Summary
これは、最小限の試薬と一般的な実験装置(基本的なスマートフォンを含む)を使用した大麦葉鞘アッセイの簡単なプロトコルです。目的は、高度な顕微鏡装置にアクセスすることなく、実験室でいもち病の初期感染プロセスを視覚化することです。
Abstract
植物と病原体がどのように相互作用するか、そしてその相互作用が防御または病気で最高潮に達するかどうかを理解することは、植物の健康のためのより強力でより持続可能な戦略を開発するために必要です。感染およびコロニー形成中に植物病原体サンプルをより効果的にイメージングする方法の進歩により、イネ葉鞘アッセイなどのツールが得られ、イネと真菌病原体である Magnaporthe oryzaeとの間の感染および早期コロニー形成イベントのモニタリングに役立ちました。この半生物栄養病原体は、イネおよびキビ、ライ麦、大麦、そして最近では小麦を含む関連する単子葉植物に深刻な病気の喪失を引き起こします。葉鞘アッセイは、正しく実行されると、数層の厚さの光学的に透明な植物切片が得られるため、病原体の攻撃中に生細胞イメージングを実行したり、特定の特徴について染色された固定サンプルを生成したりできます。オオムギM.の詳細な細胞調査。 麹の相互作用は、動物や人間の食料源として、また発酵飲料としてのこの穀物の重要性が高まっているにもかかわらず、イネの宿主の相互作用に遅れをとっています。 ここで報告されているのは、接種後最初の48時間における M. oryzae 相互作用の複雑な研究のための大麦葉鞘アッセイの開発です。葉鞘アッセイは、どの種が研究されているかに関係なく、繊細です。オオムギの成長条件や葉鞘の取得から、植物の葉への病原体の接種、インキュベーション、イメージングまで、すべてをカバーするプロトコルが提供されます。このプロトコルは、イメージング目的でスマートフォンのようなシンプルなものを使用して、ハイスループットスクリーニング用に最適化できます。
Introduction
イネいもち病菌であるマグナポルテ・オリゼは、大麦、小麦、米などのさまざまな穀物に感染します1。この病原体は壊滅的な病気を引き起こし、これらの貴重な作物に世界的な脅威をもたらし、制御しないと完全な作物の損失を引き起こします。世界中の多くの研究所は、その世界的な脅威と植物と真菌の相互作用の優れたモデルとしての属性のために、イネいもち病に焦点を当てています2。それは完全に配列決定されており、その感染サイクルの遺伝学、特に初期のイベントが確立されています3,4。ライフサイクルは、葉の表面に胞子が発芽することから始まり、付着器と呼ばれる特殊な貫通構造を形成します。付着器は葉の組織を貫通し、感染は胞子形成のプロセスを開始し、病気を広げる病変の発生とともに続きます4。これらの初期の出来事のいずれかを防ぐことは、この壊滅的な病気を劇的に抑制するでしょう。その結果、いもち病に関する最新の研究のほとんどは、付着器を形成する発芽分生子から侵襲性菌糸および生物栄養界面複合体(BIC)の開発まで、初期の感染ステップに焦点を合わせています5。
いもち病に関する膨大な量の研究はイネで行われてきましたが、 M. oryzae はさまざまな作物にとって重要な病原体であり、新たに進化した株が小麦に対する世界的な脅威として浮上しています6。米は小麦やトウモロコシと並んで人口を養うために使用される上位3つの主食作物の1つですが、大麦は家畜飼料とビール生産の点で4番目の穀物です7。クラフトビール産業が成長するにつれて、大麦の経済的価値も高まります。 M. oryzae と大麦をいもち病を研究するための病理システムとして使用することには明確な利点があります。第一に、オオムギだけに感染する M. oryzae の株と、複数の草種に感染することができる株があります。たとえば、4091-5-8は主に大麦のみに感染しますが、Guy11と70-15は主に大麦と米の両方に感染する可能性があります8。これらの株は遺伝的に類似しており、感染プロセスは同等です9。第二に、標準的な実験室および温室条件下では、大麦は米の複雑な要件(簡潔な温度制御、高湿度、比光スペクトル)がないため、栽培が容易です。また、葉の表面が疎水性であるため、イネにはイメージングの課題があり、大麦は10を示しません。
