Summary
בדיקת הקרוסלינקינג הכימי BS3 חושפת ביטוי קולטן GABAמופחת בפני השטח של התא במוחות עכברים בתנאי לחץ פסיכו-סוציאלי כרוניים.
Abstract
חרדה היא מצב רגשי המשפיע באופן משתנה על התנהגויות בעלי חיים, כולל תפקודים קוגניטיביים. סימנים התנהגותיים של חרדה נצפים ברחבי ממלכת החי וניתן לזהות אותם כתגובות אדפטיביות או לא מסתגלות למגוון רחב של שיטות לחץ. מכרסמים מספקים מודל ניסיוני מוכח למחקרים תרגומיים העוסקים במנגנונים אינטגרטיביים של חרדה ברמה המולקולרית, התאית והמעגלית. בפרט, פרדיגמת הלחץ הפסיכו-סוציאלי הכרוני מעוררת תגובות לא מסתגלות המחקות פנוטיפים התנהגותיים דמויי חרדה/דיכאון המקבילים בין בני אדם למכרסמים. בעוד שמחקרים קודמים הראו השפעות משמעותיות של סטרס כרוני על תכולת המוליכים העצביים במוח, ההשפעה של סטרס על רמות קולטני המוליכים העצביים אינה נחקרת. במאמר זה אנו מציגים שיטה ניסיונית לכימות רמות פני השטח העצביים של קולטני מוליכים עצביים בעכברים תחת לחץ כרוני, במיוחד תוך התמקדות בקולטני חומצה גמא-אמינובוטירית (GABA), אשר מעורבים בוויסות של רגש וקוגניציה. באמצעות שימוש בקרוסלינקר כימי בלתי הפיך בלתי חדיר ממברנה, bissulfosuccinimidyl suberate (BS3), אנו מראים כי לחץ כרוני מפחית באופן משמעותי את זמינות פני השטח של קולטני GABAA בקליפת המוח הקדם-מצחית. רמות פני השטח העצביים של קולטני GABAA הן התהליך המגביל את קצב ההולכה העצבית של GABA ולכן יכולות לשמש כסמן מולקולרי או כייצוג של מידת הפנוטיפים דמויי חרדה/דיכאון במודלים ניסיוניים של בעלי חיים. גישת הצלבה זו ישימה למגוון מערכות קולטנים עבור מוליכים עצביים או נוירומודולטורים המתבטאים בכל אזור במוח וצפויה לתרום להבנה עמוקה יותר של המנגנונים העומדים בבסיס הרגש והקוגניציה.
Introduction
קולטני מוליכים עצביים ממוקמים על פני השטח של קרום הפלזמה העצבי או באופן תוך-תאי על האנדוממברנות (למשל, האנדוזום, הרשתית האנדופלסמית [ER], או המנגנון הטרנס-גולגי) ונעים באופן דינמי בין שני תאים אלה בהתאם למצבים פיזיולוגיים פנימיים בנוירונים או בתגובה לפעילות חיצונית של הרשת העצבית 1,2. מאחר שמוליכים עצביים חדשים מפרישים את תפקודיהם הפיזיולוגיים בעיקר דרך מאגר הקולטנים המקומי, רמות קולטני פני השטח של מוליך עצבי נתון הן אחד הגורמים הקריטיים ליכולת האיתות שלו בתוך המעגל העצבי3.
קיימות מספר שיטות לניטור רמות קולטני פני השטח בתאי עצב בתרבית, כולל בדיקת ביוטינילציה של פני השטח4, בדיקת אימונופלואורסצנטיות עם נוגדן ספציפי בתנאים שאינם חדירים, או שימוש בטרנסגן קולטן המאוחה גנטית עם אינדיקטור אופטי פלואורסצנטי רגיש ל- pH (למשל, pHluorin)6. לעומת זאת, גישות אלה מוגבלות או לא מעשיות בעת הערכת רמות קולטני פני השטח in vivo. לדוגמה, הליך ביוטינילציה על פני השטח עשוי שלא להיות מעשי לעיבוד כמויות גדולות ומספרי דגימה של רקמות מוח in vivo בשל מחירו הגבוה יחסית והצעדים הבאים הדרושים לטיהור חלבוני הביוטינילציה על חרוזים מצומדים של אבידין. עבור תאי עצב המשובצים בארכיטקטורה תלת-ממדית של המוח, נגישות נמוכה של נוגדנים או קשיים בכימות מבוסס מיקרוסקופ עשויים להוות מגבלה משמעותית להערכת רמות קולטני פני השטח in vivo. כדי להמחיש את התפלגות קולטני המוליכים העצביים במוחות שלמים, ניתן להשתמש בשיטות לא פולשניות, כגון טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים, כדי למדוד את תפוסת הקולטנים ולהעריך את רמות קולטני פני השטח7. עם זאת, גישה זו מסתמכת באופן קריטי על זמינותם של ליגנדות רדיו ספציפיות, ציוד יקר ומומחיות מיוחדת, מה שהופך אותה לפחות נגישה לשימוש שגרתי על ידי רוב החוקרים.
במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה ורב-תכליתית למדידת רמות קולטני פני השטח במוחות של חיות ניסוי ex vivo באמצעות קרוסלינקר כימי מסיס במים ואטום לקרום, bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)8,9. BS3 מכוון לאמינים ראשוניים בשרשרת הצדדית של שאריות ליזין ויכול להצליב חלבונים באופן קוולנטי בסמיכות זה לזה. כאשר פרוסות מוח מוכנות מאזור מעניין ומודגרות במאגר המכיל BS3, קולטני פני השטח של התא מוצלבים עם חלבונים שכנים, וכך הופכים למינים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר, בעוד שהקולטנים הקשורים לרירית הרחם התוך-תאית נותרים ללא שינוי. לכן, ניתן להפריד את מאגרי הקולטנים הפני השטח והתוך תאיים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) ולכמת על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדנים ספציפיים לקולטן הנחקר.
