Summary
BS3 화학적 가교 분석은 만성 심리사회적 스트레스 조건 하에서 마우스 뇌에서 감소된 세포 표면 GABAA 수용체 발현을 보여줍니다.
Abstract
불안은 인지 기능을 포함하여 동물의 행동에 다양한 영향을 미치는 감정 상태입니다. 불안의 행동 징후는 동물계 전체에서 관찰되며 광범위한 스트레스 양식에 대한 적응 또는 부적응 반응으로 인식될 수 있습니다. 설치류는 분자, 세포 및 회로 수준에서 불안의 통합 메커니즘을 다루는 번역 연구를 위한 입증된 실험 모델을 제공합니다. 특히, 만성 심리사회적 스트레스 패러다임은 인간과 설치류 사이에 유사한 불안/우울과 유사한 행동 표현형을 모방하는 부적응 반응을 유도합니다. 이전 연구에서는 만성 스트레스가 뇌의 신경 전달 물질 함량에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났지만 신경 전달 물질 수용체 수준에 대한 스트레스의 영향은 충분히 연구되지 않았습니다. 이 기사에서는 특히 감정과 인지의 조절과 관련된 감마-아미노부티르산(GABA) 수용체에 초점을 맞춰 만성 스트레스를 받는 생쥐에서 신경 전달 물질 수용체의 신경 전달 물질 수용체의 신경 표면 수준을 정량화하는 실험 방법을 제시합니다. 막 불 투과성 비가역성 화학 가교제 인 bissulfosuccinimidyl suberate (BS3)를 사용하여 만성 스트레스가 전두엽 피질에서 GABAA 수용체의 표면 가용성을 상당히 하향 조절한다는 것을 보여줍니다. GABAA 수용체의 신경 표면 수준은 GABA 신경 전달에 대한 속도 제한 과정이므로 실험 동물 모델에서 불안 / 우울 유사 표현형의 정도에 대한 분자 마커 또는 프록시로 사용될 수 있습니다. 이 가교 접근법은 모든 뇌 영역에서 발현되는 신경 전달 물질 또는 신경 조절제에 대한 다양한 수용체 시스템에 적용할 수 있으며 감정과 인지의 기본 메커니즘에 대한 더 깊은 이해에 기여할 것으로 기대됩니다.
Introduction
신경전달물질 수용체는 뉴런 원형질막 표면 또는 세포내막(예: 엔도솜, 소포체[ER] 또는 트랜스-골지체)에 국한되어 있으며, 뉴런의 내재적 생리학적 상태 또는 외인성 신경망 활동에 대한 반응에 따라 이 두 구획 사이를 동적으로 왕복합니다 1,2. 새로 분비된 신경전달물질은 주로 표면에 국한된 수용체 풀을 통해 생리적 기능을 이끌어내기 때문에, 주어진 신경전달물질에 대한 표면 수용체 수준은 신경 회로 내에서 신호 전달 능력의 중요한 결정 요인 중 하나이다3.
배양된 뉴런의 표면 수용체 수준을 모니터링하기 위해 표면 비오티닐화 분석(surface biotinylation) 분석법4, 비투과화 조건에서 특정 항체를 사용한 면역형광분석법(immunofluorescence assay)5, pH 민감성 형광 광학 지시약(예: pHluorin)6과 유전적으로 융합된 수용체 이식유전자(receptor transgene)의 사용을 포함하여 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 대조적으로, 이러한 접근법은 생체 내에서 표면 수용체 수준을 평가할 때 제한적이거나 비실용적입니다. 예를 들어, 표면 비오티닐화 절차는 상대적으로 높은 가격과 아비딘-접합 비드 상에서 비오티닐화된 단백질을 정제하는 데 필요한 후속 단계로 인해 생체 내 뇌 조직의 대량 및 샘플 수를 처리하는 데 실용적이지 않을 수 있습니다. 3차원 뇌 구조에 내장된 뉴런의 경우 항체 접근성이 낮거나 현미경 기반 정량화의 어려움으로 인해 생체 내 표면 수용체 수준을 평가하는 데 상당한 제한이 있을 수 있습니다. 온전한 뇌에서 신경전달물질 수용체의 분포를 시각화하기 위해, 양전자 방출 단층촬영과 같은 비침습적 방법을 사용하여 수용체 점유를 측정하고 표면 수용체 수준을 추정할 수 있다7. 그러나 이 접근 방식은 특정 무선 리간드의 가용성, 고가의 장비 및 특수 전문 지식에 크게 의존하므로 대부분의 연구자가 일상적으로 사용하기에 접근하기 어렵습니다.