このプロトコルは、一般的な実験用品とデータ収集用のスマートフォンを使用して、複数の感染段階の顕微鏡分析のために大麦葉鞘を分離し、効果的に利用するための簡単な方法を提示します。大麦葉鞘アッセイのこの方法は、最小限の供給で済み、病原体とそれが感染する最初の数細胞との間の微視的相互作用の明確な画像を提供するため、世界中のラボに適応できます。スプレーや液滴接種などの病原性アッセイは、病原体が病変を形成する能力のマクロビューを提供できますが、このアッセイにより、研究者は、浸透前のイベントから表皮細胞のコロニー形成まで、早期感染の特定のステップを視覚化できます。さらに、研究者は、野生型真菌による感染を、病原性が低下した変異体による感染と容易に比較することができる。
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Protocol
1. 実験材料の作成
- オートミールが微粉末になるまでブレンドして、オートミール寒天(OMA)を準備します。オートミール粉末25gと寒天15gをddH2O500mLに加え、培地サイクルでオートクレーブします(または20分間沸騰させます)。培地を滅菌済みの60 mmペトリ皿に注ぎます。
注:V8寒天など、胞子形成を誘発する他の培地タイプは、このプロトコルで許容されます。 - プレート M. oryzae フィルターは、滅菌鉗子を使用してOMAプレートに直接ストックし、プレート全体を覆うことができます(9〜12日)。プレートを25°Cの成長インキュベーターに入れ、昼夜12時間サイクルで胞子形成を誘導します。
注:一部の変異体は成長が遅く、追加の注意が必要であり(たとえば、最初に完全な培地、次にOMAへの移行)、十分な分生子を生成するまでにさらに1週間かかる場合があります。 - 大麦(Hordeum vulgare Lacey)の種子を湿った成長培地(土壌のない培養土など)に10インチのポットあたり15〜6個の種子で直接植えます。鍋を1〜2インチの水でトレイに入れます。
- 大麦栽培チャンバーの条件を、相対湿度60%で22°Cで12時間(昼光)、19°Cで12時間(暗)に設定します。種子を乱さないように底から水をやり続けます。
- 2番目の葉の段階まで、約14日間大麦を育てます。滅菌ハサミを使用して、土壌線のすぐ上で大麦植物を切ります。鉗子とカミソリ/メスを使用して、縦方向に開いている最初の葉の葉鞘を注意深く切り、鉗子を使用して2番目の葉の付け根から取り除きます。
注意: 使用前に、75%〜80%のエタノールでツール(鉗子、メスなど)を清掃してください。鞘は、第1葉から第2葉(第2葉から第3葉など; 図1参照)への付着を提供する薄い表皮層である。 - プレート内の湿度を維持するために湿ったペーパータオルを含む滅菌60 mmのペトリ皿に最初の葉を平らに置きます。メスを使用して、最初の葉の大部分を鞘から切り取り、取り付け用の葉組織の0.5インチだけを残します。
- 葉の組織をペトリプレートの底にテープで留めます。
注:シースはカールしますが、カールしたシースは分生子の液滴をより簡単に保持するため、これは許容されます。 - 9〜12日齢の M.oryzae プレートを収集し、プレートに0.5〜2 mLの滅菌水を追加します。滅菌接種ループを使用して、菌糸体を静かにこすり、付着した分生子を解放します。分生子懸濁液をチーズクロスの小片を含む微小遠心チューブに注意深くピペットで入れ、分生子懸濁液から大きな菌糸体をろ過します。
注:胞子は、成長と胞子形成が目的の胞子濃度に達するのに十分である場合、早くも7日で収集できます。成長の遅い遺伝子変異体を扱う場合、収集は14日以内に遅らせることができます - 所望の胞子濃度は、1mLあたり5 x 10 4胞子であるが、範囲(1 x 10 4-1 x 10 5)が許容される。濃度が高すぎると、個々の感染部位のイメージングが困難になります。必要に応じて胞子濃度を滅菌水で希釈します。
- 転がされた葉鞘の内側に分生子懸濁液を慎重にピペットで入れます。25 μLから始めます(液滴サイズはシースのサイズに応じて最大50 μLまで増やすことができます)。
注:各変異株または大麦系統の3〜5回の反復を実行することをお勧めします。染色プロセス中に損傷が発生することは一般的であるため、追加のシース複製が推奨されます。 - 4つまたは5つの500 mLビーカーにddH2Oを入れ、蒸すまで加熱します(電子レンジまたはホットプレートを使用)。温水ビーカーを動かすときは注意してください。ペトリ皿の蓋を蒸しビーカーの1つにかざして、プレート内の湿度を閉じ込めます。