עקה כרונית קלה בלתי צפויה (UCMS) היא פרדיגמה ניסיונית מבוססת היטב לגרימת לחץ פסיכו-סוציאלי כרוני במכרסמים10. UCMS מעורר פנוטיפים התנהגותיים דמויי חרדה/דיכאון וליקויים קוגניטיביים באמצעות אפנון של מערך של מערכות נוירוטרנסמיטרים, כולל GABA והקולטנים שלה10,11. בפרט, קולטן GABA A המכיל תת-יחידה α5 (α5-GABAA R) מעורב בוויסות הזיכרון והתפקודים הקוגניטיביים12,13, דבר המצביע על מעורבות אפשרית של תפקודים משתנים של תת-יחידה זו בליקויים קוגניטיביים הנגרמים על ידי UCMS. בפרוטוקול זה, השתמשנו בבדיקת BS3 crosslinking כדי לכמת רמות של α5-GABAAR מבוטא בפני השטח בקליפת המוח הקדם-מצחית של עכברים שנחשפו ל-UCMS בהשוואה לעכברי ביקורת שאינם בסטרס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל עבודת בעלי החיים בפרוטוקול זה הושלמה בהתאם לחוק אונטריו לבעלי חיים למחקר (RSO 1990, פרק A.22) והמועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC) ואושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים.
1. הכנת בעלי חיים
- לקבוע את מספרי בעלי החיים שישמשו בניסויים, ולחלק אותם לקבוצות מתאימות או לקבוצות ניסוי. ראה פרק הדיון לדיון על גודל הקבוצה, מין וכוח סטטיסטי.
הערה: פרוטוקול זה מותאם אישית לעכברים (זן C57BL6/J; גיל 2-4 חודשים; בדרך כלל 20-30 גרם משקל גוף; מספר שווה ערך של זכרים ונקבות לשימוש). - הניחו את בעלי החיים תחת UCMS או שלטו בתנאים שאינם בסטרס למשך 5-8 שבועות, בהתאם לפרוטוקול כפי שתואר קודםלכן 14.
- לאחר הליך UCMS האחרון, אפשר לבעלי החיים להישאר בכלובים הביתיים שלהם במשך יום אחד לפני השימוש בהם לבדיקת crosslinking כדי למנוע השפעות לחץ חריפות על ביטוי הקולטן.
2. הכנת פתרונות המלאי
- הכינו ואחסנו את הפתרונות הבאים בהתאם להוראות לפני הבדיקה.
- הכן 5 M NaCl על ידי המסת 14.6 גרם של NaCl ב 40 מ"ל של מים deionized. יש לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
- הכן 1.08 M KCl על ידי המסת 3.22 גרם KCl ב 40 מ"ל של מים נטולי יונים. יש לאחסן ב-RT.
- הכן 400 mM MgCl 2 על ידי המסת 3.25 גרם של MgCl 2·6H2 O ב 40 מ"ל של מים deionized. יש לאחסן ב-RT.
- הכן גליצין 1 M על ידי המסת 3 גרם גליצין ב 40 מ"ל של מים deionized, ולאחסן ב 4 ° C.
- הכן 1 M dithiothreitol (DTT) על ידי המסת 1.54 גרם של DTT ב 10 מ"ל של מים deionized. סנן לעקר אותו דרך מסנן עם גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר, ו aliquot לתוך צינורות 2 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
- הכינו 10% Nonidet-P40 (NP-40) על ידי דילול ביחס של 1:10 (v/v) במים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן ב-RT.
- הכינו 0.5 M EDTA (pH = 8.0), ואחסנו ב-RT.
- הכינו חיץ HEPES של 1 M (pH = 7.2-7.5), ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
- הכינו 2.5 M או 45% (w/v) גלוקוז, ואחסנו ב 4 °C.
3. הכנת תחנת העבודה
- ביום בדיקת הקרוסלינקינג BS3, אספו את החומרים הבאים בחדר הדיסקציה של בעלי החיים (איור 1), עם כמה פריטים מקוררים מראש על קרח: דלי קרח, גוש טמפרטורה מתכתי (מקורר מראש על קרח), PBS קר כקרח בצינור חרוטי של 50 מ"ל ו-PBS קפוא בצלחת פטרי, נייר סינון רטוב ב-PBS ומונח על משטח שטוח מצונן או קרח כחול, מטריצה מוחית (מרווח של 1 מ"מ להחדרת סכין גילוח) מקוררת מראש על קרח, סכיני גילוח (~10) מקוררים מראש על קרח, כלי דיסקציה (מספריים, מלקחיים, בדיקה מעוקלת), ניקוב רקמות, נייר ניגוב תרסיס אתנול 70% ומגבות נייר, קצות פיפט (200 מיקרוליטר), פיפטור (P200), שעון עצר, כרית תזכיר, עט ושפופרות מיקרוצנטריפוגות (1.5 מ"ל).
- לפני הבדיקה, תייג את צינורות המיקרוצנטריפוגות עם פרטי הדגימה (למשל, מספר תעודת זהות של בעלי חיים, סוג הטיפול [UCMS לעומת ללא לחץ (NS)], אזור המוח, עם או בלי BS3 וכו ').
הערה: עבור מבחני BS3 crosslinking, יש לאסוף שתי דגימות מכל אזור במוח; דגימה אחת תשמש לקרוסלינקינג (עם BS3) והשנייה לתגובה שאינה קרוסלינקינג (ללא BS3) כבקרה. לכן, כדי לדגום משני אזורי מוח (כלומר, קליפת המוח הקדם-מצחית [PFC] וההיפוקמפוס [HPC]) ב-12 עכברים, יש לסמן 48 צינוריות לדגימה ראשונית (= 2 דגימות ×-2 אזורים ×-12 עכברים) (שישמשו בסעיף 6). סמן שני סטים נוספים של 48 צינורות לאחסון מאוחר יותר (לאחסון שני נפחים שונים [100 μL, 300 μL] של כל דגימה) (שישמשו בסעיף 7). לפיכך, נדרש לסמן 144 צינורות בסך הכל עבור גודל קבוצה זו.
