蒸气腾腾的烧杯上，以将水分困在板内。
- 堆叠受感染的叶鞘板，并用剩余的热烧杯包围它们。这创造了一个潮湿的环境，这是孢子发芽所必需的。
注意：蒸盖子时要小心，以确保没有热水或蒸汽接触护套。 - 保护叶鞘避光，用纯色（黑色首选）橡胶或塑料盒覆盖，静置48小时或所需的成像时间点。
注意：纸板箱不适合，因为它不能锁住水分/湿度并吸收热水烧杯中的蒸汽。一个带锁的塑料浴缸可以很好地容纳湿度，它可以用黑色织物或更大的深色容器覆盖以阻挡光线。
2. 染色工艺
- 按如下方式准备染色剂：准备45%乙酸的新鲜稀释液，并加入0.1%v / v台盼蓝。将 1 mL 染料溶液等分到微量离心管中。将加热块或水浴设置为40°C。
- 小心地，使用剃须刀或手术刀，将叶鞘从胶带上切开。使用镊子将鞘放入微量离心管中，并确保其完全浸没在染料溶液中。让染料穿透叶子2小时。在加热块或水浴中的染色过程中，将样品加热到40°C，以增加染料的渗透。
注意：护套试图漂浮在微量离心管中;为防止叶组织未染色的口袋，请填充管，浸没鞘，然后关闭管。不要将多个护套放在同一个微量离心管中。 - 用60%甘油仔细冲洗叶鞘以去除多余的染料。三次冲洗（每次都是新鲜甘油）通常就足够了。将护套保持在甘油中，直到准备好安装在载玻片上。
3. 安装和成像过程
- 将护套放在干净的载玻片上，加入几滴60%甘油。使用解剖显微镜和两对镊子，小心地展开鞘，使接种的中心朝上。用镊子保持鞘开，并将盖玻片放在顶部，以防止鞘卷曲并阻塞感染部位。
注意：叶鞘非常脆弱，需要小心完成这些步骤以防止损坏鞘。 - 使用指甲油密封盖玻片以进行长期储存，或使用胶带密封用于短期储存。在复合光学显微镜下观察载玻片。
- 使用显微镜和手机拍摄基本图像。在这里，图像是用手机适配器支架和智能手机拍摄的。对于Android设备，将相机应用程序调整为以下设置：闪光灯关闭，禁用Top Shot，禁用亮度和阴影的自动调整，并将照片分辨率设置为全。
注意：使用手机上的相机应用程序会比平时更快地缩短电池寿命，因此建议使用外部电源。 - 将手机安装在显微镜上后，拍摄刻度千分尺的图像，物镜将用于获取数据。本研究中的数据是在40x 0.65 NA空气物镜下采集的，手机适配器安装在10x目镜上。将手机的变焦调整为 2.5 倍，并保持一致以保持恒定的像素大小。
- 鞘的中心容纳了最大浓度的孢子和感染性菌;因此，目标是每个护套的 9-12 张图像以获得用于统计分析的重要数字。孢子的数量和顶点根据施用的孢子浓度而变化。
4. 使用ImageJ（斐济）进行图像评估和计数
- 将图像传输到运行 ImageJ （FIJI） 的计算机。要打开图像，请将文件拖放到 ImageJ 栏上。
- 通过加载载物台千分尺图像并在刻度的两个标记之间绘制一条直线来设置图像的比例。打开 设置比例，输入测量线的 已知距离 ，然后键入刻度的单位。在本例中，在千分尺上，最小线为 10 μm。检查 设置全局 框并点击 OK。加载的所有后续图像将具有相同的比例。
- 要对孢子、孢子或其他对象进行计数，请选择 点 工具。接下来，打开 投资回报率管理器。单击键盘上的 T 键将点添加到列表中。如果需要，可以保存这些感兴趣的区域，并将其重新加载到同一图像上。
- 根据实验目标，进行额外的测量，例如孢子长度、菌株大小和胚管长度。
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Representative Results
图 1 显示了该技术的初始工作流程。鞘是从14天大的易感“莱西”大麦植物（H. vulgare）收获的。从10日龄的孢子米分枝杆菌OMA平板中收获分生孢子，使用无菌ddH2O制备分生孢子悬浮液，终浓度为每毫升5 x 104个孢子。将接种悬浮液直接施加到叶鞘上，叶鞘固定在无菌培养皿上。将板保持在温暖潮湿的室中48小时，没有光。在孵育期之后，叶鞘用台盼蓝染色并准备成像。
使用智能手机和智能手机显微镜适配器对感染部位进行成像。对于每种测试的 米曲霉菌株，至少记录10张图像。该实验重复三次，每种真菌菌株至少30张图像。 图2A 显示了成功鞘测定的代表性结果，以及未染色和染色不当的图像以供参考。