- 感染した葉の鞘板を積み重ね、残りの熱いビーカーで囲みます。これにより、胞子が発芽するために必要な湿気の多い湿った環境が生まれます。
注意: 蓋を蒸すときは、お湯や蒸気がシースに触れないように注意してください。 - 葉鞘を光から保護し、無地(黒が望ましい)のゴムまたはプラスチックの箱で覆い、48時間またはイメージングに必要な時点まで放置します。
注意: 段ボール箱は湿気/湿度を閉じ込めず、温水ビーカーからの蒸気を吸収するため、適していません。ロックされたプラスチック製の浴槽は湿気を抑えるのに適しており、黒い布または大きな暗い容器で覆って光を遮ることができます。
2.染色プロセス
- 次のように染色を準備します:45%酢酸の新しい希釈液を準備し、0.1%v / vトリパンブルーを追加します。色素溶液1 mLをマイクロ遠心チューブに分注します。ヒートブロックまたはウォーターバスを40°Cに設定します。
- かみそりまたはメスを使用して、葉鞘をテープから慎重に切り取ります。鉗子を使用して、シースを微量遠心チューブに入れ、色素溶液に完全に沈んでいることを確認します。染料が葉に浸透するまで2時間待ちます。染色処理時間中にサンプルをヒートブロックまたはウォーターバスで40°Cに加熱して、染料の浸透性を高めます。
注:シースはマイクロ遠心チューブに浮かぼうとします。葉組織の汚れていないポケットを防ぐために、チューブを満たし、鞘を沈め、チューブを閉じます。同じマイクロ遠心チューブに複数のシースを入れないでください。 - 葉鞘を60%グリセロールで注意深くすすぎ、余分な染料を取り除きます。3回のすすぎ(それぞれ新鮮なグリセロール)で一般的に十分です。スライドに取り付ける準備ができるまで、シースをグリセロールに保ちます。
3.実装およびイメージングプロセス
- シースをきれいなスライドガラスの上に置き、60%グリセロールを数滴加えます。解剖顕微鏡と2対の鉗子を使用して、接種した中心を上に向けて慎重に鞘を広げます。鉗子でシースを開いたままにし、カバーガラスを上に置いて、シースがカールして感染部位を塞ぐのを防ぎます。
注意: 葉鞘は非常に壊れやすいため、これらの手順は鞘の損傷を防ぐために注意して行う必要があります。 - 長期保管の場合はマニキュア、短期保管の場合はテープを使用してカバーガラスを密封します。複合光学顕微鏡でスライドを観察します。
- 顕微鏡と携帯電話を使用して基本的な画像を撮ります。ここでは、携帯電話のアダプターマウントとスマートフォンで画像を撮影しました。Androidデバイスの場合は、カメラアプリケーションを次の設定に調整します:フラッシュオフ、トップショットの無効化、明るさと影の自動調整の無効化、写真の解像度をフルに設定します。
注意: 電話でカメラアプリケーションを使用すると、通常よりもバッテリーの寿命が短くなるため、外部電源を使用することをお勧めします。 - 携帯電話を顕微鏡に取り付けたら、データの取得に使用する対物レンズを含むスケールマイクロメータの画像を撮影します。この研究のデータは、40x 0.65 NAの対物レンズで取得され、電話アダプターは10x接眼レンズに取り付けられました。電話のズームを2.5倍に調整し、一定のピクセルサイズを維持するために一貫性を保ちます。
- 鞘の中心には、胞子と感染する付着器の最大濃度が収容されています。したがって、統計分析のために有意な数を得るために、各シースの9〜12枚の画像を目指してください。胞子と付着器の数は、適用される胞子の濃度によって異なります。
4. ImageJを用いた画像評価と計数(フィジー)
- ImageJ (FIJI) を実行しているコンピューターにイメージを転送します。画像を開くには、ファイルを ImageJ バーにドラッグアンドドロップします。
- ステージマイクロメータ画像をロードし、スケールの2つのマーキングの間に直線を引くことにより、画像のスケールを設定します。[スケール の設定]を開き、計測するラインの [既知の距離 ]と入力し、スケールの単位を入力します。マイクロメータでは、この例では、最小の線は10μmでした。[ グローバルに設定] チェックボックスをオンにして、[ OK]をクリックします。それ以降に読み込まれるすべての画像は同じスケールになります。