여기에서는 수용성, 막 불투과성 화학 가교제인 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS3)8,9를 사용하여 생체 외에서 실험 동물 뇌의 표면 수용체 수준을 측정하는 간단하고 다재다능한 방법을 설명합니다. BS3는 라이신 잔기의 측쇄에 있는 1차 아민을 표적으로 하며 서로 가까운 거리에서 단백질을 공유 결합할 수 있습니다. 관심 영역에서 뇌 조각을 갓 준비하고 BS3를 포함하는 완충액에서 배양하면 세포 표면 수용체는 이웃 단백질과 가교되어 더 높은 분자량 종으로 변형되는 반면 세포 내 막내 관련 수용체는 변형되지 않은 상태로 유지됩니다. 따라서, 표면 및 세포내 수용체 풀은 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분리되고 연구하고자 하는 수용체에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 정량화될 수 있다.
예측할 수 없는 만성 경미한 스트레스(UCMS)는 설치류에서 만성 심리사회적 스트레스를 유발하기 위한 잘 확립된 실험 패러다임이다10. UCMS는 GABA 및 그 수용체를 포함한 일련의 신경 전달 물질 시스템의 조절을 통해 불안/우울과 유사한 행동 표현형 및 인지 장애를 유발합니다10,11. 특히, α5 서브유닛 함유 GABAA 수용체(α5-GABAAR)는 기억 및 인지 기능의 조절에 연루되어 있으며(12,13), 이는 UCMS 유도 인지 결핍에서 이 서브유닛의 변경된 기능이 관여할 수 있음을 시사합니다. 이 프로토콜에서 우리는 BS3 가교 분석을 사용하여 스트레스를 받지 않은 대조군 마우스와 비교하여 UCMS에 노출된 마우스의 전두엽 피질에서 표면 발현된 α5-GABAAR의 수준을 정량화했습니다.
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Protocol
이 프로토콜의 모든 동물 작업은 온타리오 동물 연구법(RSO 1990, Chapter A.22) 및 캐나다 동물 관리 위원회(CCAC)에 따라 완료되었으며 기관 동물 관리 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물의 준비
- 실험에 사용할 동물 수를 결정하고 적절한 그룹 또는 실험 코호트로 나눕니다. 그룹 크기, 성별 및 통계적 검정력에 대한 토론은 토론 섹션을 참조하십시오.
참고: 이 프로토콜은 마우스(C57BL6/J 균주, 생후 2-4개월, 일반적으로 체중 20-30g, 동등한 수의 수컷과 암컷 사용)에 맞게 맞춤화되었습니다. - 동물을 UCMS 또는 대조군 비스트레스 조건 하에 5-8주 동안 두고, 앞서 기술한 바와 같은 프로토콜에 따라14.
- 마지막 UCMS 절차 후, 수용체 발현에 대한 급성 스트레스 효과를 피하기 위해 가교 분석에 사용하기 전에 동물을 1일 동안 홈 케이지에 머물게 합니다.
2. 원액의 준비
- 분석 전에 지시된 대로 다음 용액을 준비하고 보관하십시오.
- 40mL의 탈이온수에 14.6g의 NaCl을 용해시켜 5M NaCl을 준비합니다. 실온(RT)에서 보관하십시오.
- 3.22g의 KCl을 탈이온수 40mL에 용해시켜 1.08M KCl을 준비합니다. RT에 보관하십시오.
- 3.25g의 MgCl2·6H2O를 40mL의 탈이온수에 용해시켜 400mMMgCl2를 제조한다. RT에 보관하십시오.
- 글리신 3g을 탈이온수 40mL에 용해시켜 1M 글리신을 제조하고 4°C에서 보관한다.
- 1.54g의 DTT를 탈이온수 10mL에 용해시켜 1M 디티오트레이톨(DTT)을 준비합니다. 공극 크기가 0.2μm인 필터를 통해 필터 멸균하고 2mL 튜브에 분취액을 넣습니다. -20 °C에서 보관하십시오.
- 10% Nonidet-P40(NP-40)을 탈이온수에 1:10(v/v)의 비율로 희석하여 준비합니다. RT에 보관하십시오.
- 0.5 M EDTA (pH = 8.0)를 준비하고, RT에서 저장한다.
- 1 M HEPES 완충액(pH = 7.2-7.5)을 준비하고, 4°C에서 보관한다.
- 2.5M 또는 45%(w/v) 포도당을 준비하고 4°C에서 보관합니다.
3. 워크스테이션 준비
- BS3 가교 분석 당일, 동물 해부실(그림 1)에서 얼음 양동이, 금속 온도 블록(얼음 위에서 사전 냉각), 50mL 원추형 튜브에 담긴 얼음처럼 차가운 PBS 및 페트리 접시에 담긴 냉동 PBS, PBS를 적신 여과지, 식힌 평평한 표면 또는 파란색 얼음 위에 놓은 여과지, 얼음에 미리 식힌 뇌 매트릭스(면도날 삽입을 위한 1mm 간격), 얼음에 미리 식힌 면도날(~10), 해부 도구(가위, 집게, 곡선 프로브), 티슈 펀치, 70% 에탄올 스프레이 닦는 종이와 종이 타월, 피펫 팁(200μL), 피펫(P200), 스톱워치, 메모장, 펜 및 미세 원심분리기 튜브(1.5mL).
