Summary
Dette er en ligetil protokol for et bygbladskedeassay ved hjælp af minimale reagenser og almindeligt laboratorieudstyr (inklusive en grundlæggende smartphone). Formålet er at visualisere den tidlige infektionsproces af blastsygdom i laboratorier uden adgang til avanceret mikroskopiudstyr.
Abstract
At forstå, hvordan planter og patogener interagerer, og om denne interaktion kulminerer i forsvar eller sygdom, er nødvendig for at udvikle stærkere og mere bæredygtige strategier for plantesundhed. Fremskridt inden for metoder, der mere effektivt afbilder plantepatogenprøver under infektion og kolonisering, har givet værktøjer såsom risbladskedeanalysen, som har været nyttig til overvågning af infektion og tidlige koloniseringshændelser mellem ris og svampepatogenet, Magnaporthe oryzae. Dette hemi-biotrofe patogen forårsager alvorligt sygdomstab i ris og beslægtede monocots, herunder hirse, rug, byg og for nylig hvede. Bladkappeanalysen giver, når den udføres korrekt, et optisk klart planteafsnit, flere lag tykt, hvilket gør det muligt for forskere at udføre levende cellebilleddannelse under patogenangreb eller generere faste prøver farvet til specifikke funktioner. Detaljerede cellulære undersøgelser af interaktionen mellem byg og M. oryzae har haltet bagefter risværtens, på trods af kornets voksende betydning som fødekilde for dyr og mennesker og som gærede drikkevarer. Her rapporteres udviklingen af et bygbladskedeassay til indviklede undersøgelser af M. oryzae-interaktioner i løbet af de første 48 timer efter podning. Bladskedeanalysen, uanset hvilken art der undersøges, er delikat; forudsat er en protokol, der dækker alt fra bygvækstbetingelser og opnåelse af en bladkappe til podning, inkubation og billeddannelse af patogenet på planteblade. Denne protokol kan optimeres til screening med høj kapacitet ved hjælp af noget så simpelt som en smartphone til billedbehandlingsformål.
Introduction
Magnaporthe oryzae, risblastsvampen, inficerer et udvalg af kornafgrøder, herunder byg, hvede og ris1. Dette patogen forårsager ødelæggende sygdomme og udgør en verdensomspændende trussel mod disse værdifulde afgrøder, hvilket forårsager fuldstændigt afgrødetab, hvis det ikke kontrolleres. Mange laboratorier rundt om i verden fokuserer på risblastsygdom på grund af dens globale trussel og dens egenskaber som en fremragende model for plante-svampeinteraktioner2. Det er blevet fuldt sekventeret, og genetikken i dets infektionscyklus, især de tidlige begivenheder, er blevet fastslået 3,4. Livscyklussen begynder med en spore, der spirer på en bladoverflade, der danner den specialiserede penetrationsstruktur kaldet appressoriet. Appressoriet trænger ind i bladvævet, og infektionen fortsætter med udviklingen af læsioner, som starter sporulationsprocessen og spreder sygdom4. Forebyggelse af nogen af disse tidlige begivenheder ville drastisk hæmme denne ødelæggende sygdom. Derfor har det meste af den aktuelle forskning i blastsygdom været fokuseret på de tidlige infektionstrin, fra de spirede konidier, der danner et appressorium, til udviklingen af invasive hyfer og det biotrofiske grænsefladekompleks (BIC)5.