- לפני הבדיקה, תייג את צינורות המיקרוצנטריפוגות עם פרטי הדגימה (למשל, מספר תעודת זהות של בעלי חיים, סוג הטיפול [UCMS לעומת ללא לחץ (NS)], אזור המוח, עם או בלי BS3 וכו ').
- בנוסף, יש לוודא כי קיים במעבדה הציוד הבא: מיקרוצנטריפוגת קירור שולחנית, סוניקטור, מסובב צינורות (לשימוש בחדר הקירור או בתוך המקרר [4°C]), מקפיא (-80°C) לאחסון דגימות, ודלי קרח יבש לאחסון זמני של הדגימות (לשימוש בסעיף 7)
4. הכנת פתרונות העבודה והמאגרים
הערה: בבוקר הבדיקה, הכינו את הפתרונות הבאים. חישוב זה מבוסס על הפתרונות הדרושים לעיבוד שני אזורי מוח (כלומר, PFC ו-HPC) מ-12 עכברים.
- הכינו נוזל מוחי מלאכותי (aCSF, pH = 7.4) כפי שמוזכר בטבלה 1. יש לפזר 750 μL של aCSF לכל צינור דגימה (48 הצינורות המסומנים בשלב 3.1.1), ולהניח אותם בגוש טמפרטורת המתכת על קרח כדי לקרר מראש את החיץ.
- הכינו את מאגר הליזיס כפי שמוזכר בטבלה 2. יש לאחסן על קרח (400 מיקרוליטר לשימוש בכל דגימה).
- הכינו תמיסת מלאי BS3 של 52 mM (26x) במאגר נתרן ציטראט של 5 mM (pH = 5.0).
- ראשית, להכין 100 mM חומצת לימון (ציר A) ו 100 mM נתרן ציטראט (מלאי B).
- לדלל מלאי A ומלאי B ביחס של 1:20 עם מים נטולי יונים. הוסף 100 μL כל אחד ל 1.9 מ"ל מים כדי להכין 5 mM חומצת לימון (ציר C) ו 5 mM נתרן ציטראט (מלאי D), בהתאמה.
- ערבבו 410 מיקרוליטר של מלאי C ו-590 מיקרוליטר של מלאי D כדי להכין מאגר נתרן ציטראט של 5 מילימטר (pH = 5.0) (תמיסה E, 1 מ"ל).
- אשר את ה- pH של פתרון E באמצעות רצועת מחוון pH.
- להמיס 24 מ"ג של BS3 ב 806.4 μL של תמיסה E על ידי מערבול במשך 30 שניות כדי להכין את תמיסת מלאי BS3 (26x).
- הכן עוד 1 מ"ל של תמיסה E לשימוש כבקרת רכב עבור דגימות שאינן crosslinking.
הערה: הכן פתרון מלאי BS3 כאשר כל השאר מוכן והניסוי עומד להתחיל. BS3 צריך להיות מאוחסן מיובש ב 4 ° C עד לשימוש. לאחר ההרכבה מחדש, BS3 נשאר פעיל רק במשך כ ≤3 שעות. מכיוון שה- pH של חיץ הנתרן ציטראט 5 mM (תמיסה E) מדווח לעלות עם הזמן, מה שגורם להידרוליזה מואצת BS3, מומלץ שתמיסה E תהיה מוכנה טרייה מתמיסות מלאי A ו- B9. בשל המסיסות המוגבלת של BS3 בטמפרטורות נמוכות, שמור את BS3 המשוחזר ב- RT. השתמש ב- BS3 המשוחזר תוך 3 שעות, ואל תקפיא / תפשיר או תעשה שימוש חוזר ב- BS3 המשוחזר.
5. דיסקציה של רקמות המוח
הערה: משלב זה ואילך, לפחות שני אנשים צריכים לעבוד יחד באופן מתואם. בעוד אדם אחד מתמקד בנתיחת בעלי חיים (שלבים 5.2-5.10 ושלב 6.3), האדם השני צריך לעבוד כשומר זמן ולעזור לתאם את הבדיקה (שלב 5.1, שלב 6.1, שלב 6.2, שלב 6.4 ושלב 6.5)
- הביאו את בעל החיים הראשון לנתיחה מאזור הדיור לחדר הנתיחה.
הערה: מכיוון שגורמי עקה חריפים (למשל, סביבה חדשה, ריח של דם) עשויים להשפיע על הדינמיקה של חלבוני המוח, יש להחזיק את בעלי החיים בכלובים הביתיים שלהם הממוקמים הרחק מאזור הדיסקציה ולאחר מכן להביא אותם בנפרד לחדר הדיסקציה לעריפת ראשים מיידית. - הרדימו את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם ואחריו עריפת ראש. הוציאו את המוח במהירות מהגולגולת, והטביעו אותו ב-PBS קר כקרח בצלוחית פטרי למשך 10-15 שניות (איור 2).
הערה: בעלי החיים אינם מורדמים לניסויי BS3 מכיוון שכל חומר הרדמה עלול להשפיע על רמת הצגת פני השטח של קולטני המוליכים העצביים9. - מקמו את המוח המצונן בתוך מטריצת המוח על קרח, כשהצד הגחוני של המוח פונה כלפי מעלה (איור 3).
- הכניסו את סכין הגילוח הראשון דרך הגבול שבין פקעת הריח לפדונק חוש הריח כדי לחתוך את המוח באופן קורונלי (איור 4). באמצעות שלושה עד ארבעה סכיני גילוח נוספים, חתכו סדרתית את החלק הקדמי של המוח באופן קורונלי במרווחים של 1 מ"מ.