- 분석에 앞서 미세 원심분리기 튜브에 샘플 정보(예: 동물 ID 번호, 처리 유형[UCMS 대 스트레스 없음(NS)], 뇌 영역, BS3 유무 등)로 라벨을 붙입니다.
참고: BS3 가교 분석의 경우 각 뇌 영역에서 두 개의 샘플을 수집해야 합니다. 하나의 샘플은 가교(BS3 포함)에 사용되고 다른 샘플은 비가교 반응(BS3 제외)에 대조군으로 사용됩니다. 따라서 12마리의 마우스에서 두 개의 뇌 영역(즉, 전전두엽 피질[PFC] 및 해마[HPC])에서 샘플링하기 위해 초기 샘플링을 위해 48개의 튜브에 라벨을 붙입니다(= 12마리의 마우스× 2개 영역 × 2개의 샘플)(섹션 6에서 사용). 나중에 보관할 수 있도록 48개의 튜브로 구성된 추가 두 세트에 라벨을 붙입니다(각 샘플의 두 가지 다른 부피[100μL, 300μL]를 저장하기 위해)(섹션 7에서 사용). 따라서 이 코호트 크기에 대해 총 144개의 튜브에 라벨을 부착해야 합니다.
- 분석에 앞서 미세 원심분리기 튜브에 샘플 정보(예: 동물 ID 번호, 처리 유형[UCMS 대 스트레스 없음(NS)], 뇌 영역, BS3 유무 등)로 라벨을 붙입니다.
- 또한 실험실에서 탁상용 냉장 마이크로 원심 분리기, 초음파 처리기, 튜브 회전 장치 (냉장실 또는 냉장고 내부 [4 ° C]에서 사용), 냉동고 (-80 ° C) 샘플을 저장하기 위한 s, s의 임시 보관을 위한 드라이 아이스 양동이(섹션 7에서 사용)
4. 작업 용액 및 완충액의 준비
참고: 분석 당일 아침에 다음 용액을 준비합니다. 이 계산은 12마리의 생쥐에서 두 개의 뇌 영역(즉, PFC 및 HPC)을 처리하는 데 필요한 솔루션을 기반으로 합니다.
- 표 1에 언급된 바와 같이 인공 뇌척수액(aCSF, pH = 7.4)을 준비한다. 750 μL의 aCSF를 각 샘플링 튜브 (3.1.1 단계에서 라벨링 된 48 개의 튜브)에 분배하고 얼음 위의 금속 온도 블록에 넣어 완충액을 미리 냉각시킵니다.
- 표 2에 언급된 용해 완충액을 준비한다. 얼음 위에 보관합니다(시료당 400 μL 사용).
- 5 mM 구연산 나트륨 완충액(pH = 5.0)에 52 mM BS3 원액(26x)을 준비한다.
- 먼저, 100 mM 시트르산 (스톡 A) 및 100 mM 시트르산 나트륨 (스톡 B)을 준비한다.
- 스톡 A와 스톡 B를 탈이온수로 1:20의 비율로 희석합니다. 물 1.9mL에 각각 100μL를 첨가하여 각각 5mM 시트르산(스톡 C) 및 5mM 시트르산나트륨(스톡 D)을 제조합니다.
- 410 μL의 스톡 C와 590 μL의 스톡 D를 혼합하여 5 mM 시트르산나트륨 완충액(pH = 5.0)(용액 E, 1 mL)을 제조하였다.
- pH 표시기 스트립을 사용하여 용액 E의 pH를 확인합니다.
- 24 μL의 BS3를 806.4 μL의 용액 E에 용해시키고 30 초 동안 볼텍싱하여 BS3 원액 (26x)을 제조한다.
- 비가교 샘플에 대한 비히클 대조군으로 사용하기 위해 용액 E 1mL를 추가로 준비합니다.
알림: 다른 모든 것이 준비되고 실험이 시작되려고 할 때 BS3 원액을 준비합니다. BS3는 사용할 때까지 4 °C에서 건조된 상태로 보관해야 합니다. 일단 재구성되면 BS3는 약 ≤3시간 동안만 활성 상태를 유지합니다. 5mM 구연산 나트륨 완충액(용액 E)의 pH가 시간이 지남에 따라 상승하여 BS3 가수분해를 가속화하는 것으로 보고되었으므로 용액 E는 원액 A 및 B9에서 신선하게 준비하는 것이 좋습니다. 저온에 BS3의 한정된 가용성으로 인해, RT에 재구성된 BS3를 지키십시오. 3 h에 있는 재구성된 BS3를 다 써버리고, 재구성된 BS3를 동결/해동하거나 재사용하지 마십시오.
