Summary
Анализ химического сшивания BS3 выявляет снижение экспрессии рецептораГАМК А на клеточной поверхности в мозге мыши в условиях хронического психосоциального стресса.
Abstract
Тревога — это состояние эмоций, которое по-разному влияет на поведение животных, включая когнитивные функции. Поведенческие признаки тревоги наблюдаются во всем животном мире и могут быть распознаны как адаптивные или неадаптивные реакции на широкий спектр модальностей стресса. Грызуны представляют собой проверенную экспериментальную модель для трансляционных исследований, посвященных интегративным механизмам тревоги на молекулярном, клеточном и схемном уровнях. В частности, парадигма хронического психосоциального стресса вызывает дезадаптивные реакции, имитирующие поведенческие фенотипы, похожие на тревогу / депрессию, которые аналогичны людям и грызунам. В то время как предыдущие исследования показывают значительное влияние хронического стресса на содержание нейротрансмиттеров в головном мозге, влияние стресса на уровни рецепторов нейротрансмиттеров недостаточно изучено. В этой статье мы представляем экспериментальный метод количественной оценки поверхностных уровней нейрональных рецепторов нейротрансмиттеров у мышей при хроническом стрессе, уделяя особое внимание рецепторам гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), которые участвуют в регуляции эмоций и познания. Используя мембранонепроницаемый необратимый химический сшивающий агент, бисульфосукцинимидилсуберат (BS3), мы показываем, что хронический стресс значительно снижает поверхностную доступность рецепторовГАМК А в префронтальной коре. Поверхностные уровни нейронов рецепторовГАМК А являются процессом, ограничивающим скорость нейротрансмиссии ГАМК, и, следовательно, могут использоваться в качестве молекулярного маркера или прокси степени тревожных/депрессивных фенотипов в экспериментальных моделях на животных. Этот подход к сшиванию применим к различным рецепторным системам для нейротрансмиттеров или нейромодуляторов, экспрессируемых в любой области мозга, и, как ожидается, будет способствовать более глубокому пониманию механизмов, лежащих в основе эмоций и познания.
Introduction
Рецепторы нейротрансмиттеров локализованы либо на поверхности плазматической мембраны нейронов, либо внутриклеточно на эндомембранах (например, эндосоме, эндоплазматическом ретикулуме [ER] или транс-аппарате Гольджи) и динамически перемещаются между этими двумя компартментами в зависимости от внутренних физиологических состояний нейронов или в ответ на активность внешней нейронной сети 1,2. Поскольку вновь секретируемые нейротрансмиттеры проявляют свои физиологические функции главным образом через локализованный на поверхности пул рецепторов, уровни поверхностных рецепторов для данного нейротрансмиттера являются одним из важнейших факторов, определяющих его сигнальную способность в нейронной цепи3.
Существует несколько методов мониторинга уровней поверхностных рецепторов в культивируемых нейронах, включая анализповерхностного биотинилирования 4, иммунофлуоресцентный анализ со специфическим антителом в непермеабилизированных условиях5 или использование трансгена рецептора, генетически слитого с pH-чувствительным флуоресцентным оптическим индикатором (например, pHluorin)6. Напротив, эти подходы либо ограничены, либо непрактичны при оценке уровней поверхностных рецепторов in vivo. Например, процедура поверхностного биотинилирования может быть непрактичной для обработки больших количеств и количества образцов тканей головного мозга in vivo из-за ее относительно высокой цены и последующих этапов, необходимых для очистки биотинилированных белков на конъюгированных с авидином шариках. Для нейронов, встроенных в трехмерную архитектуру мозга, низкая доступность антител или трудности с количественной оценкой на основе микроскопа могут представлять собой значительное ограничение для оценки уровней поверхностных рецепторов in vivo. Чтобы визуализировать распределение рецепторов нейротрансмиттеров в интактном мозге, неинвазивные методы, такие как позитронно-эмиссионная томография, могут быть использованы для измерения занятости рецепторов и оценки уровней поверхностных рецепторов7. Однако этот подход критически зависит от наличия конкретных радиолигандов, дорогостоящего оборудования и специальных знаний, что делает его менее доступным для повседневного использования большинством исследователей.
Здесь мы описываем простой, универсальный метод измерения уровней поверхностных рецепторов в мозге экспериментальных животных ex vivo с использованием водорастворимого, мембранонепроницаемого химического сшивающего агента, бис(сульфосукцинимидил)суберата (BS3)8,9. BS3 нацелен на первичные амины в боковой цепи остатков лизина и может ковалентно сшивать белки в непосредственной близости друг от друга. Когда срезы мозга свежеприготовлены из интересующей области и инкубированы в буфере, содержащем BS3, рецепторы клеточной поверхности сшиваются с соседними белками и, таким образом, превращаются в более высокомолекулярные виды, тогда как внутриклеточные эндомембранные рецепторы остаются немодифицированными. Таким образом, поверхностный и внутриклеточный пулы рецепторов могут быть разделены электрофорезом в виде додецилсульфата натрия и полиакриламидного геля (SDS-PAGE) и количественно определены вестерн-блоттингом с использованием антител, специфичных к исследуемому рецептору.