- הרימו את פרוסות העטרה ממטריצת המוח על ידי החזקת כל סכיני הגילוח שהוחדרו יחד, ומשאירים את החלק האחורי של המוח מאחור במטריצת המוח. השתמשו במלקחיים כדי להפריד את סכיני הגילוח זה מזה, והניחו אותם על המשטח השטוח והצונן כשפרוסת המוח פונה כלפי מעלה (איור 5).
- זהה את הפרוסות המכילות את אזור העניין. לדגימת ה-PFC, בחרו את הפרוסה השנייה והשלישית אחורית לפרוסה הראשונה המכילה את פדונקל חוש הריח.
- הסר את אזור העניין באמצעות ניקוב רקמה (וידאו 1), הנח אותו בצד על סכין הגילוח המצונן, וחלק את הרקמה באופן שווה לשניים (למשל, רקמות מההמיספרה השמאלית לעומת הימנית, כאשר חצי אחד ישמש לתגובת הקישור הצולבת BS3 והחצי השני לבקרת אי-הצלבה אם חלבון המטרה המעניין מתבטא באופן שווה בשתי ההמיספרות).
- טחנו כל רקמה לחתיכות על סכין הגילוח באמצעות הקצה הדק של המלקחיים בתנועות אנכיות מרובות כנגד הלהב (סרטון 2) במקום למעוך או לטחון את הרקמות. זה ימקסם את שטח הפנים הנגיש ל- BS3 מבלי לפגוע קשות בשלמות הממברנה של התאים. מיד לאחר הטחינה, להעביר את הרקמות הטחונות לתוך צינורות המתאימים (ראה שלב 6.3).
- לצורך דגימת HPC, הוציאו את החלק האחורי של המוח מהמטריצה, והניחו את המוח על נייר סינון לח על המשטח השטוח המצונן, כשהצד הגבי פונה כלפי מעלה (איור 6).
- באמצעות בדיקה מעוקלת ומלקחיים, והתקרבות מהצד הגבי (סרטון 3), נתחו את ה-HPC (חצי גבי, חצי גחוני או שניהם) משני חצאי הכדור (חצי אחד עבור BS3 crosslinking והחצי השני עבור הבקרה). טחנו כל רקמה כמו בשלב 5.8, והעבירו את הרקמה לצינורות מתאימים (ראו שלב 6.3).
הערה: יש לשמור את כל זמן הדיסקציה של כל בעל חיים על ~ 5 דקות כדי שתנאי הניסוי והתוצאות יהיו עקביים.
6. תגובת Crosslinking
- הביאו את בעל החיים הבא לנתיחה מאזור הדיור לחדר הדיסקציה כאשר נתיחת המוח של העכבר הקודם עומדת להסתיים (שלב 5.10).
- יש להקציף את הצינור המצונן מראש על קרח (משלב 4.1) עם 30 μL של תמיסת BS3 (26x) או תמיסת רכב E ממש לפני שהרקמות הטחונות מוכנות להעברה לצינורות המתאימים. החלף את קצות הצינור בין הצינורות כדי לוודא שאין BS3 מזוהם בצינורות הבקרה ללא הצלבה.
- העבר את הרקמות הטחונות (משלב 5.8 ושלב 5.10) לצינורות המתאימים, ולאחר מכן התחל לנתח את החיה הבאה (שלב 5.2)
- הפוך וערבב את הצינור כדי לפרק את גושי הרקמה לחתיכות קטנות יותר (וידאו 4), והתחל לדגור את הדגימות על מסובב הצינור בחדר הקר למשך 30 דקות עד שעתיים. רשום את זמן ההתחלה של דגירה BS3 עבור כל צינור. עיין בסעיף הדיון לקבלת זמן הדגירה האופטימלי.
- להרוות את התגובה על ידי זינוק הצינור עם 78 μL של 1 M גליצין, ועוד לדגור את הדגימה במשך 10 דקות ב 4 ° C עם סיבוב קבוע. רשום את שעת ההתחלה והסיום של המרווה עבור כל צינור. המשך לסייע לאדם המתמקד בנתיחת בעלי החיים על ידי הבאת בעל החיים הבא (שלב 6.1) ועזרה בקרוסלינקינג (שלב 6.2).
הערה: התייחס לכל דגימה באותו תזמון בדיוק בכל הדגימות. אם חדר הנתיחה מרוחק מחדר הקור, מומלץ מאוד לגייס אדם שלישי שישתתף בדגירה ובהמרווה הדגימה בחדר הקר.
7. ליזה רקמות, הכנת חלבונים וכתם מערבי
- לאחר 10 דקות של מרווה (שלב 6.5), סובבו את הדגימות בטמפרטורה של 20,000 x גרם בטמפרטורה של 4°C למשך 2 דקות, והשליכו את הסופרנטנט. אם אדם שלישי זמין, המשך לשלב 7.2; אחרת, הקפיאו את הדגימות על קרח יבש, והשהו את הבדיקה כאן עד להשלמת הדיסקציה המוחית (סעיף 5) וההצלבה (סעיף 6) עבור כל בעלי החיים.
- הוסף 400 μL של חיץ ליזה קר כקרח לכל צינור.
- סוניק את הדגימות במשך 1 s חמש פעמים עם מרווחים של 5 שניות ביניהם, תוך שמירה על הדגימות על קרח.
- ספין דגימות ב 20,000 x גרם במשך 2 דקות כדי לסובב החוצה פסולת רקמות מסיסים (גלולה), ולהציל את supernatant.
- השתמש 5 μL של supernatant למדידת ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביכונעימה (BCA).
- מחלקים את שאר הסופרנאטנט לשני צינורות; צינור אחד מכיל 100 μL של supernatant עבור הכתם המערבי הבא, ואת הצינור השני מכיל את השאר (~ 300 μL) לאחסון לטווח ארוך ב -80 ° C. הוסף כמות מתאימה של מאגר דגימות 4x SDS (בתוספת β2-מרקפטואתנול) לדגימות, ודגור ב-70°C למשך 10 דקות.