Den store mængde forskning i blastsygdom er blevet udført i ris, selvom M. oryzae er et betydeligt patogen for en række afgrøder, og nyudviklede stammer fremstår som en global trussel mod hvede6. Mens ris er en af de tre bedste basisafgrøder, der bruges til at fodre befolkningen sammen med hvede og majs, er byg det fjerde kornkorn med hensyn til husdyrfoder og ølproduktion7. Efterhånden som håndværksølindustrien vokser, vokser også bygens økonomiske værdi. Der er klare fordele ved at bruge M. oryzae og byg som et patosystem til at studere blast sygdom. For det første er der stammer af M. oryzae , der kun inficerer byg, samt stammer, der kan inficere flere græsarter. For eksempel inficerer 4091-5-8 primært kun byg, mens Guy11 og 70-15 kan inficere både byg og ris8. Disse stammer er genetisk ens, og infektionsprocessen er sammenlignelig9. For det andet er byg under standard laboratorie- og drivhusforhold lettere at dyrke, da det ikke har de komplicerede krav til ris (kortfattet temperaturkontrol, høj luftfugtighed, specifikke lysspektre). Der er også billeddannelsesudfordringer med ris på grund af bladoverfladens hydrofobicitet, som byg ikke udviser10.
Denne protokol præsenterer en enkel metode til isolering og effektiv udnyttelse af bygbladskeder til mikroskopisk analyse af flere infektionsstadier ved hjælp af almindelige laboratorieforsyninger og en smartphone til dataindsamling. Denne metode til bygbladskedeanalysen kan tilpasses laboratorier over hele verden, da den kræver minimale forsyninger og alligevel giver et klart billede af den mikroskopiske interaktion mellem patogenet og de første par celler, det inficerer. Mens patogenicitetsassays, såsom en spray- eller dråbeinokulation, kan give et makrobillede af patogenets evne til at danne læsioner, giver dette assay forskeren mulighed for at visualisere specifikke trin i tidlig infektion, fra præpenetrationshændelser til kolonisering af epidermale celler. Desuden kan forskere let sammenligne infektion med vildtypesvampen med infektion med en mutant reduceret i virulens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af forsøgsmaterialer
- Forbered havregrynagar (OMA) ved at blande havregryn, indtil det er et fint pulver. Tilsæt 25 g havregrynpulver og 15 g agar til 500 ml ddH2O, og autoklave på mediecyklus (kog alternativt i 20 minutter). Hæld mediet i sterile 60 mm petriskåle.
BEMÆRK: Andre medietyper, der inducerer sporulation, såsom V8-agar, accepteres for denne protokol. - Plade M. oryzae filter lagres direkte på OMA-pladerne ved hjælp af sterile tang, og lad dem dække hele pladen (9-12 dage). Pladerne anbringes i en vækstinkubator ved 25 °C med 12:12 timers dag:nat-cyklusser for at hjælpe med at fremkalde sporulation.
BEMÆRK: Nogle mutanter vokser langsommere og kræver ekstra pleje (f.eks. Komplet medie først, derefter en overførsel til OMA) og kan tage en ekstra uge at producere nok konidier. - Plant direkte byg (Hordeum vulgare Lacey) frø i et fugtigt vækstmedium (f.eks. Jordløse pottemedier) med 10-15 frø pr. 6 tommer potte. Læg gryderne i bakker med 1-2 tommer vand.
- Indstil bygvækstkammerbetingelserne til 22 °C i 12 timer (dagslys) og 19 °C i 12 timer (mørke) ved 60 % relativ luftfugtighed. Fortsæt med vand fra bunden for ikke at forstyrre frøene.
- Dyrk byggen indtil det andet bladstadium, cirka i 14 dage. Brug steril saks til at skære bygplanten lige over jordlinjen. Brug tang og en barbermaskine / skalpel til forsigtigt at skære bladskeden på det første blad, der er åbent i længderetningen, og fjern det fra bunden af det andet blad ved hjælp af tangen.
BEMÆRK: Rengør værktøjet (pincet, skalpel osv.) før brug med 75% -80% ethanol. Kappen er det tynde epidermislag, der giver fastgørelsen fra det første til det andet blad (andet til tredje blad osv.; se figur 1). - Læg det første blad fladt i en steril 60 mm petriskål, der indeholder et vådt køkkenrulle for at opretholde fugtigheden inde i pladen. Brug skalpellen til at skære størstedelen af det første blad væk fra kappen, så der kun efterlades 0,5 tommer af bladvævet til montering.