Непредсказуемый хронический умеренный стресс (UCMS) является хорошо зарекомендовавшей себя экспериментальной парадигмой для индуцирования хронического психосоциального стресса у грызунов10. UCMS вызывает тревожные/депрессивные поведенческие фенотипы и когнитивный дефицит посредством модуляции множества нейротрансмиттерных систем, включая ГАМК и ее рецепторы10,11. В частности, α5-субъединичный рецепторГАМК А (α5-ГАМКАR) участвует в регуляции памяти и когнитивных функций12,13, что позволяет предположить возможное участие измененных функций этой субъединицы в UCMS-индуцированном когнитивном дефиците. В этом протоколе мы использовали анализ сшивания BS3 для количественного определения уровней поверхностной экспрессии α5-ГАМКAR в префронтальной коре мышей, подвергшихся воздействию UCMS, по сравнению с контрольными мышами без стресса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все работы с животными в этом протоколе были выполнены в соответствии с Законом Онтарио о животных для исследований (RSO 1990, глава A.22) и Канадским советом по уходу за животными (CCAC) и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными.
1. Подготовка животных
- Определите количество животных, которые будут использоваться в экспериментах, и разделите их на соответствующие группы или экспериментальные когорты. В разделе обсуждения обсуждаются размер группы, пол и статистическая мощность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован для мышей (штамм C57BL6 / J; возраст 2-4 месяца; обычно 20-30 г массы тела; эквивалентное количество самцов и самок). - Поместите животных в UCMS или контрольные нестрессовые условия на 5-8 недель, следуя протоколу, описанному ранее14.
- После последней процедуры UCMS позвольте животным оставаться в домашних клетках в течение 1 дня, прежде чем использовать их для анализа сшивания, чтобы избежать острого стрессового воздействия на экспрессию рецепторов.
2. Приготовление исходных растворов
- Приготовьте и храните следующие растворы в соответствии с инструкциями перед анализом.
- Приготовьте 5 М NaCl, растворив 14,6 г NaCl в 40 мл деионизированной воды. Хранить при комнатной температуре (RT).
- Приготовьте 1,08 М KCl, растворив 3,22 г KCl в 40 мл деионизированной воды. Хранить в RT.
- Приготовьте 400 мМ MgCl 2, растворив 3,25 г MgCl 2·6H 2 O в 40 мл деионизированнойводы. Хранить в RT.
- Приготовьте 1 М глицина, растворив 3 г глицина в 40 мл деионизированной воды, и храните при температуре 4 ° C.
- Приготовьте 1 М дитиотреитол (DTT), растворив 1,54 г DTT в 10 мл деионизированной воды. Фильтруйте-стерилизуйте его через фильтр с размером пор 0,2 мкм и аликвотируйте в пробирки объемом 2 мл. Хранить при температуре −20 °C.
- Приготовьте 10% Нонидет-П40 (НП-40), разбавив его в соотношении 1:10 (об./об.) в деионизированной воде. Хранить в RT.
- Приготовьте 0,5 М ЭДТА (рН = 8,0) и храните при ЛТ.
- Подготовьте 1 М буфера HEPES (pH = 7,2-7,5) и храните при температуре 4 °C.
- Приготовьте 2,5 М или 45% (мас./об.) глюкозы и храните при температуре 4 °C.
3. Подготовка рабочего места
- В день проведения анализа сшивания BS3 соберите в комнате для вскрытия животных следующие материалы (рис. 1) с несколькими предметами, предварительно охлажденными на льду: ведро со льдом, металлический температурный блок (предварительно охлажденный на льду), ледяной PBS в конической трубке объемом 50 мл и замороженный PBS в чашке Петри, фильтровальную бумагу, смоченную PBS и помещенную на охлажденную плоскую поверхность или голубой лед, матрица мозга (интервал 1 мм для введения бритвенного лезвия), предварительно охлажденная на льду, бритвенные лезвия (~10), предварительно охлажденные на льду, инструменты для вскрытия (ножницы, щипцы, изогнутый зонд), тканевый пуансон, 70% спрей этанола для протирания бумаги и бумажные полотенца, наконечники пипеток (200 мкл), пипетка (P200), секундомер, блокнот для заметок, ручка и микроцентрифужные пробирки (1,5 мл).