- 付着器、胞子、またはその他のオブジェクトをカウントするには、 ポイント ツールを選択します。次に、 ROIマネージャーを開きます。キーボードの T キーをクリックして、リストにポイントを追加します。これらの関心領域は、必要に応じて保存し、同じ画像に再読み込みできます。
- 実験目標に応じて、胞子の長さ、付着器のサイズ、生殖管の長さなどの追加の測定を行います。
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Representative Results
この手法の初期ワークフローを 図 1 に示します。鞘は、14日齢の影響を受けやすい「レイシー」大麦植物(H. vulgare)から収穫されました。分生子は、10日齢の胞子形成 M. oryzae OMAプレートから採取し、滅菌ddH2Oを使用して、最終濃度5 x 104 胞子/mLで調製した分生子懸濁液を用いて調製した。接種材料懸濁液を葉鞘に直接適用し、葉鞘は滅菌ペトリプレートに固定した。プレートを光なしで48時間暖かく湿ったチャンバーに保管した。インキュベーション期間の後、葉鞘をトリパンブルーで染色し、イメージング用に準備しました。
感染部位は、スマートフォンとスマートフォンの顕微鏡アダプターを使用して画像化されました。 M. oryzaeの試験株のそれぞれについて、最低10枚の画像が記録された。実験を、各真菌株について最低30枚の画像に対して3回繰り返した。 図2A は、成功したシースアッセイの代表的な結果を、参照用の染色されていない画像と不適切に染色した画像とともに示しています。
仮説に応じて、これらの画像はさまざまな方法で定量化および分析できます。この実験では、接種後48時間で、生胞子(発芽胞子)の総数を、付着器の数と感染に成功した細胞の数とともにカウントしました。オオムギ感染の背景にある2,000のランダムに変異誘発された M. oryzae 株のコレクションが実験室で生成されました。スプレー接種とドロップ接種を用いた病原性アッセイでは、野生型( M. oryzae 変異体の一般的な表現型)と比較して病変サイズが縮小された多くの変異体が明らかになりました11。これらの表現型を分解するために、病変サイズの縮小は、葉鞘アッセイ を介して 最も簡単にテストできる初期の感染ステップ(胞子発芽、付着形成、浸透ペグ形成、初期表皮細胞コロニー形成)の1つの阻害によって引き起こされたという仮説が立てられました。突然変異誘発プロジェクトからの有望な候補は、J99A12という名前の前方遺伝子を使用して同定されました。この変異体は、スクリーニング中に窒素欠乏または活性酸素条件のいずれに対しても感受性を示さなかった。追跡実験中、J99Aは疎水性表面にかなりの数の付着器を生成しましたが、生きたオオムギでは病変サイズが小さくなりました。鞘アッセイを使用してテストしたところ、J99Aは、葉鞘を貫通するが、一度中に入ると侵襲性の菌糸を生成しない付着器と浸透ペグの開発に成功し、感染が浸透ペグで停止することを示唆しています(図2B)。首尾よく感染した細胞は、葉鞘の組織内の感染性菌糸の存在によって同定された。付着器の数と感染細胞の数を比較すると、付着器の感染に成功した割合が得られました。野生型4091-5-8では、付着器の87%が細胞への侵入とコロニー形成に成功しましたが、変異型J99Aでは、細胞内に菌糸を持っていた付着器は36%に過ぎませんでした12。
図1:生後10日齢の大麦から収穫し、エタノールで洗浄した道具で慎重に取り除いた葉鞘。 分生子を採取し、滅菌水で濃度をミリリットル当たり0.5〜1.0×105 に調整する。単離されたシースは60cmのペトリプレートの内側にテープで留められ、分生子懸濁液がシースに装填されます。接種されたサンプルは、湿度のためにお湯のビーカーで、暗所で室温に保たれます。サンプルを45%酢酸+ 0.1%トリパンブルーで40°Cで1〜2時間染色し、接種後48時間、60%グリセロールで3回すすぎます。染色されたサンプルがマウントされ、画像化されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:染色プロトコルからの代表的な結果 。 (A)染色プロトコルからの逸脱は、最適ではない結果をもたらす可能性があります。熱と酢酸は葉の組織をやさしく柔らかくするのに役立ちます。60%グリセロールでの染色後のすすぎは、余分な汚れを取り除くだけでなく、葉によって引き起こされる光散乱を減らし、画質を向上させるのに役立ちます。スケールバー = 50 μm。 (B)葉組織への侵襲性菌糸の産生をもたらした4091WTの成功した試みと比較して、J99Aの浸透の失敗およびその後の感染の試み(矢じり)を見るこのアッセイにおける堅牢性を示す代表的な画像。スケールバー= 50μm。すべての画像は感染後48時間で撮影されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