5. 뇌 조직의 해부
알림: 이 단계부터 적어도 두 사람이 조정된 방식으로 함께 작업해야 합니다. 한 사람이 동물 해부에 집중하는 동안(5.2-5.10단계 및 6.3단계), 다른 사람은 계시원으로 일하면서 분석 조정을 도와야 합니다(5.1단계, 6.1단계, 6.2단계, 6.4단계 및 6.5단계)
- 해부를 위해 첫 번째 동물을 주거 지역에서 해부실로 데려옵니다.
참고: 급성 스트레스 요인(예: 새로운 환경, 혈액 냄새)이 뇌 단백질 역학에 영향을 미칠 수 있으므로 동물을 해부 구역에서 멀리 떨어진 집 우리에 보관한 다음 즉시 참수를 위해 해부실로 개별적으로 가져와야 합니다. - 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킨 후 참수하십시오. 두개골에서 뇌를 빠르게 제거하고 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 PBS에 10-15초 동안 담급니다(그림 2).
참고: BS3 실험을 위해 동물을 마취하지 않았는데, 그 이유는 어떤 마취제도 신경전달물질 수용체의 표면 발현 수준에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있기 때문이다9. - 차가워진 뇌를 얼음 위의 뇌 매트릭스에 넣고 뇌의 복부 쪽이 위를 향하도록 합니다(그림 3).
- 첫 번째 면도날을 후각 구근과 후각 꽃자루 사이의 경계를 통해 삽입하여 뇌를 관상 동맥으로 절단합니다(그림 4). 3-4개의 추가 면도날을 사용하여 뇌의 앞부분을 1mm 간격으로 관상적으로 연속적으로 절단합니다.
- 삽입된 모든 면도날을 함께 잡고 뇌의 뒤쪽 부분을 뇌 매트릭스에 남겨 두어 뇌 매트릭스에서 관상 조각을 들어 올립니다. 집게를 사용하여 면도날을 서로 분리하고 뇌 조각이 위를 향하도록 평평하고 차가운 표면에 놓습니다(그림 5).
- 관심 영역이 포함된 슬라이스를 식별합니다. PFC를 샘플링하려면 후각 꽃자루가 포함된 첫 번째 슬라이스 뒤쪽의 두 번째 및 세 번째 슬라이스를 선택합니다.
- 티슈 펀치(비디오 1)를 사용하여 관심 영역을 제거하고 식힌 면도날에 따로 놓고 조직을 두 개로 고르게 나눕니다(예: 왼쪽 반구와 오른쪽 반구의 조직, 절반은 BS3 가교 반응에 사용하고 나머지 절반은 관심 대상 단백질이 양쪽 반구에서 동일하게 발현되는 경우 가교 없는 제어에 사용됨).
- 조직을 으깨거나 갈지 대신 면도날에 대해 여러 수직 동작(비디오 2)을 사용하여 면도날의 미세한 끝을 사용하여 면도날에서 각 조직을 조각으로 다집니다. 이것은 세포의 막 무결성을 심각하게 손상시키지 않고 BS3에 접근할 수 있는 표면적을 최대화합니다. 다진 직후 다진 조직을 적절한 튜브에 옮깁니다 (6.3 단계 참조).
- HPC를 샘플링하려면 뇌의 뒤쪽 부분을 매트릭스에서 꺼내고 등쪽이 위를 향하도록 차갑고 평평한 표면의 축축한 여과지 위에 뇌를 놓습니다(그림 6).
- 구부러진 프로브와 집게를 사용하고 등쪽(비디오 3)에서 접근하여 양쪽 반구(BS3 가교의 경우 절반, 대조군의 경우 나머지 절반)에서 HPC(등쪽 절반, 복부 절반 또는 둘 다)를 해부합니다. 5.8단계에서와 같이 각 조직을 다듬고 조직을 적절한 튜브에 옮깁니다(6.3단계 참조).
참고: 실험 조건과 결과가 일치하려면 각 동물의 전체 해부 시간을 ~5분으로 유지해야 합니다.
6. 가교 반응
- 이전 마우스의 뇌 해부가 거의 끝나려고 할 때 해부를 위해 다음 동물을 주거 구역에서 해부실로 데려옵니다(5.10단계).
- 다진 조직이 적절한 튜브로 옮겨질 준비가 되기 직전에 얼음 위에서 미리 냉각된 튜브(4.1단계부터)에 30μL의 BS3 용액(26x) 또는 비히클 용액 E를 주입합니다. 튜브 사이의 피펫 팁을 변경하여 가교되지 않는 제어 튜브에서 BS3가 오염되지 않도록 합니다.