- Перед анализом пометьте микроцентрифужные пробирки информацией об образце (например, идентификационный номер животного, тип лечения [UCMS против отсутствия стресса (NS)], область мозга, с BS3 или без него и т. д.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализов сшивания BS3 необходимо собрать по два образца из каждой области мозга; один образец будет использоваться для сшивания (с BS3), а другой для реакции без сшивания (без BS3) в качестве контроля. Поэтому, чтобы взять образец из двух областей мозга (т.е. префронтальной коры [PFC] и гиппокампа [HPC]) у 12 мышей, пометьте 48 пробирок для первоначального отбора проб (= 2 образца × 2 области × 12 мышей) (для использования в разделе 6). Маркировка дополнительных двух наборов по 48 пробирок для последующего хранения (для хранения двух разных объемов [100 мкл, 300 мкл] каждого образца) (для использования в разделе 7). Таким образом, для этого размера когорты требуется маркировать в общей сложности 144 пробирки.
- Перед анализом пометьте микроцентрифужные пробирки информацией об образце (например, идентификационный номер животного, тип лечения [UCMS против отсутствия стресса (NS)], область мозга, с BS3 или без него и т. д.).
- Кроме того, убедитесь, что в лаборатории имеется следующее оборудование: настольная охлаждаемая микроцентрифуга, ультразвуковой аппарат, ротатор трубки (для использования в холодильной камере или внутри холодильника [4 °C]), морозильная камера (-80 °C) для хранения образцов и ведро с сухим льдом для временного хранения образцов (будет использоваться в разделе 7)
4. Приготовление рабочих растворов и буферов
ПРИМЕЧАНИЕ: Утром в день анализа приготовьте следующие растворы. Этот расчет основан на необходимых решениях для обработки двух областей мозга (т.е. PFC и HPC) у 12 мышей.
- Подготовьте искусственную спинномозговую жидкость (aCSF, pH = 7,4), как указано в таблице 1. Распределите 750 мкл aCSF в каждую пробирку для отбора проб (48 пробирок, помеченных на шаге 3.1.1) и поместите их в металлический блок температуры на льду для предварительного охлаждения буфера.
- Подготовьте буфер лизиса, как указано в таблице 2. Хранить на льду (400 мкл на образец).
- Приготовьте исходный раствор BS3 52 мМ (26x) в буфере цитрата натрия 5 мМ (pH = 5,0).
- Сначала приготовьте 100 мМ лимонной кислоты (запас А) и 100 мМ цитрата натрия (запас Б).
- Разбавьте бульон А и бульон Б в соотношении 1:20 деионизированной водой. Добавьте по 100 мкл к 1,9 мл воды, чтобы получить 5 мМ лимонной кислоты (запас C) и 5 мМ цитрата натрия (запас D) соответственно.
- Смешайте 410 мкл исходного C и 590 мкл исходного D, чтобы приготовить буфер цитрата натрия 5 мМ (pH = 5,0) (раствор E, 1 мл).
- Подтвердите рН раствора Е с помощью индикаторной полоски рН.
- Растворите 24 мг BS3 в 806,4 мкл раствора E путем встряхивания в течение 30 с для приготовления исходного раствора BS3 (26x).
- Приготовьте еще 1 мл раствора Е для использования в качестве средства контроля транспортных средств для образцов без сшивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте исходный раствор BS3, когда все остальное будет готово и эксперимент вот-вот начнется. BS3 следует хранить в высушенном виде при температуре 4 °C до использования. После восстановления BS3 остается активным только в течение примерно ≤3 ч. Поскольку, как сообщается, рН буфера цитрата натрия 5 мМ (раствор Е) со временем повышается, вызывая ускоренный гидролиз BS3, рекомендуется готовить раствор Е свежим из исходных растворов А и В9. Из-за ограниченной растворимости BS3 при низких температурах храните восстановленный BS3 при RT. Израсходуйте восстановленный BS3 в течение 3 часов и не замораживайте/не размораживайте и не используйте повторно восстановленный BS3.
5. Рассечение тканей головного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, по крайней мере, два человека должны работать вместе скоординированным образом. В то время как один человек сосредотачивается на вскрытии животных (этапы 5.2-5.10 и шаг 6.3), другой человек должен работать в качестве хронометриста и помогать координировать анализ (шаг 5.1, шаг 6.1, шаг 6.2, шаг 6.4 и шаг 6.5)
- Принесите первое животное для вскрытия из зоны содержания в комнату для вскрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку острые стрессоры (например, новая среда, запах крови) могут влиять на динамику белка мозга, животных следует держать в домашних клетках, расположенных далеко от зоны вскрытия, а затем индивидуально доставлять в комнату для вскрытия для немедленного обезглавливания. - Усыпить мышь вывихом шейки матки с последующим обезглавливанием. Быстро извлеките мозг из черепа и погрузите его в ледяной PBS в чашку Петри на 10-15 с (рис. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Животных не анестезируют для экспериментов BS3, поскольку любой анестетик потенциально может влиять на уровень поверхностного представления рецепторов нейротрансмиттеров9. - Поместите охлажденный мозг в матрицу мозга на льду вентральной стороной мозга вверх (рис. 3).
- Вставьте первое лезвие бритвы через границу между обонятельной луковицей и обонятельной ножкой, чтобы коронально разрезать мозг (рис. 4). Используя три-четыре дополнительных бритвенных лезвия, последовательно разрезайте переднюю часть мозга коронально с интервалом 1 мм.