- Tape bladvævet til bunden af petripladen.
BEMÆRK: Kappen krøller, men dette er acceptabelt, da en krøllet kappe lettere holder den konidiale dråbe. - Saml 9-12 dage gamle M. oryzae-plader , og tilsæt 0,5-2 ml sterilt vand til pladerne. Brug en steril podningssløjfe til forsigtigt at skrabe mycelien for at frigøre de vedhæftede konidier. Konidsuspensionen pipetteres forsigtigt i et mikrocentrifugerør, der indeholder et lille stykke osteklæde, for at filtrere eventuelle store stykker mycelium fra konidialsuspensionen.
BEMÆRK: Sporer kan indsamles så tidligt som 7 dage, hvis vækst og sporulation er tilstrækkelig til at nå den ønskede sporkoncentration. Indsamling kan forsinkes ikke mere end 14 dage, hvis du arbejder med en langsomt voksende genetisk mutant - Den ønskede sporekoncentration er 5 x 10 4 sporer pr. ml, men et interval (1 x 10 4-1 x 10 5) er acceptabelt. For høj koncentration gør billeddannelse af individuelle infektionssteder udfordrende; Fortynd sporekoncentrationen med sterilt vand om nødvendigt.
- Afpipetter forsigtigt conidialsuspensionen inde i den rullede bladkappe. Start med 25 μL (dråbestørrelsen kan øges afhængigt af kappens størrelse, op til 50 μL).
BEMÆRK: Det anbefales at udføre tre til fem replikater af hver mutant stamme eller byglinje. Det er almindeligt, at der opstår skader under farvningsprocessen, derfor anbefales yderligere kappereplikater. - Fire eller fem 500 ml bægerglas fyldes med ddH2O, og der opvarmes til dampning (ved hjælp af mikrobølgeovn eller kogeplade). Vær forsigtig, når du flytter varmtvandsbægrene. Hold låget på petriskålen over et af de dampende bægerglas for at fange fugt inde i pladen.
- Stak de inficerede bladskedeplader og omgiv dem med de resterende varme bægerglas. Dette skaber et fugtigt, fugtigt miljø, der kræves for sporerne at spire.
BEMÆRK: Vær forsigtig, når du damper lågene for at sikre, at varmt vand eller damp ikke rører skederne. - Beskyt bladkapperne mod lys, dæk med en ensfarvet (sort foretrukket) gummi- eller plastkasse, og lad den sidde i 48 timer eller det ønskede tidspunkt for billeddannelse.
BEMÆRK: En papkasse er ikke egnet, fordi den ikke låser fugt/fugtighed fast og absorberer dampen fra varmtvandsbægrene. En låsende plastikbøtte fungerer godt til at indeholde fugtigheden, og den kan dækkes med sort stof eller en større mørk beholder for at blokere lyset.
2. Farvning proces
- Forbered pletten som følger: Forbered en frisk fortynding af 45% eddikesyre og tilsæt 0,1% v/v trypanblåt. Alikvote 1 ml farvestofopløsning i mikrocentrifugeglas. Indstil en varmeblok eller et vandbad til 40 °C.
- Brug forsigtigt en barbermaskine eller skalpel til at skære bladkappen væk fra båndet. Brug tang til at placere kappen i mikrocentrifugerøret og sikre, at den er helt nedsænket i farvestofopløsningen. Lad farvestoffet trænge ind i bladet i 2 timer. Prøverne opvarmes til 40 °C under farvningsprocessen i en varmeblok eller et vandbad for at øge farvestoffets indtrængning.
BEMÆRK: Skederne forsøger at flyde i mikrocentrifugerøret; For at forhindre ufarvede lommer af bladvæv skal du fylde rørene, nedsænke kapperne og lukke røret. Anbring ikke flere skeder i det samme mikrocentrifugerør. - Skyl bladskederne forsigtigt i 60% glycerol for at fjerne det ekstra farvestof. Tre skylninger (hver i frisk glycerol) er generelt tilstrækkelige. Opbevar kappen i glycerol, indtil den er klar til montering på dias.