- 다진 조직 (5.8 단계 및 5.10 단계)을 적절한 튜브에 옮긴 후 다음 동물 해부를 시작합니다 (5.2 단계)
- 튜브를 뒤집고 혼합하여 조직 덩어리를 더 작은 조각으로 분해하고(비디오 4) 냉장실의 튜브 회전자에서 30분에서 2시간 동안 샘플 배양을 시작합니다. 각 튜브에 대한 BS3 배양 시작 시간을 기록합니다. 최적의 배양 시간에 대해서는 토론 섹션을 참조하십시오.
- 튜브에 1M 글리신 78μL를 스파이킹하여 반응을 종료하고 일정한 회전으로 4°C에서 10분 동안 샘플을 추가로 배양합니다. 각 튜브의 담금질 시작 및 종료 시간을 기록합니다. 다음 동물을 데려오고(6.1단계) 가교를 돕고(6.2단계) 동물 해부에 집중하는 사람을 계속 돕습니다.
알림: 각 샘플을 모든 샘플에서 정확히 동일한 타이밍으로 처리하십시오. 해부실이 냉장실에서 멀리 떨어져 있는 경우 냉장실에서 샘플 배양 및 담금질에 참여할 제3자를 모집하는 것이 좋습니다.
7. 조직 용해, 단백질 준비 및 웨스턴 블롯
- 담금질 10분 후(단계 6.5), 샘플을 4°C에서 20,000 x g 로 2분 동안 회전시키고, 상청액을 버린다. 세 번째 사람을 사용할 수 있는 경우 7.2단계로 진행합니다. 그렇지 않으면 샘플을 드라이 아이스에서 급속 냉동하고 모든 동물에 대한 뇌 해부 (섹션 5) 및 가교 (섹션 6)가 완료 될 때까지 분석을 일시 중지합니다.
- 튜브당 400 μL의 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 추가합니다.
- 샘플을 얼음 위에 유지하면서 5 초 간격으로 1 초 동안 샘플을 5 회 초음파 처리합니다.
- 샘플을 20,000 x g 에서 2분 동안 회전시켜 불용성 조직 파편(펠릿)을 회전시키고 상층액을 저장합니다.
- 비신코닉산(BCA) 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정하기 위해 상청액 5μL를 사용합니다.
- 나머지 상청액을 두 개의 튜브로 나눕니다. 한 튜브에는 후속 웨스턴 블롯을 위한 100μL의 상청액이 들어 있고, 다른 튜브에는 -80°C에서 장기 보관을 위한 나머지(~300μL)가 들어 있습니다. 적절한 양의 4x SDS 샘플 버퍼(β2-메르캅토에탄올로 보충됨)를 샘플에 추가하고 70°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 전기영동(SDS-PAGE)을 위해 아크릴아미드 겔에서 웰당 10-20μg의 단백질을 실행한 다음 웨스턴 블롯 분석을 위해 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮깁니다.
- RT에서 1시간 동안 0.1% Tween-20(TBS-T)을 함유하는 Tris-완충 식염수에 용해된 5%(w/v) 탈지유로 PVDF 막을 차단합니다.
- 멤브레인을 TBS-T로 2회 간략하게 세척하고, 4°C에서 밤새 TBS-T에 희석된 1차 항체와 함께 인큐베이션한다.
- 1차 항체를 RT에서 TBS-T에서 각각 10분 동안 3회 세척한다.
- RT에서 1시간 동안 TBS-T에 희석된 양 고추 냉이 과산화효소 접합 2차 항체와 함께 멤브레인을 배양합니다.
- 2차 항체를 RT에서 TBS-T로 각각 10분 동안 3회 세척한다.
- 강화된 화학발광 시약에서 멤브레인을 인큐베이션하고, 겔 문서화 장치를 사용하여 신호를 검출한다.
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Representative Results
마우스 PFC에서 표면 α5-GABA AR 수준을 평가하기 위한 BS3 가교 분석의 타당성을 입증하기 위해, 우리는 SDS-PAGE에서 BS3 가교 및 비가교 단백질 샘플 각각 10μg을 실행하고 항-α5-GABAAR항체(토끼 다클론)를 사용하여 웨스턴 블롯으로 단백질을 분석했습니다(그림 7). 비-가교 단백질 샘플은 ~55 kDa에서 α5-GABA AR의 총량을 제공하는 반면, BS3-가교 단백질 샘플은 α5-GABAAR에 공유 가교결합된 단백질 복합체를 나타내는 고분자량 단백질 종과 함께 일정량의 내막 관련 α5-GABAAR(~55 kDa에서 이동)을 생성하였다. 표면 α5-GABAAR수준의 정량화를 위해, 우리는 가교 결합시 총 풀에서 ~ 55 kDa에서 α5-GABAAR의 고갈 정도를 평가할 수 있습니다. 실제적으로, α5-GABAAR의 표면 레벨은 전체 α5-GABAAR 레벨(비가교 샘플 레인에서 ~55 kDa)로부터 막내막 관련 α5-GABAAR의 양(가교결합된 샘플 레인에서 ~55 kDa에서)을 뺀 것으로 계산할 수 있다.