- Поднимите корональные срезы с матрицы мозга, удерживая все вставленные бритвенные лезвия вместе, оставляя заднюю часть мозга позади в мозговой матрице. Используйте щипцы, чтобы отделить бритвенные лезвия друг от друга, и поместите их на плоскую охлажденную поверхность срезом мозга вверх (рисунок 5).
- Определите фрагменты, содержащие интересующую область. Для отбора проб ПФУ выберите второй и третий срезы позади первого среза, содержащего обонятельную ножку.
- Удалите интересующую область с помощью тканевого пуансона (Видео 1), отложите его в сторону на охлажденное лезвие бритвы и равномерно разделите ткань на две части (например, ткани левого и правого полушария, причем одна половина будет использоваться для реакции сшивания BS3, а другая половина - для контроля без сшивания, если интересующий целевой белок одинаково экспрессируется в обоих полушариях).
- Измельчите каждую ткань на кусочки на лезвии бритвы, используя тонкий кончик щипцов несколькими вертикальными движениями по лезвию (видео 2) вместо того, чтобы разминать или измельчать ткани. Это позволит максимально увеличить площадь поверхности, доступную для BS3, без серьезного нарушения мембранной целостности клеток. Сразу после измельчения переложите измельченные салфетки в соответствующие пробирки (см. шаг 6.3).
- Для отбора проб HPC извлеките заднюю часть мозга из матрицы и поместите мозг на увлажненную фильтровальную бумагу на охлажденную плоскую поверхность спинной стороной вверх (рис. 6).
- Используя изогнутый зонд и щипцы и приближаясь с дорсальной стороны (Видео 3), рассекайте HPC (дорсальную половину, вентральную половину или оба) с обоих полушарий (одна половина для сшивания BS3, а другая половина для контроля). Каждую ткань измельчают, как показано на шаге 5.8, и переносят ткань в соответствующие пробирки (см. этап 6.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все время вскрытия для каждого животного должно быть на уровне ~ 5 минут, чтобы условия эксперимента и результаты были последовательными.
6. Реакция сшивания
- Принесите следующее животное для вскрытия из зоны содержания в комнату для вскрытия, когда вскрытие мозга предыдущей мыши вот-вот закончится (шаг 5.10).
- Добавьте в пробирку, предварительно охлажденную на льду (из шага 4.1), 30 мкл раствора BS3 (26x) или раствора носителя E непосредственно перед тем, как измельченные салфетки будут готовы к переносу в соответствующие пробирки. Замените наконечники пипеток между трубками, чтобы убедиться, что BS3 не загрязнен в контрольных трубках без сшивания.
- Переложите измельченные ткани (из шага 5.8 и шага 5.10) в соответствующие пробирки, а затем приступают к препарированию следующего животного (этап 5.2)
- Переверните и перемешайте пробирку, чтобы разбить куски ткани на более мелкие кусочки (видео 4), и начните инкубацию образцов на ротаторе пробирки в холодильной камере в течение от 30 минут до 2 часов. Запишите время начала инкубации BS3 для каждой пробирки. Оптимальное время инкубации см. в разделе обсуждения.
- Погасите реакцию путем добавления в пробирку 78 мкл 1 М глицина, а затем инкубируйте образец в течение 10 мин при 4 °C при постоянном вращении. Запишите время начала и окончания закалки для каждой трубки. Продолжайте помогать человеку, сосредоточенному на вскрытии животного, приводя следующее животное (шаг 6.1) и помогая с сшиванием (шаг 6.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте каждый образец с одинаковым временем для всех образцов. Если помещение для вскрытия находится далеко от холодильной камеры, настоятельно рекомендуется нанять третьего человека для участия в инкубации и тушении образцов в холодильной камере.
7. Лизис тканей, подготовка белка и вестерн-блоттинг
- После 10 мин закалки (этап 6.5) образцы отжимают при 20 000 x g при 4 °C в течение 2 мин и удаляют надосадочную жидкость. Если доступно третье лицо, перейдите к шагу 7.2; В противном случае заморозьте образцы на сухом льду и приостановите анализ до тех пор, пока не будет завершено вскрытие мозга (раздел 5) и сшивание (раздел 6) для всех животных.
- Добавьте 400 мкл ледяного лизисного буфера на пробирку.
- Обработайте образцы ультразвуком в течение 1 с пять раз с интервалом 5 с между ними, сохраняя образцы на льду.
- Отжимные образцы при 20 000 x g в течение 2 мин, чтобы выкрутить нерастворимый тканевый мусор (гранулы) и сохранить надосадочную жидкость.
- Используйте 5 мкл надосадочной жидкости для измерения концентрации белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA).