- הפעל 10-20 מיקרוגרם חלבון לכל באר על ג'ל אקרילאמיד לאלקטרופורזה (SDS-PAGE), ולאחר מכן העבר חלבונים לקרום פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) לניתוח כתמים מערביים.
- חסום את קרום PVDF בחלב רזה של 5% (w/v) מומס במי מלח חוצצים Tris המכיל 0.1% Tween-20 (TBS-T) למשך שעה אחת ב- RT.
- שטפו בקצרה את הממברנה פעמיים עם TBS-T, ודגרו עליה עם הנוגדן העיקרי המדולל ב-TBS-T למשך הלילה ב-4°C.
- שטפו את הנוגדן הראשוני שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת ב-TBS-T ב-RT.
- לדגור על הממברנה עם נוגדן משני מצומד חזרת peroxidase מדולל TBS-T במשך 1 שעה ב RT.
- שטפו את הנוגדן המשני שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת ב-TBS-T ב-RT.
- לדגור על הממברנה בריאגנט כימילומינסנציה משופר, ולזהות את האות באמצעות מנגנון תיעוד הג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את ההיתכנות של בדיקת BS3 crosslinking להערכת רמות α5-GABA A R של פני השטחב-PFC של עכבר, הרצנו 10 מיקרוגרם כל אחת מדגימות החלבון BS3-crosslinked ו-non-crosslinked ב-SDS-PAGE וניתחנו את החלבונים לפי כתם מערבי באמצעות נוגדן אנטי-α5-GABAAR (רב-שבטי ארנב) (איור 7). דגימות החלבון הלא מוצלבות נתנו את הכמות הכוללת של α5-GABA A R ב~55 kDa, בעוד שדגימות החלבון המוצלבות BS3 נתנו כמות מסוימת של α5-GABA A R הקשור לרירית הרחם (נודדת ב~55 kDa) יחד עם מיני חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר המייצגים קומפלקסים חלבוניים מוצלבים קוולנטית ל- α5-GABAAR. לצורך כימות רמות פני השטח α5-GABA A R, אנו יכולים להעריך את מידת הדלדול של α5-GABAAR ב~55 kDa מהמאגר הכולל בעת הצלבה, כאשר תת-היחידה עוברת למיקומי משקל מולקולרי גבוהים יותר. מעשית, ניתן לחשב את רמות פני השטח של α5-GABA A R על ידי הפחתת כמות α5-GABA A R המשויכת לרירית הרחם (ב~55 kDaבנתיב הדגימה הצולב) מסך רמות α5-GABAAR (ב~55 kDa בנתיב הדגימהשאינו מוצלב).
לאחר מכן הערכנו את ההשפעות של UCMS (לאחר 3 שבועות ו-5 שבועות) על פני השטח ואת רמות α5-GABAAR הכוללות ב-PFC של עכבר. בניסוי זה, על מנת לעקוב אחר מהלך הזמן של תגובת ההצלבה, הכנו את הדגימות בשעה אחת, שעתיים ו-3 שעות לאחר הוספת BS3. מכיוון שנראה כי תגובות הצלבה של BS3 הגיעו לרמה של 2 שעות, הנתונים בנקודת הזמן של שעה אחת שימשו להתוויית הגרף. הבחנו בירידה משמעותית והדרגתית ברמות α5-GABAAR על פני השטח ב-PFC לאחר 3 שבועות ו-5 שבועות של UCMS, בהשוואה לעכברים ללא בקרת עקה (איור 8). הנתונים הראו שינויים זניחים או ללא שינויים נראים לעין ברמות הקולטן הכולל בתנאי ניסוי אלה, דבר המצביע על כך שלחץ כרוני השפיע באופן ספציפי על סחר α5-GABAAR לפני השטח של התא.
איור 1: כלי דיסקציה המשמשים בבדיקת הקרוסלינקינג BS3. נייר סינון נרטב ב-PBS קר כקרח ומונח על משטח שטוח של קרח כחול. צלחת פטרי מלאה PBS ומאוחסנת ב -20 ° C יום אחד לפני הבדיקה מונחת על קרח. מטריצת המוח וסכיני הגילוח מקוררים מראש על קרח. מספריים (אחד גדול, אחד קטן), מלקחיים (אחד גדול, כמה קטנים) וניקוב רקמות כולם מנוקים לפני הבדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מוח עכבר שלם מנותח מתוך הגולגולת ומונח ב-PBS קר כקרח. מיד לאחר שכל המוח הוסר מהגולגולת, הוא היה שקוע ב-PBS קר כקרח במשך 10-15 שניות בצלוחית פטרי על קרח. זה מאט את חילוף החומרים במוח וממזער את הסחר והפירוק של חלבונים תוך סיוע לרקמה להיות קשה יותר, מה שהופך את חיתוך המוח הבא לקל יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מוח עכבר הממוקם במטריצת המוח. מוח העכבר המצונן השקוע ב-PBS קר כקרח הועבר למטריצת המוח והונח כשהצד הגחוני פונה כלפי מעלה. סכיני הגילוח והמטריצה היו צוננים מראש על קרח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: חתך קורונלי של מוח עכבר במטריצת המוח. סכין הגילוח המצונן הראשון הוכנס דרך הגבול בין פקעת הריח לפדונק חוש הריח כדי להתחיל לחתוך את המוח באופן קורונלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מקטעים טוריים של העטרה במוח עכבר. החלק הקדמי של מוח העכבר נחתך באופן קורונלי על ידי החדרת חמישה סכיני גילוח באופן סדרתי לתוך מטריצת המוח (מרווחים של 1 מ"מ). כל הלהבים שהוחדרו הוחזקו יחד, הורמו מהמטריצה, הופרדו זה מזה באמצעות מלקחיים, והונחו על המשטח השטוח