다음으로 마우스 PFC의 표면 및 총 α5-GABAAR수준에 대한 UCMS의 효과(3주 및 5주)를 평가했습니다. 본 실험에서는 가교 반응의 시간 경과를 따르기 위하여 BS3 첨가 후 1시간, 2시간, 3시간에 시료를 준비하였다. BS3 가교 반응이 2시간까지 고원에 도달하는 것으로 나타났기 때문에 1시간 시점의 데이터를 사용하여 그래프를 그렸습니다. 우리는 스트레스가 없는 대조군 마우스와 비교하여 UCMS의 3주 및 5주에서 PFC에서 표면 α5-GABAAR수준의 유의하고 점진적인 감소를 관찰했습니다(그림 8). 데이터는 이러한 실험 조건 하에서 총 수용체 수준의 명백한 변화가 무시할 수 있거나 전혀 나타나지 않았으며, 이는 만성 스트레스가 α5-GABAAR 세포 표면으로의 이동에 특이적으로 영향을 미친다는 것을 시사합니다.
그림 1: BS3 가교 분석에 사용된 해부 도구. 여과지를 얼음처럼 차가운 PBS에 적셔 푸른 얼음의 평평한 표면에 놓습니다. PBS로 채워지고 분석 1일 전에 -20°C에서 보관된 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 뇌 매트릭스와 면도날은 얼음 위에서 미리 냉각됩니다. 가위(큰 가위, 작은 가위), 집게(큰 것, 작은 것 몇 개) 및 티슈 펀치는 모두 분석 전에 세척됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전체 마우스 뇌를 두개골에서 해부하여 얼음처럼 차가운 PBS에 넣었습니다. 전체 뇌가 두개골에서 제거된 직후, 얼음 위의 페트리 접시에 10-15초 동안 얼음처럼 차가운 PBS에 잠겼습니다. 이것은 뇌 신진대사를 늦추고 단백질 이동과 분해를 최소화하는 동시에 조직이 더 단단해지도록 도와줌으로써 후속 뇌 절단을 더 쉽게 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 뇌 매트릭스에 배치된 쥐의 뇌. 얼음처럼 차가운 PBS에 잠긴 식힌 쥐의 뇌를 뇌 기질로 옮기고 복부 쪽이 위를 향하도록 배치했습니다. 면도날과 매트릭스는 얼음 위에서 미리 냉각되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 뇌 매트릭스에서 마우스 뇌의 관상 절편. 첫 번째 미리 식힌 면도날을 후각 구근과 후각 꽃자루 사이의 경계를 통해 삽입하여 뇌를 관상 절편하기 시작했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 쥐 뇌의 직렬 관상 절편. 마우스 뇌의 앞쪽 부분은 5개의 면도날을 뇌 매트릭스에 직렬로 삽입하여(1mm 간격) 관상적으로 절단했습니다. 삽입된 모든 블레이드를 함께 고정하고, 매트릭스에서 들어 올리고, 집게를 사용하여 서로 분리하고, 뇌 슬라이스가 위를 향하도록 차갑고 평평한 표면에 놓았습니다. (왼쪽 위) 후각 전구; (왼쪽 가운데) 첫 번째 섹션; 두 번째 (왼쪽 아래) 및 세 번째 (오른쪽 위) 섹션은 PFC 조직을 샘플링하는 데 사용되었습니다. (오른쪽 아래) 네 번째 섹션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 해마를 해부하기 위한 뇌의 뒤쪽 부분. 뇌의 앞부분을 면도날로 치상식으로 절단한 후(왼쪽), 뇌의 뒤쪽 부분(가운데)을 뇌 매트릭스에서 꺼내 차가운 표면(오른쪽)의 PBS에 적신 여과지에 놓았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 세포 표면에서 GABAAR의 BS3 가교결합. BS3의 존재 하에서, 원형질막 표면의 α5-GABAAR은 펜타머 GABA AR 어셈블리 내의 다른 GABAAR서브유닛 또는 추가적인 이웃 단백질 (X)과 같은 익명의 단백질과 가교결합되지만, 단백질 (Y)과는 멀리 떨어져 있지 않다. 따라서, α5-GABAAR은 블롯 상에 고분자량 (HMW) 단백질 종으로서 나타난다. 엔도솜의 α5-GABAAR은 손상되지 않은 상태로 유지되며 ~55kDa의 예상 크기로 이동합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: UCMS의 영향을 받는 표면 α5-GABAAR 수준. 스트레스가 없고 UCMS(3주 및 5주) 조건 하에서 마우스의 PFC에서 α5-GABAAR의 총 및 표면 수준을 모두 평가하였다. 가교 반응의 시간 경과를 따르기 위해, 샘플은 BS3의 첨가 후 1시간, 2시간 및 3시간에 제조되었다. 암컷 마우스(2-3개월, N=4/그룹)를 사용하였다. 각 조건에 대한 55 kDa에서의온전한 α5-GABA AR 수준을 먼저 상응하는 αTubulin 수준에 의해 정규화한 다음, 총 및 막내막 관련 α5-GABAAR수준을 계산하기 위해 사용하였다(각각 비-가교 [No Xlink] 및 가교 [Xlink] 샘플에서). 