- Остатки надосадочной жидкости разделить на две трубочки; одна пробирка содержит 100 мкл надосадочной жидкости для последующего вестерн-блоттинга, а другая пробирка содержит остаток (~300 мкл) для длительного хранения при -80 °C. Добавьте в образцы соответствующее количество 4x буфера для образцов SDS (дополненного β2-меркаптоэтанолом) и инкубируйте при 70 ° C в течение 10 мин.
- Проведите 10-20 мкг белка на лунку на акриламидном геле для электрофореза (SDS-PAGE), а затем перенесите белки на мембрану поливинилиденфторида (PVDF) для анализа вестерн-блоттинга.
- Блокируйте мембрану PVDF в 5% (мас./об.) обезжиренном молоке, растворенном в трис-буферном физиологическом растворе, содержащем 0,1% Tween-20 (TBS-T), в течение 1 ч при ЛТ.
- Ненадолго промойте мембрану дважды TBS-T и инкубируйте ее с первичным антителом, разведенным в TBS-T, в течение ночи при 4 ° C.
- Смойте первичное антитело три раза в течение 10 минут каждый в TBS-T при ЛТ.
- Инкубируют мембрану с вторичным антителом, конъюгированным пероксидазой хрена, разведенным в TBS-T, в течение 1 ч при ЛТ.
- Смойте вторичное антитело три раза по 10 мин каждый в TBS-T при ЛТ.
- Инкубируют мембрану в усиленном хемилюминесцентном реагенте и детектируют сигнал с помощью гель-документирующего аппарата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать осуществимость анализа сшивания BS3 для оценки поверхностных уровней α5-GABA AR в ПФК мышей, мы провели по 10 мкг каждого из образцов BS3-сшитого и несшитого белка на SDS-PAGE и проанализировали белки методом вестерн-блоттинга с использованием антитела против α5-ГАМКAR (поликлональный кролик) (рис. 7). Образцы несшитого белка давали общее количество α5-GABA A R при ~ 55 кДа, в то время как образцы BS3-сшитого белка давали определенное количество эндомембраноассоциированного α5-GABA A R (мигрирующего при ~ 55 кДа) вместе с более высокомолекулярными видами белка, представляющими белковые комплексы, ковалентно сшитые с α5-GABAAR. Для количественного определения поверхностных уровней α5-ГАМК A R мы можем оценить степень истощенияα5-ГАМК AR при ~ 55 кДа от общего пула при сшивании, поскольку субъединица затем переходит в положения с более высокой молекулярной массой. На практике поверхностные уровни α5-ГАМК A R могут быть рассчитаны путем вычитания количества эндомембраноассоциированного α5-ГАМК AR(при ~55 кДа в сшитой полосе образца) из общих уровней α5-GABAAR (при ~55 кДа вполосе сшитого образца).
Затем мы оценили влияние UCMS (через 3 недели и 5 недель) на поверхность и общий уровень α5-ГАМК A R в ПФК мышей.Вэтом эксперименте, чтобы проследить временной ход реакции сшивания, мы подготовили образцы через 1 ч, 2 ч и 3 ч после добавления BS3. Поскольку реакции сшивания BS3, по-видимому, достигают плато к 2 часам, данные в момент времени 1 час были использованы для построения графика. Мы наблюдали значительное и прогрессирующее снижение поверхностных уровнейα5-ГАМК A Rв ПФК через 3 недели и 5 недель UCMS по сравнению с мышами без контроля стресса (рис. 8). Данные показали незначительные или отсутствующие видимые изменения в общих уровнях рецепторов в этих экспериментальных условиях, что позволяет предположить, что хронический стресс специфически повлиял на транспортировкуα5-ГАМК AR на поверхность клетки.