3. Monterings- og billeddannelsesproces
- Placer kappen på et rent glasglas og tilsæt et par dråber 60% glycerol. Brug et dissekerende mikroskop og to par tang til forsigtigt at rulle kappen ud og lade det inokulerede center vende opad. Hold kappen åben med pincetten, og læg dækslet ovenpå for at forhindre, at kappen krøller og blokerer infektionsstedet.
BEMÆRK: Bladkappen er meget skrøbelig, og disse trin skal udføres med omhu for at forhindre beskadigelse af kappen. - Forsegl dækslet ved hjælp af neglelak til langtidsopbevaring eller tape til kortvarig opbevaring. Overhold diasene under et sammensat lysmikroskop.
- Tag grundlæggende billeder ved hjælp af et mikroskop og en mobiltelefon. Her blev der taget billeder med en mobiltelefonadaptermontering og en smartphone. For Android-enheder skal du justere kameraapplikationen til følgende indstillinger: flash off, deaktiver Top Shot, deaktiver automatisk justering af lysstyrke og skygger, og indstil fotoopløsningen til fuld.
BEMÆRK: Brug af kameraapplikationen på telefonen reducerer batteriets levetid hurtigere end normalt, så det anbefales at have ekstern strøm. - Når mobiltelefonen er monteret på mikroskopet, skal du tage et billede af et skalamikrometer med det formål, der vil blive brugt til at erhverve dataene. Dataene i denne undersøgelse blev erhvervet ved et 40x 0,65 NA-luftmål, og telefonadapteren blev monteret på en 10x okulær. Juster telefonens zoom til 2.5x, og hold den konsistent for at opretholde en konstant pixelstørrelse.
- Midten af kappen huser den største koncentration af sporer og inficerer appressoria; Sigt derfor efter 9-12 billeder af hver kappe for at opnå betydelige tal til statistisk analyse. Antallet af sporer og appressoria varierer afhængigt af koncentrationen af anvendte sporer.
4. Billedvurdering og optælling ved hjælp af ImageJ (FIJI)
- Overfør billederne til en computer, der kører ImageJ (FIJI). For at åbne billederne skal du trække og slippe filerne på ImageJ-linjen.
- Indstil skalaen på billederne ved at indlæse scenemikrometerbilledet og tegne en lige linje mellem to markeringer for skalaen. Åbn Indstil skala, skriv den kendte afstand for den målte linje, og skriv enheden for skalaen. På mikrometeret var den mindste linje i dette eksempel 10 μm. Marker afkrydsningsfeltet Indstil globalt , og tryk på OK. Alle efterfølgende indlæste billeder vil have samme skala.
- Hvis du vil tælle appressoria, sporer eller andre objekter, skal du vælge punktværktøjet . Åbn derefter ROI Manager. Klik på T-tasten på tastaturet for at føje punkter til listen. Disse interesseområder kan gemmes, hvis det er nødvendigt, og genindlæses på det samme billede.
- Afhængigt af de eksperimentelle mål skal du foretage yderligere målinger, såsom sporelængde, appressoria størrelse og kimrørlængde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En afbildning af den indledende arbejdsgang for denne teknik vises i figur 1. Skederne blev høstet fra 14 dage gamle modtagelige "Lacey" bygplanter (H. vulgare). Konidierne blev høstet fra 10 dage gamle sporulerende M. oryzae OMA-plader med en conidial suspension fremstillet under anvendelse af steril ddH2O til en slutkoncentration på 5 x 104 sporer pr. ml. Inokulumsuspensionen blev direkte påført bladskeder, som blev fastgjort til sterile petriplader. Pladerne blev opbevaret i et varmt, fugtigt kammer i 48 timer uden lys. Efter inkubationsperioden blev bladskederne farvet med trypanblå og forberedt til billeddannelse.