根据假设，这些图像可以通过多种方式进行量化和分析。对于该实验，在接种后48小时，计数活孢子（发芽孢子）的总数，以及压迫菌的数量和成功感染的细胞数量。在实验室中生成了2，000个在大麦感染背景下随机诱变的 米曲霉 菌株的集合。使用喷雾和滴剂接种的致病性测定显示，与野生型（ 米曲霉突变 体的常见表型）相比，许多突变体的病变大小减小11。为了梳理这些表型，假设病变大小减小是由抑制早期感染步骤之一（孢子萌发，压迫形成，渗透钉形成，初始表皮细胞定植）引起的，这最容易通过叶鞘测定 进行测试 。来自诱变项目的有前途的候选者使用名为J99A12的正向遗传学被鉴定出来。该突变体在筛选过程中没有表现出对缺氮或活性氧条件的敏感性。在随访实验中，J99A在疏水表面上产生了大量的压迫菌，但在活大麦上显示出减少的病变大小。当使用鞘测定法进行测试时，J99A成功开发了穿透叶鞘的压迫和穿透钉，它们穿透了叶鞘，但一旦进入就不会产生侵袭性菌丝，因此表明感染在穿透钉处停止（图2B）。通过叶鞘组织内存在感染性菌丝来鉴定成功感染的细胞。将压迫症的数量与感染细胞的数量进行比较，提供了成功感染压迫症的百分比。对于野生型4091-5-8，87%的压迫菌成功侵入并定植细胞，而在突变型J99A中，只有36%的压迫菌在细胞内有菌丝12。
图1：从10天大的大麦中收获的叶鞘，并用乙醇清洁的工具小心地去除。 收集分生孢子，用无菌水将浓度调节至每毫升0.5-1.0×105 。将隔离的鞘贴在60厘米的培养皿内，并将分生孢子悬浮液装入鞘中。接种的样品保存在室温下，在黑暗中，用热水烧杯保持湿度。将样品在40°C下用45%乙酸+ 0.1%台盼蓝染色1-2小时，然后在接种后用60%甘油冲洗3次48小时。对染色的样品进行安装并成像。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：染色方案的代表性结果。 （A）与染色方案的偏差可能导致次优结果。热量和乙酸用于温和软化叶组织。染色后用60%甘油冲洗不仅可以去除多余的污渍，而且有助于减少叶片引起的光散射并提高图像质量。比例尺 = 50 μm。 （B）代表性图像显示该测定中J99A（箭头）渗透失败和随后感染尝试的稳健性，与导致叶片组织产生侵袭性菌丝的4091WT成功尝试相比（箭头）。比例尺 = 50 μm。所有图像均在感染后48小时拍摄。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
有许多常用的检测方法可用于检测 米曲霉 菌株，这些菌株可提供相容或不相容感染反应的宏观水平视觉，例如喷雾或飞沫接种，以及使用评级系统来量化病变大小13，14。 米粒分枝杆菌 的另一种常见测定是测试病原体形成其特殊渗透结构的能力，即apppressorium 15。这里描述的是一种简单的方法，用于在细胞水平上快速有效地观察早期感染过程的变化，在更脆弱的大麦植物中。这种方法是独一无二的，因为它使用通用实验室设备和智能手机进行数据采集。这种方法消除了对配备相机和计算机控制的显微镜的需求，使任何实验室都能负担得起该协议。使用这种方法，我们能够确定突变的J99A感染在哪一步被阻止，这是以前的实验无法澄清的问题。
水稻中 米曲霉 菌的感染过程，特别是前几个表皮细胞的定植，已经使用荧光蛋白、标记物、染料、共聚焦成像和先进的显微镜进行了良好的成像16。这些类型的成像实验昂贵、耗时，并且需要特定的专业知识。许多实验室使用同源重组，能够创建 米曲霉 的遗传突变体来分析单个基因在感染周期中的作用，但可能无法获得探索潜在细胞生物学所需的先进设备和专业知识。该协议旨在帮助弥合这一差距，仅使用复合光学显微镜和智能手机来捕获数字图像并生成固定叶鞘组织的z-stack型视频。该方法能够将几个细胞层成像到组织中，捕获侵袭性真菌菌丝长达48小时。水稻和大麦的叶鞘具有相似的特征;它们只有几个细胞层厚，叶绿体较少，使它们更容易成像。如上所述，大麦的疏水性较低，比水稻更容易种植，许多米曲霉菌株可引起水稻和大麦的感染，因此该实验很容易换成更复杂的水稻测定。
这种方法的一些限制包括使用智能手机的视频功能来收集z场数据，因为帧速率的z增量是未知的。另一个限制是它需要固定组织（不是活细胞）。然而，由于协议的速度和易用性，可以通过检查感染后的各个时间点来克服这一限制。
该方案最关键的步骤之一是适当的染色。漂洗不当会导致载玻片制备中的染料过多，导致染料饱和，并使病原体组织与叶组织难以区分。同时，染色不足可防止病原体组织与叶片组织形成对比。
上述方法适用于许多科学问题，可用于评估真菌突变体，评估大麦植株中不同程度的遗传抗性，并测试先前应用的真菌控制方法的效率。也可以将这种方法扩展到其他植物 - 病原体相互作用，特别是其他单子叶植物叶鞘。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者承认来自USDA-NIFA奖2016-67013-24816的资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
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