Рисунок 1: Инструменты вскрытия, используемые в анализе сшивания BS3. Фильтровальную бумагу смачивают ледяным ПБС и кладут на ровную поверхность голубого льда. Чашку Петри, заполненную PBS и хранящуюся при -20 °C за 1 день до анализа, помещают на лед. Матрица мозга и бритвенные лезвия предварительно охлаждаются на льду. Ножницы (один большой, один маленький), щипцы (один большой, несколько маленьких) и тканевый перфоратор очищаются перед анализом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Весь мозг мыши препарирован из черепа и помещен в ледяной PBS. Сразу после того, как весь мозг был удален из черепа, его погружали в ледяной PBS на 10-15 с в чашку Петри на льду. Это замедляет метаболизм мозга и сводит к минимуму трафик и деградацию белка, а также помогает тканям становиться более твердыми, что облегчает последующее срезание мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Мозг мыши, помещенный в матрицу мозга. Охлажденный мозг мыши, погруженный в ледяной PBS, был перенесен в матрицу мозга и помещен брюшной стороной вверх. Бритвенные лезвия и матрица были предварительно охлаждены на льду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Корональное сечение мозга мыши в матрице мозга. Первое предварительно охлажденное лезвие бритвы было вставлено через границу между обонятельной луковицей и обонятельной ножкой, чтобы начать корональное рассечение мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Серийные корональные срезы мозга мыши. Переднюю часть мозга мыши разрезали коронально путем последовательной вставки пяти бритвенных лезвий в матрицу мозга (интервалы 1 мм). Все вставленные лезвия были скреплены, сняты с матрицы, отделены друг от друга с помощью щипцов и помещены на охлажденную плоскую поверхность срезом мозга вверх. (Вверху слева) Обонятельная луковица; (слева посередине) первая секция; второй (внизу слева) и третий (вверху справа) срезы использовались для отбора проб тканей ПФК; (внизу справа) четвертый раздел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Задняя часть мозга для рассечения гиппокампа. После того, как передняя часть мозга была коронально разрезана бритвенными лезвиями (слева), задняя часть мозга (середина) была извлечена из матрицы мозга и помещена на смоченную PBS фильтровальную бумагу на охлажденной поверхности (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: BS3 сшивание ГАМКAR на поверхности клетки. В присутствии BS3 α5-ГАМК A R на поверхности плазматической мембраны сшивается (XL) с близкими к ней анонимными белками, такими как другие субъединицы ГАМКAR в пентамерной сборкеГАМК A Rили дополнительные соседниебелки (X), но не с белками (Y), находящимися далеко от нее. Таким образом, α5-ГАМКAR появляется на блоттинге в виде высокомолекулярного (HMW) белка. α5-ГАМК AR на эндосоме остается неповрежденной и мигрирует с ожидаемым размером ~55 кДа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Поверхностные уровни α5-ГАМКAR, на которые влияет UCMS. Оценивали как общий, так и поверхностный уровниα5-ГАМК AR в ПФК мышей в условиях отсутствия стресса и UCMS (3 недели и 5 недель). Чтобы проследить за ходом реакции сшивания, образцы готовили через 1 ч, 2 ч и 3 ч после добавления BS3. Использовали самок мышей (2-3 месяца, N = 4 на группу). Интактные уровниα5-ГАМКA R при 55 кДа для каждого состояния сначала нормализовали соответствующими уровнями αTubulin, а затем использовали для расчета общих и эндомембранных ассоциированных уровней α5-ГАМКA R(из сшитых [No Xlink] и сшитых [Xlink] образцов соответственно). Впоследствии уровни поверхностных рецепторов были рассчитаны путем вычитания эндомембранного ассоциированного количества из общих уровней. Поскольку реакции сшивания BS3, по-видимому, достигали плато через 2 часа, данные в момент времени 1 час использовались для построения графика (среднее значение ± SEM). Наблюдалось значительное влияние хронического стресса на поверхностные уровни α5-ГАМК A R, и этот эффект зависел от продолжительности UCMS, поскольку было выявлено прогрессирующее снижение поверхностных уровней α5-ГАМКAR в течение периода UCMS. *p < 0,05, **p < 0,01 (тест Крускала-Уоллиса с множественными сравнениями Данна). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Рабочий конц. | Стоковое решение | Количество исходного раствора для дозирования |
| 1,2 мМ CaCl2 | 480 мМ (400x)* | 100 мкл |
| 20 мМ HEPES | 1 м (50x) | 800 мкл |
| 147 мМ NaCl | 5 м (34x) | 1176,5 мкл |
| 2,7 мМ KCl | 1,08 м (400x) | 100 мкл |
| 1 мМ MgCl2 | 400 мМ (400x) | 100 мкл |
| 10 мМ глюкозы | 2,5 м (250x) | 160 мкл |
| Деионизированная вода | 37,563 мл | |
| Итог | 40 мл | |
| * Бульон CaCl2 должен быть свежеприготовленным в день эксперимента. | ||
Таблица 1: Состав искусственной спинномозговой жидкости.
| Рабочий конц. | Стоковое решение | Количество исходного раствора для дозирования |
| 25 мМ HEPES | 1 м (40x) | 500 мкл |
| 500 мМ NaCl | 5 м (10x) | 2 мл |
| 2 мМ ЭДТА | 0,5 м (250x) | 80 мкл |
| 1 мМ DTT | 1 м (1000x) | 20 мкл |
| 0,1% НП-40 | 10% (100x) | 200 мкл |
| Коктейль ингибитора протеазы | В 100 раз | 200 мкл |
| Деионизированная вода | 17 мл | |
| Итог | 20 мл |
Таблица 2: Состав лизисного буфера
Видео 1: Изоляция PFC с помощью тканевого пуансона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Измельчение ПФУ с помощью щипцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 3: Препарирование HPC с помощью изогнутого зонда и щипцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 4: Инверсия-перемешивание образца ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя влияние хронического психосоциального стресса на поведение (т.е. эмоциональность и когнитивный дефицит) и молекулярные изменения (т.е. снижение экспрессии ГАМКергических генов и сопутствующий дефицит ГАМК-ергической нейротрансмиссии) хорошо задокументировано10, механизмы, лежащие в основе такого дефицита, нуждаются в дальнейшем исследовании. В частности, учитывая недавнее исследование, показывающее, что хронический стресс значительно влияет на нейрональный протеом из-за перегрузки функций ER и, таким образом, повышенного стресса ER15, остается вопрос о том, влияет ли хронический стресс на транспортировку ГАМКAR через мембрану ER и как измененный трафик или поверхностные уровни ГАМКAR могут быть причинно связаны с психопатологией.