이어서, 표면 수용체 수준은 전체 수준에서 내막 연관 양을 뺀 값으로 계산되었습니다. BS3 가교 반응이 2시간까지 고원에 도달하는 것으로 나타났기 때문에 1시간 시점의 데이터를 사용하여 그래프를 표시했습니다(평균 ± SEM). 표면 α5-GABA AR 수준에 대한 만성 스트레스의 유의한 효과가 관찰되었으며, 이 효과는 UCMS 기간에 걸쳐 표면 α5-GABAAR수준의 점진적인 감소가 확인되었기 때문에 UCMS 지속 기간 의존적이었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01(Dunn의 다중 비교를 사용한 Kruskal-Wallis 검정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 작업 conc. | 원액 | 분배할 원액의 양 |
| 1.2 mMCaCl2 | 480mM(400배)* | 100 μL |
| 20 mM 헤페스 | 1 M (50배) | 800 μL |
| 147 mM 염화나트륨 | 5 M (34배) | 1176.5 마이크로리터 |
| 2.7mM KCl | 1.08 미터 (400x) | 100 μL |
| 1 mMMgCl2 | 400 mM (400배) | 100 μL |
| 10mM 포도당 | 2.5 미터 (250x) | 160 μL |
| 탈이온수 | 37.563 mL의 | |
| 합계 | 40 밀리리터 | |
| *CaCl2 스톡은 실험 당일 신선하게 준비해야 합니다. | ||
표 1 : 인공 뇌척수액의 조성.
| 작업 conc. | 원액 | 분배할 원액의 양 |
| 25 mM 헤페스 | 1 M (40배) | 500 μL |
| 500mM 염화나트륨 | 5 M (10배) | 2 밀리리터 |
| 2mM EDTA | 0.5 M (250배) | 80 μL |
| 1mM DTT | 1 M (1000배) | 20 마이크로리터 |
| 0.1% NP-40 | 10% (100배) | 200 μL |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | 100배 | 200 μL |
| 탈이온수 | 17 mL | |
| 합계 | 20 밀리리터 |
표 2: 용해 완충액의 조성
비디오 1: 티슈 펀치를 사용하여 PFC를 분리합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 집게를 사용하여 PFC 다지기. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 3: 곡선형 프로브와 집게를 사용한 HPC 해부. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 4: 조직 샘플의 반전 혼합. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
만성적인 심리사회적 스트레스가 행동(즉, 감정 및 인지 장애)과 분자 변화(즉, GABAergic 유전자의 발현 감소 및 GABAergic 신경전달의 수반되는 결핍)에 미치는 영향은 잘 문서화되어 있지만10, 이러한 결핍의 기저에 있는 메커니즘은 추가 조사가 필요하다. 특히, 만성 스트레스가 ER 기능에 과부하를 일으켜 신경세포 프로테옴에 상당한 영향을 미치고 따라서 ER 스트레스가 상승한다는 것을 보여주는 최근 연구를 감안할 때15, 만성 스트레스가 ER 막을 통한 GABAAR 트래피킹에 영향을 미치는지 여부와 GABAAR의 변화된 트래피킹 또는 표면 수준이 어떻게 정신병리와 인과적으로 연결될 수 있는지에 대한 질문이 남아 있습니다.
이 프로토콜에 표시된 BS3 가교 분석은 이러한 질문 중 일부에 답하기 위한 강력한 접근 방식으로 작용할 것입니다. 예를 들어, UCMS는 UCMS10의 지속 기간에 따라 인지 결핍, 불안 유사 행동 및 무쾌감 표현형을 포함한 일련의 행동 변화를 유도하는 것으로 알려져 있습니다. 따라서, UCMS 시작부터 연속적인 시점(예를 들어, 1주, 3주, 5주)에서 마우스 뇌를 샘플링함으로써 표면 α5-GABAAR수준의 시간 경과 및 UCMS 유도 변화의 정도를 연구하는 것이 가능할 것이며, 또한 각 시점에서 관찰된 행동 표현형과 교차 비교하는 것이 가능할 것이다. 추가 GABAAR아형(예: α1, α2) 및 만성 스트레스의 영향을 받는 것으로 알려진 신경 조절제에 대한 수용체(예: 뇌 유래 신경영양 인자[BDNF]에 대한 TrkB 수용체)10 는 동일한 샘플을 사용하여 동시에 테스트할 수 있습니다. 이러한 수용체 시스템 및 하위 유형 중 일부는 특정 행동 영역(예: 진정, 불안, 인지)에 선택적으로 연루되어 있기 때문에11, 행동 변화를 각 시점에서 UCMS에 의해 영향을 받는 수용체의 유형 및 정도와 연관시킬 가치가 있습니다.