Infektionssteder blev afbildet ved hjælp af en smartphone og smartphone mikroskopadapter. Der blev optaget mindst 10 billeder for hver af de testede stammer af M. oryzae. Forsøget blev gentaget tre gange for mindst 30 billeder for hver svampestamme. Figur 2A viser de repræsentative resultater af en vellykket kappeanalyse sammen med ubejdsede og forkert farvede billeder som reference.
Afhængigt af hypotesen kan disse billeder kvantificeres og analyseres på en overflod af måder. Til dette eksperiment blev det samlede antal levende sporer (spirede sporer) talt 48 timer efter podning sammen med antallet af appressoria og antallet af vellykkede inficerede celler. En samling af 2.000 tilfældigt mutageniserede M. oryzae-stammer i en byg-inficerende baggrund blev genereret i laboratoriet. Patogenicitetsanalyser ved hjælp af spray- og dråbepodninger afslørede mange mutanter med reduceret læsionsstørrelse sammenlignet med vildtypen (en almindelig fænotype for M. oryzae-mutanter )11. For at drille disse fænotyper fra hinanden blev det antaget, at den reducerede læsionsstørrelse skyldtes hæmning af et af de tidlige infektionstrin (sporespiring, appressorial dannelse, penetrationspindedannelse, indledende epidermal cellekolonisering), som lettest testes via bladskedeanalysen. En lovende kandidat fra mutageneseprojektet blev identificeret ved hjælp af en fremadrettet genetisk ved navn J99A12. Denne mutant viste ikke følsomhed over for hverken nitrogensultede eller reaktive iltforhold under skærmen. Under opfølgende eksperimenter producerede J99A et betydeligt antal appressoria på en hydrofob overflade, men viste reduceret læsionsstørrelse på levende byg. Ved test ved hjælp af kappeanalysen udviklede J99A med succes appressoria og penetrationspinde, der trængte ind i bladskeden, men ikke producerede invasive hyfer, når de først var inde, hvilket tyder på, at infektionen stoppede ved penetrationspinden (figur 2B). Succesfuldt inficerede celler blev identificeret ved tilstedeværelsen af infektiøse hyfer inde i bladkappens væv. Sammenligning af antallet af appressoria med antallet af inficerede celler gav en procentdel af vellykket infektion af appressoria. For vildtype 4091-5-8 invaderede og koloniserede 87% af appressoria cellen med succes, mens kun 36% af appressoria i mutanten J99A havde hyfer inde i celle12.
Figur 1: Bladskeder høstet fra 10 dage gammel byg og omhyggeligt fjernet med værktøjer renset i ethanol. Konidier opsamles, og koncentrationen justeres til 0,5-1,0 x 105 pr. Milliliter med sterilt vand. De isolerede skeder tapes inde i en 60 cm petriplade, og conidialophænget lægges i kappen. De podede prøver opbevares ved stuetemperatur i mørke med bægerglas varmt vand for fugtighed. Prøverne farves i 45% eddikesyre + 0,1% trypanblåt i 1-2 timer ved 40 °C, skylles derefter i 60% glycerol tre gange i 48 timer efter podning. Farvede prøver monteres og afbildes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater fra farvningsprotokollen. (A) Afvigelser fra farvningsprotokollen kan resultere i suboptimale resultater. Varmen og eddikesyren tjener til forsigtigt at blødgøre bladvævet. Skylningerne efter farvning i 60% glycerol fjerner ikke kun overskydende plet, men hjælper med at reducere lysspredningen forårsaget af bladet og forbedre billedkvaliteten. Skalastænger = 50 μm. (B) Repræsentative billeder, der viser robustheden i dette assay for at se mislykket penetration og efterfølgende infektionsforsøg af J99A (pilespidser) sammenlignet med vellykkede forsøg på 4091WT, der resulterede i produktion af invasive hyfer til bladvævet (pile). Skalastænger = 50 μm. Alle billeder blev taget 48 timer efter infektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er