Анализ сшивания BS3, показанный в этом протоколе, послужит мощным подходом для ответа на некоторые из этих вопросов. Например, известно, что UCMS вызывает ряд поведенческих изменений, включая когнитивный дефицит, тревожное поведение и ангедонические фенотипы, в зависимости от продолжительности UCMS10. Таким образом, можно было бы изучить ход времени и степень индуцированных UCMS изменений поверхностных уровнейα5-GABA AR путем отбора проб мозга мыши в последовательные моменты времени от начала UCMS (например, 1 неделя, 3 недели, 5 недель), а также можно было бы провести перекрестное сравнение с поведенческими фенотипами, наблюдаемыми в каждый момент времени. Дополнительные подтипы ГАМКAR (например, α1, α2) и рецептор нейромодуляторов, которые, как известно, подвержены влиянию хронического стресса (например, рецептор TrkB для нейротрофического фактора головного мозга [BDNF])10 могут быть протестированы одновременно с использованием одних и тех же образцов. Поскольку некоторые из этих рецепторных систем и подтипов избирательно вовлечены в определенные поведенческие области (например, седация, тревога, познание)11, стоит соотнести поведенческие изменения с типом и степенью рецепторов, на которые влияет UCMS в каждый момент времени.
Ниже приведены критические моменты, которые следует учитывать для нескольких шагов в протоколе. Первым шагом является определение необходимого и достаточного количества животных для использования на основе экспериментального дизайна и анализа мощности. Например, чтобы изучить влияние хронического стресса на уровни поверхностных рецепторов ГАМКА, мы обычно готовим одну группу мышей (N = 6 / пол) к воздействию UCMS в течение 5 недель, а другую группу (N = 6 / пол) для содержания в условиях отсутствия стресса. Ожидается, что этот размер группы (всего N = 24, включая обоих полов) даст достаточную статистическую мощность для обнаружения ~ 20% разницы в уровнях рецепторов, что позволит оценить как стрессовые, так и половые эффекты. Примечательно, что сообщается, что хронический стресс вызывает зависимые от пола различия в поведенческих и молекулярных результатах10. Например, женщины, как правило, более склонны к развитию депрессивных симптомов, чем мужчины. Последовательно наши исследования с использованием посмертного мозга человека и грызунов указывают на более высокий уровень поведенческих и молекулярных патологий у женщин; пониженные уровни соматостатина (SST), молекулярного маркера депрессии, более устойчивы у женщин среди пациентов с депрессией16, а повышенная эмоциональность более устойчива у самок мыши, воспроизводящих аспекты депрессивной патологии, чем у мужчин15,17. Поэтому рекомендуется, чтобы любой экспериментальный дизайн, посвященный влиянию хронического стресса на психопатологические исходы, включал достаточное количество как мужчин, так и женщин, чтобы обеспечить статистическую мощность при анализе данных и выявить возможные эффекты, зависящие от пола.
Оптимальное время инкубации с BS3 должно быть определено в пилотных экспериментах для каждого изучаемого рецептора. Сообщается, что незаконный оборот рецепторов может происходить медленно даже при низких температурах во время инкубацииобразца 9. Чтобы зафиксировать точные уровни поверхностных рецепторов во время вскрытия мозга, было бы идеально свести к минимуму время инкубации и выбрать момент времени непосредственно перед тем, как реакция сшивания достигнет плато (от 30 минут до 2 ч при 4 ° C).