המצונן כשפרוסת המוח פונה כלפי מעלה. (למעלה משמאל) נורת הריח; (אמצע שמאל) החלק הראשון; החלק השני (למטה משמאל) והשלישי (למעלה מימין) שימשו לדגימת רקמות PFC; (מימין למטה) החלק הרביעי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: החלק האחורי של המוח לניתוח ההיפוקמפוס. לאחר שהחלק הקדמי של המוח נחתך באופן קורונלי באמצעות סכיני גילוח (משמאל), החלק האחורי של המוח (האמצעי) הוצא ממטריצת המוח והונח על נייר פילטר לח PBS על המשטח המצונן (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: BS3 crosslinking של GABAAR על פני התא. בנוכחות BS3, α5-GABA A R על פני קרום הפלזמה מוצלב (XL) עם חלבונים אנונימיים הקרובים אליו, כגון תת-יחידות GABA A R אחרות בתוךהרכבת GABAAR הפנטמרית או חלבוניםשכנים נוספים (X), אך לא עם חלבונים (Y) רחוקים ממנו. לפיכך, α5-GABAAR מופיע כמין חלבון בעל משקל מולקולרי גבוה (HMW) על הכתם. α5-GABAAR על האנדוזום נשאר שלם ונודד בגודל הצפוי של ~55 kDa. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: רמות α5-GABAAR של פני השטח המושפעות מ-UCMS. הן הרמות הכוללות והן רמות פני השטח של α5-GABAAR ב-PFC של עכברים בתנאים ללא עקה ו-UCMS (3 שבועות ו-5 שבועות) הוערכו. כדי לעקוב אחר מהלך הזמן של תגובת ההצלבה, הדגימות הוכנו בשעה אחת, שעתיים ושלוש שעות לאחר הוספת BS3. נעשה שימוש בנקבות עכברים (2-3 חודשים, N = 4/קבוצה). רמות α5-GABA A Rשלמות של 55 kDa עבור כל מצב נורמלו תחילה על ידי רמות αTubulin התואמות ולאחר מכן שימשו לחישוב רמות α5-GABAAR הכוללות והקשורות לרירית הרחם (מהדגימות ללא הצלבה [No Xlink] ו- Crosslinked [Xlink], בהתאמה). לאחר מכן, רמות קולטן פני השטח חושבו על ידי הפחתת הסכום הקשור לרירית הרחם מסך הרמות. מכיוון שנראה כי תגובות ההצלבה של BS3 הגיעו לרמה של 2 שעות, הנתונים בנקודת הזמן של שעה אחת שימשו להתוויית הגרף (ממוצע ± SEM). נצפו השפעות משמעותיות של לחץ כרוני על רמות α5-GABA A R על פני השטח, והשפעה זו הייתה תלוית משך UCMS, כאשר זוהתה ירידה הדרגתית ברמות α5-GABAAR על פני השטח לאורך תקופת UCMS. *p < 0.05, **p < 0.01 (מבחן קרוסקל-וואליס עם השוואות מרובות של דאן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| עבודה conc. | פתרון מלאי | כמות של פתרון מלאי לחלוקה |
| 1.2 מ"מ CaCl2 | 480 מילימטר (400x)* | 100 מיקרוליטר |
| 20 מ"מ HEPES | 1 מטר (50x) | 800 מיקרוליטר |
| 147 מ"מ NaCl | 5 מטר (34x) | 1176.5 מיקרוליטר |
| 2.7 mM KCl | 1.08 מטר (400x) | 100 מיקרוליטר |
| 1 מ"מ MgCl2 | 400 מ"מ (400x) | 100 מיקרוליטר |
| 10 מ"מ גלוקוז | 2.5 מטר (250x) | 160 מיקרוליטר |
| מים שעברו דה-יוניזציה | 37.563 מ"ל | |
| סך | 40 מ"ל | |
| * מלאי CaCl2 צריך להיות מוכן טרי ביום הניסוי. | ||
טבלה 1: הרכב נוזל המוח והשדרה המלאכותי.
| עבודה conc. | פתרון מלאי | כמות של פתרון מלאי לחלוקה |
| 25 מ"מ HEPES | 1 מטר (40x) | 500 μL |
| 500 מ"מ NaCl | 5 מטר (10x) | 2 מ"ל |
| 2 מ"מ EDTA | 0.5 מטר (250x) | 80 מיקרוליטר |
| 1 מ"מ DTT | 1 מטר (1000x) | 20 מיקרוליטר |
| 0.1% NP-40 | 10% (פי 100) | 200 מיקרוליטר |
| קוקטייל מעכב פרוטאז | פי 100 | 200 מיקרוליטר |
| מים שעברו דה-יוניזציה | 17 מ"ל | |
| סך | 20 מ"ל |
טבלה 2: הרכב חיץ הליזיס
וידאו 1: בידוד ה-PFC באמצעות ניקוב רקמות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 2: טחינת ה-PFC באמצעות מלקחיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 3: ניתוח HPC באמצעות בדיקה מעוקלת ומלקחיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 4: ערבוב היפוך של דגימת רקמות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות שההשפעה של לחץ פסיכו-סוציאלי כרוני על התנהגויות (כלומר, רגשיות וליקויים קוגניטיביים) ושינויים מולקולריים (כלומר, ביטוי מופחת של גנים GABAergic וליקויים נלווים בהולכה עצבית GABAergic) מתועדים היטב10, המנגנונים העומדים בבסיס ליקויים כאלה זקוקים לחקירה נוספת. בפרט, בהתחשב במחקר האחרון המראה כי מתח כרוני משפיע באופן משמעותי על הפרוטאום העצבי באמצעות עומס יתר על תפקודי המיון, ולכן, מתח מוגבר בחדר המיון15, נותרה שאלה האם מתח כרוני משפיע על סחר GABA A R דרך קרום המיון וכיצד שינוי הסחר או רמות פני השטח של GABAAR יכול להיות קשור סיבתית לפסיכופתולוגיה.