mange almindeligt anvendte assays tilgængelige til test af M. oryzae-stammer, der giver et makroskopisk niveau af et kompatibelt eller inkompatibelt infektionsrespons, såsom spray- eller dråbevaccinationer, og brugen af klassificeringssystemer til kvantificering af læsionsstørrelser13,14. Et andet almindeligt assay for M. oryzae er at teste patogenets evne til at danne sin specialiserede penetrationsstruktur, apppressorium15. Her beskrives en nem metode til at observere ændringer i tidlige infektionsprocesser hurtigt og effektivt på celleniveau i den mere lette bygplante. Denne metode er unik, idet den bruger almindeligt laboratorieudstyr og en smartphone til datafangst. Denne metode negerer behovet for kameraudstyrede og computerstyrede mikroskoper, hvilket gør denne protokol overkommelig for ethvert laboratorium. Ved hjælp af denne metode var vi i stand til at identificere, på hvilket trin mutant J99A-infektion blev stoppet, et spørgsmål tidligere eksperimenter ikke har været i stand til at afklare.
Infektionsprocessen af M. oryzae i ris, især kolonisering af de første par epidermale celler, er blevet godt afbildet ved hjælp af fluorescerende proteiner, markører, farvestoffer, konfokal billeddannelse og avanceret mikroskopi16. Disse typer billeddannelseseksperimenter er dyre, tidskrævende og kræver specifik ekspertise. Mange laboratorier, der bruger homolog rekombination, er i stand til at skabe genetiske mutanter af M. oryzae for at analysere individuelle gens roller i infektionscyklussen, men har muligvis ikke adgang til det avancerede udstyr og ekspertise, der kræves for at udforske den underliggende cellebiologi. Denne protokol er beregnet til at hjælpe med at bygge bro over dette hul ved kun at bruge et sammensat lysmikroskop og en smartphone til at tage digitale billeder og generere z-stack-type videoer af faste bladkappevæv. Denne metode gør det muligt at billeddannelse af nogle få cellelag i vævet og fange de invasive svampehyfer i op til 48 timer. Bladskeden af ris og byg har lignende egenskaber; De er kun få cellelag tykke og har mindre kloroplaster, hvilket gør dem lettere at afbilde. Som nævnt ovenfor er byg mindre hydrofob og lettere at dyrke end ris, og mange stammer af M. oryzae kan forårsage infektion på ris og byg, hvilket gør dette eksperiment til en let bytte for de mere komplicerede risanalyser.
Et par begrænsninger ved denne metode inkluderer brug af smartphonens videofunktion til at indsamle z-feltdata, da z-trinnet for billedhastigheden er ukendt. En anden begrænsning er, at det kræver fast væv (ikke levende celler). På grund af protokollens hastighed og lethed kunne denne begrænsning imidlertid overvindes ved at undersøge forskellige tidspunkter efter infektion.
Et af de mest afgørende trin i protokollen er korrekt farvning. Forkert skylning forårsager overskydende farvestof i diaspræparatet, hvilket forårsager farvemætning og gør patogenvævet umuligt at skelne fra bladvævet. I mellemtiden forhindrer underfarvning patogenvævet i at kontrastere mod bladvævet.
Den førnævnte metode kan tilpasses mange videnskabelige spørgsmål og kan bruges til at vurdere svampemutanter, vurdere forskellige grader af genetisk resistens i bygplanter og teste effektiviteten af tidligere anvendte svampebekæmpelsesmetoder. Det er også muligt at udvide denne metode til andre plantepatogeninteraktioner, især andre monocotbladskeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender finansiering fra USDA-NIFA-prisen 2016-67013-24816.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , Springer. Cham. 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , Doctoral dissertation (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