Мы заметили несколько операционных ограничений, связанных с анализами сшивания BS3. (1) Во-первых, из-за относительно короткого периода полураспада (2-3 часа) BS3, вызванного спонтанным гидролизом в физиологическом диапазоне pH, необходимо завершить реакцию вскрытия и сшивания животных в течение этого периода времени. Это привело к тому, что мы ограничили количество животных, которых мы могли препарировать за раз, максимум до 12. Если экспериментатор планирует препарировать более 12 животных, рекомендуется разделить экспериментальную когорту на несколько групп, в каждой из которых будет менее 12 животных. После того, как анализ для одной группы завершен, новая партия BS3 должна быть заново подготовлена для использования в последующих анализах сшивания для следующей группы. В том же духе следует ограничить количество областей, представляющих интерес для вскрытия у одного животного. Мы регулярно отбираем образцы из двух областей мозга (PFC, HPC) для анализа сшивания, и это максимальное количество областей мозга, которые мы можем расчленить, чтобы получить согласованные результаты с минимальной вариабельностью между образцами. (2) Во-вторых, специфичность антител, используемых при вестерн-блоттинге, должна быть тщательно оценена. Химическая реакция сшивания BS3 может оказывать неожиданное влияние на антигенность белков, обнаруживаемых каждым антителом. Мы обнаружили, что одна α5-ГАМКAАнтитело R (указанное в Таблица материалов) ошибочно обнаружил сильную полосу ~50 кДа конкретно в BS3-сшитых образцах, независимо от наличия или отсутствия α5-ГАМКAБелок R в образце; эта полоса ~ 50 кДа наблюдалась даже в образцах тканей из α5-ГАМКAМышам с нокаутом R, что позволяет предположить, что это антитело начало перекрестную реакцию с нерелевантными антигенами, случайно сгенерированными реакцией сшивания BS3. Рекомендуется, чтобы специфичность антител была тщательно определена с реакциями сшивания BS3 и без них, в идеале с использованием образцов нокаутной ткани, если таковые имеются, для данного белка, представляющего интерес. (3) Текущий протокол, описанный здесь, не касается типов клеток, в которых каждая ГАМКAЭкспрессируется подтип R (например, нейроны и астроциты). Для некоторых ГАМКAПодтипы R (например, α1, α5), которые преимущественно экспрессируются в нейронах18, данные анализа сшивания, полученные с использованием объемных тканей мозга, как описано в этом протоколе, должны предоставлять информацию, отражающую уровни поверхности нейронов. Однако для других ГАМКAПодтипы R (например, α2), которые высоко экспрессируются как в нейронах, так и в астроцитах18представляет интерес для изучения поверхностных уровней рецепторов в нейронах по сравнению с астроцитами по отдельности. С этой целью традиционная сортировка клеток (например, флуоресцентно-активируемая сортировка клеток [FACS]19) может быть интегрирован в протокол сшивания BS3; стадия диссоциации клеток для сортировки клеток может быть выполнена после стадии гашения BS3, но необходимо подтвердить, что все процедуры и условия для FACS (например, используемые буферы, температура, время инкубации) совместимы с таковыми в анализе сшивания. Кроме того, подход СУИМ может быть использован только в отношении ГАМКAИзвестно, что подтипы R локализованы в перисоматическом клеточном компартменте (например, α2), но не для подтипов, обогащенных дистальными дендритами (например, α5)18, потому что периферические или дистальные клеточные компартменты, вероятно, теряются во время обширной стадии диссоциации клеток, необходимой для сортировки клеток. (4) Наконец, мы обнаружили, что результаты были более последовательными, когда мы рассчитали уровни поверхностных рецепторов путем вычитания количества эндомембранных рецепторов из общего количества рецепторов, а не путем прямой оценки поверхностных уровней на основе денситометрии высокомолекулярных белковых видов. Вероятно, это связано с тем, что эффективность переноса этих высокомолекулярных белков на мембрану PVDF более изменчива, чем у исходного интактного белка меньшего размера (например, ~ 55 кДа для α5-ГАМКAR). Поэтому рекомендуется следовать методу, описанному в разделе результатов и легенде Рисунок 8 для расчета уровней поверхностных рецепторов.
Помимо влияния хронического стресса наГАМК,АНАЛИЗ СШИВАНИЯ BS3 также может быть применен к генетически модифицированным мышам или моделям грызунов с экспериментальными манипуляциями для исследования ряда неврологических или психоневрологических состояний. Этот анализ был успешно использован для регистрации кокаин-индуцированных эффектов на поверхностную экспрессию глутаматных рецепторов в прилежащем ядре мозга крыс20,21. Анализ также был использован для демонстрации сниженной поверхностной экспрессииα5-ГАМК AR в ПФК гетерозиготных мышей с нокаутом BDNF22. В другом предыдущем исследовании, в модели печеночной энцефалопатии у крыс, сопутствующий пространственный дефицит обучения был причинно связан с измененной поверхностной экспрессией рецепторов глутамата и ГАМКА на основе этого анализа сшивания23. Таким образом, химический анализ сшивания BS3 представляет собой универсальный инструмент для фиксации специфических и контекстно-зависимых изменений в ряде рецепторных систем в головном мозге, а также практически в любых других периферических тканях или органах. Этот анализ также может проводиться параллельно с другими методами оценки уровней поверхностных рецепторов, такими как электрофизиологическая запись тонического ингибирования (особенно в случае α5-GABAAR), криогенная электронная микроскопия и поверхностное биотинилирование, для перекрестного сравнения и проверки результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят персонал животноводческого центра CAMH за заботу о животных на протяжении всего исследования. Эта работа была поддержана Канадским институтом исследований в области здравоохранения (CIHR Project Grant #470458 to T.T.), Фондом Discovery от CAMH (до T.P.), Национальным альянсом по исследованиям шизофрении и депрессии (награда NARSAD #25637 для E.S.) и Научно-исследовательским институтом психического здоровья семьи Кэмпбелл (для E.S.). E.S. является основателем Damona Pharmaceuticals, биофармацевтической компании, занимающейся внедрением новых ГАМКергических соединений в клинику.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E.
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