M. oryzae株を試験するために利用できる多くの一般的に使用されるアッセイがあり、スプレーまたは飛沫接種などの適合性または不適合の感染反応の巨視的レベルの視覚を提供し、病変サイズを定量化するための評価システムの使用13,14。M. oryzaeの別の一般的なアッセイは、病原体がその特殊な浸透構造であるapppressorium15を形成する能力をテストすることです。ここで説明するのは、より容易な大麦植物において、細胞レベルで初期の感染プロセスの変化を迅速かつ効率的に観察するための簡単な方法である。この方法は、一般的な実験装置とスマートフォンを使用してデータを取得するという点で独特です。この方法は、カメラを装備したコンピューター制御の顕微鏡の必要性を否定し、このプロトコルをあらゆるラボにとって手頃な価格にします。この方法を用いて、我々は、どのステップで変異型J99A感染が停止したかを特定することができたが、これは以前の実験では明らかにできなかった疑問である。
イネにおける M. oryzae の感染過程、特に最初の数個の表皮細胞のコロニー形成は、蛍光タンパク質、マーカー、色素、共焦点イメージング、および高度な顕微鏡を使用してよく画像化されています16。これらのタイプのイメージング実験は、費用と時間がかかり、特定の専門知識が必要です。相同組換えを使用する多くの研究室では、M . oryzae の遺伝子変異体を作成して、感染サイクルにおける個々の遺伝子の役割を分析することができますが、基礎となる細胞生物学を探索するために必要な高度な機器や専門知識にアクセスできない場合があります。このプロトコルは、複合光学顕微鏡とスマートフォンのみを使用してデジタル画像をキャプチャし、固定された葉鞘組織のzスタックタイプのビデオを生成することにより、このギャップを埋めることを目的としています。この方法では、組織内のいくつかの細胞層をイメージングし、最大48時間侵襲的な真菌菌糸を捕捉することができます。米と大麦の葉鞘は同様の特徴を持っています。それらはほんの数個の細胞層の厚さであり、葉緑体が少ないため、画像化が容易です。上記のように、オオムギはイネよりも疎水性が低く、成長が容易であり、M. oryzaeの多くの株がイネやオオムギに感染を引き起こす可能性があるため、この実験はより複雑なイネアッセイと簡単に交換できます。
この方法のいくつかの制限には、フレームレートのzインクリメントが不明なため、スマートフォンのビデオ機能を使用してzフィールドデータを収集することが含まれます。別の制限は、固定組織(生細胞ではない)を必要とすることです。ただし、プロトコルの速度と容易さのために、この制限は感染後のさまざまな時点を調べることで克服できます。
プロトコルの最も重要なステップの1つは、適切な染色です。不適切なすすぎは、スライド調製物中に過剰な染料を引き起こし、染料の飽和を引き起こし、病原体組織を葉組織と区別がつかなくする。一方、アンダー染色は、病原体組織が葉組織と対比するのを防ぎます。
前述の方法は、多くの科学的質問に適応可能であり、真菌変異体の評価、オオムギ植物のさまざまな程度の遺伝学的耐性の評価、および以前に適用された真菌防除方法の効率のテストに使用できます。この方法を他の植物 - 病原体相互作用、特に他の単子葉葉鞘に拡張することも可能である。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、USDA-NIFA賞2016-67013-24816からの資金提供を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
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