בדיקת BS3 crosslinking המוצגת בפרוטוקול זה תשמש כגישה רבת עוצמה לענות על חלק מהשאלות הללו. לדוגמה, UCMS ידוע כמעורר סדרה של שינויים התנהגותיים, כולל ליקויים קוגניטיביים, התנהגות דמוית חרדה ופנוטיפים אנהדוניים, בהתאם למשך UCMS10. לכן, ניתן יהיה לחקור את מסלול הזמן ואת מידת השינויים הנגרמים על ידי UCMS ברמות α5-GABAAR על ידי דגימת מוחות עכברים בנקודות זמן עוקבות מתחילת UCMS (למשל, שבוע, 3 שבועות, 5 שבועות), וניתן יהיה גם להצליב עם הפנוטיפים ההתנהגותיים שנצפו בכל נקודת זמן. תת-סוגים נוספים של GABAAR (למשל, α1, α2) והקולטן לנוירומודולטורים הידועים כמושפעים מלחץ כרוני (למשל, קולטן TrkB לגורם נוירוטרופי מוחי [BDNF])10 יכולים להיבדק בו זמנית באמצעות אותן דגימות. מאחר שחלק ממערכות הקולטנים ותת-הסוגים הללו מעורבים באופן סלקטיבי בתחומים התנהגותיים ספציפיים (למשל, הרגעה, חרדה, קוגניציה)11, כדאי להתאים את השינויים ההתנהגותיים לסוג ולדרגה של קולטנים המושפעים מ-UCMS בכל נקודת זמן.
להלן הנקודות הקריטיות שיש לקחת בחשבון עבור מספר שלבים בפרוטוקול. הצעד הראשון הוא לקבוע את המספר הדרוש והמספיק של בעלי חיים לשימוש בהתבסס על תכנון הניסוי וניתוח הכוח. לדוגמה, כדי לחקור את ההשפעה של סטרס כרוני על רמות קולטן GABAA על פני השטח, אנו מכינים באופן שגרתי קבוצה אחת של עכברים (N = 6 / מין) להיחשף ל- UCMS במשך 5 שבועות וקבוצה אחרת (N = 6 / מין) להישמר בתנאים ללא לחץ. גודל קבוצה זה (N = 24 בסך הכל, כולל שני המינים) צפוי לתת מספיק כוח סטטיסטי כדי לזהות הבדל ~ 20% ברמות הקולטן, ובכך לאפשר הערכה של השפעות מתח והשפעות מין. יש לציין כי דווח כי לחץ כרוני גורם להבדלים תלויי מין בתוצאות התנהגותיות ומולקולריות10. לדוגמה, נשים בדרך כלל נוטות יותר לפתח תסמיני דיכאון מאשר גברים. באופן עקבי, המחקרים שלנו המשתמשים במוחות אנושיים לאחר המוות ומכרסמים מצביעים על רמות גבוהות יותר של פתולוגיות התנהגותיות ומולקולריות אצל נשים; רמות נמוכות יותר של סומטוסטטין (SST), סמן מולקולרי לדיכאון, חזקות יותר בקרב נשים בקרב חולים מדוכאים16, ורגשנות מוגברת חזקה יותר במודלים של עכברים נשיים המשכפלים היבטים של פתולוגיה דיכאונית מאשר אצל גברים15,17. לכן, מומלץ שכל תכנון ניסויי המתייחס להשפעות של לחץ כרוני על תוצאות פסיכופתולוגיות צריך לכלול מספר מספיק של גברים ונשים כאחד כדי להבטיח כוח סטטיסטי בניתוח הנתונים ולזהות השפעות אפשריות תלויות מין.
זמן הדגירה האופטימלי עם BS3 צריך להיקבע בניסויי פיילוט עבור כל קולטן שייחקר. מדווח כי סחר קולטנים עשוי להתרחש לאט, אפילו בטמפרטורות נמוכות במהלך דגימה9. כדי ללכוד רמות קולטן פני שטח מדויקות בזמן דיסקציה מוחית, יהיה זה אידיאלי למזער את זמן הדגירה ולבחור את נקודת הזמן ממש לפני שתגובת הקישור מגיעה לרמה (30 דקות עד שעתיים ב -4 מעלות צלזיוס).
שמנו לב למספר מגבלות תפעוליות הקשורות למבחני קרוסלינקינג BS3. (1) ראשית, בשל זמן מחצית החיים הקצר יחסית (2-3 שעות) של BS3 הנגרם על ידי הידרוליזה ספונטנית בטווח החומציות הפיזיולוגי, יש להשלים את הדיסקציה של בעלי החיים ואת תגובת ההצלבה במסגרת זמן זו. זה הוביל אותנו להגביל את מספר בעלי החיים שאנחנו יכולים לנתח בכל פעם למקסימום של 12. אם הנסיין מתכנן לנתח יותר מ-12 בעלי חיים, מומלץ לחלק את קבוצת הניסוי למספר קבוצות, כאשר כל אחת מהן מכילה פחות מ-12 בעלי חיים. לאחר השלמת הבדיקה עבור קבוצה אחת, אצווה חדשה של BS3 צריכה להיות מוכנה לשימוש במבחני crosslinking הבאים עבור הקבוצה הבאה. באותה רוח, יש להגביל את מספר אזורי העניין שיש לנתח מבעל חיים אחד. אנו דוגמים באופן שגרתי משני אזורי מוח (PFC, HPC) עבור בדיקת ההצלבה, וזה המספר המרבי של אזורי מוח שאנו יכולים לנתח כדי לקבל תוצאות עקביות עם שונות מינימלית בין דגימות. (2) שנית, יש להעריך בקפידה את הספציפיות של הנוגדנים המשמשים בכתם המערבי. לתגובת ההצלבה הכימית BS3 עשויה להיות השפעה בלתי צפויה על האנטיגניות של החלבונים שזוהו על ידי כל נוגדן. מצאנו כי α5-GABA אחדAנוגדן R (המצוין ב טבלת חומרים) זיהה בטעות פס ~ 50 kDa חזק במיוחד בדגימות BS3-crosslinked, ללא קשר לנוכחות או היעדר α5-GABAAחלבון R במדגם; להקה ~ 50 kDa זו נראתה אפילו בדגימות רקמות מ- α5-GABAAעכברי נוקאאוט R, מה שמרמז על כך שנוגדן זה החל להגיב בהצלבה עם אנטיגנים לא רלוונטיים שנוצרו בטעות על ידי תגובת הקרוסלינקינג BS3. מומלץ לקבוע ביסודיות את ספציפיות הנוגדנים עם וללא תגובות crosslinking BS3, באופן אידיאלי באמצעות דגימות רקמת נוקאאוט, אם זמין, עבור חלבון נתון של עניין. (3) הפרוטוקול הנוכחי המתואר כאן אינו מתייחס לסוגי התאים שבהם כל GABAAתת-סוג R מבוטא (למשל, נוירונים ואסטרוציטים). עבור חלק GABAAתת-סוגים של R (למשל, α1, α5) שמתבטאים בעיקר בתאי עצב18נתוני בדיקת ההצלבה המתקבלים באמצעות רקמות מוח בתפזורת, כמתואר בפרוטוקול זה, אמורים לספק מידע המשקף את רמות פני השטח העצביים., עם זאת, עבור GABA אחריםAתת-סוגים של R (למשל, α2) הבאים לידי ביטוי גבוה הן בתאי עצב והן באסטרוציטים18מעניין לחקור את רמות פני השטח של הקולטן בנוירונים לעומת אסטרוציטים בנפרד., לשם כך, מיון תאים קונבנציונלי (למשל, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות [FACS]19) עשוי להיות משולב בפרוטוקול BS3 crosslinking; שלב הדיסוציאציה של התא למיון תאים יכול להיעשות לאחר שלב המרווה BS3, אך יש לוודא שכל ההליכים והתנאים עבור FACS (למשל, המאגרים לשימוש, טמפרטורה, זמן הדגירה) תואמים לאלה שבבדיקת הקרוסלינקינג. בנוסף, ניתן להשתמש בגישת FACS רק עבור GABAAתת-סוגים R ידועים כממוקמים בתא התא הפריסומטי (למשל, α2) אך לא עבור תת-הסוגים המועשרים בדנדריטים דיסטליים (למשל, α5)18מכיוון שתאי תאים היקפיים או דיסטליים ככל הנראה הולכים לאיבוד במהלך שלב הדיסוציאציה הנרחב של התאים הדרוש למיון תאים., (4) לבסוף, מצאנו שהתוצאות עקביות יותר כאשר חישבנו את רמות קולטני פני השטח על ידי הפחתת כמות הקולטנים הקשורים לרירית הרחם מהכמות הכוללת של קולטנים, במקום להעריך ישירות את רמות פני השטח בהתבסס על הצפיפות של מיני חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה. סביר להניח שהסיבה לכך היא שיעילות ההעברה של מיני חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה אלה אל קרום PVDF משתנה יותר מזו של החלבון המקורי, השלם בגודל קטן יותר (למשל, ~55 kDa עבור α5-GABAAR). לכן, מומלץ לעקוב אחר השיטה המתוארת בסעיף התוצאות ואת המקרא של תרשים 8 כדי לחשב את רמות קולטן פני השטח.
מלבד ההשפעות של לחץ כרוני על GABAAR, בדיקת BS3 crosslinking יכולה להיות מיושמת גם על עכברים מהונדסים גנטית או מודלים מכרסמים עם מניפולציות ניסיוניות כדי לחקור מספר מצבים נוירולוגיים או נוירופסיכיאטריים. בדיקה זו שימשה בהצלחה כדי ללכוד השפעות המושרות על ידי קוקאין על ביטוי פני השטח של קולטני גלוטמט בגרעין האקומבנס של מוחות חולדות20,21. הבדיקה שימשה גם כדי להראות ביטוי פני שטח מופחת של α5-GABAAR ב- PFC של עכברי נוקאאוט BDNF הטרוזיגוטיים22. במחקר קודם אחר, במודל של אנצפלופתיה בכבד בחולדות, ליקויי הלמידה המרחבית הנלווים היו קשורים סיבתית לשינוי בביטוי פני השטח של קולטני גלוטמט ו- GABAA בהתבסס על בדיקת crosslinkingזו 23. לסיכום, בדיקת ההצלבה הכימית BS3 מספקת כלי רב-תכליתי ללכידת שינויים ספציפיים לאזור המוח ותלויי הקשר במגוון מערכות קולטנים במוח, כמו גם כמעט בכל רקמות או איברים היקפיים אחרים. בדיקה זו יכולה להתבצע גם במקביל לשיטות אחרות להערכת רמות קולטני פני השטח, כגון הקלטה אלקטרופיזיולוגית של עיכוב טוניק (במיוחד במקרה של α5-GABAAR), מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני, וביוטינילציה של פני השטח, כדי להצליב ולאמת את התוצאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים מודים לצוות מתקן בעלי החיים CAMH על הטיפול בבעלי החיים לאורך כל תקופת המחקר. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR Project Grant #470458 to T.T.), קרן דיסקברי מה-CAMH (ל-T.P.), הברית הלאומית לחקר סכיזופרניה ודיכאון (פרס NARSAD #25637 ל-E.S.), ומכון המחקר לבריאות הנפש ע"ש משפחת קמפבל (ל-E.S). א.ס. הוא המייסד של Damona Pharmaceuticals, ביופארמה המוקדשת להבאת תרכובות GABAergic חדשניות למרפאה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E.
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