다음은 프로토콜의 여러 단계에서 고려해야 할 중요한 사항입니다. 첫 번째 단계는 실험 설계 및 검정력 분석을 기반으로 사용할 필요하고 충분한 동물 수를 결정하는 것입니다. 예를 들어, 표면 GABAA 수용체 수준에 대한 만성 스트레스의 영향을 연구하기 위해, 우리는 일상적으로 한 그룹의 마우스 (N = 6 / sex)를 5 주 동안 UCMS에 노출시키고 다른 그룹 (N = 6 / sex)을 스트레스가없는 상태로 유지합니다. 이 그룹 크기(남녀 모두 포함하여 총 N = 24)는 수용체 수준의 ~20% 차이를 감지하기에 충분한 통계적 검정력을 제공하여 스트레스 효과와 성 효과를 모두 평가할 수 있을 것으로 예상됩니다. 특히, 만성 스트레스는 행동 및 분자 결과에서 성별에 따른 차이를 유발하는 것으로 보고되었다10. 예를 들어, 여성은 일반적으로 남성보다 우울 증상이 나타나기 쉽습니다. 일관되게, 인간의 사후 및 설치류 뇌를 사용한 우리의 연구는 여성 피험자에서 더 높은 수준의 행동 및 분자 병리를 나타냅니다. 우울증의 분자 표지자인 소마토스타틴(somatostatin, SST)의 수치가 하향 조절되는 것은 우울증 환자 중 여성에서 더 강력하게 나타났으며16, 우울 병리의 양상을 복제한 암컷 마우스 모델에서는 남성보다 감정 증가가 더 강했다15,17. 따라서 만성 스트레스가 정신병리학적 결과에 미치는 영향을 다루는 모든 실험 설계에는 데이터 분석에서 통계적 검정력을 보장하고 가능한 성별 의존적 효과를 식별하기 위해 적절한 수의 남성과 여성 모두를 포함해야 합니다.
BS3를 사용한 최적의 배양 시간은 연구할 각 수용체에 대한 파일럿 실험에서 결정되어야 합니다. 수용체 이동(receptor trafficking)은 시료 배양 중 저온에서도 서서히 발생할 수 있다고 보고되었다9. 뇌 해부 시 정확한 표면 수용체 수준을 포착하려면 배양 시간을 최소화하고 가교 반응이 고원에 도달하기 직전의 시점(4°C에서 30분에서 2시간)을 선택하는 것이 이상적입니다.
우리는 BS3 가교 분석과 관련된 몇 가지 운영상의 한계를 발견했습니다. (1) 첫째, 생리학적 pH 범위 내에서 자발적인 가수분해로 인한 BS3의 반감기(2-3시간)가 상대적으로 짧기 때문에 이 기간 내에 동물 해부 및 가교 반응을 완료해야 합니다. 이로 인해 한 번에 해부할 수 있는 동물의 수를 최대 12마리로 제한했습니다. 실험자가 12 마리 이상의 동물을 해부 할 계획이라면 실험 코호트를 여러 그룹으로 나누고 각 그룹에는 12 마리 미만의 동물이 포함되어있는 것이 좋습니다. 한 그룹에 대한 분석이 완료된 후 BS3의 새로운 배치를 다음 그룹에 대한 후속 가교 분석에 사용하기 위해 새로 준비해야 합니다. 같은 맥락에서, 한 동물에서 해부 할 관심 영역의 수는 제한되어야한다. 우리는 가교 분석을 위해 일상적으로 두 개의 뇌 영역(PFC, HPC)에서 샘플링을 하며, 이는 샘플 간 변동성을 최소화하면서 일관된 결과를 얻기 위해 해부할 수 있는 최대 뇌 영역 수입니다. (2) 둘째, 웨스턴 블랏에 사용되는 항체의 특이성을 신중하게 평가해야 한다. BS3 화학적 가교 반응은 각 항체에서 검출하는 단백질의 항원성에 예상치 못한 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 하나의 α5-GABA를 발견했습니다.AR 항체(에 명시됨) 재료 표) α5-GABA의 유무에 관계없이 BS3 가교 샘플에서 특히 강한 ~50kDa 대역을 잘못 감지했습니다.A시료 중의 R 단백질; 이 ~50 kDa 밴드는 α5-GABA의 조직 샘플에서도 나타났습니다AR 녹아웃 마우스는 이 항체가 BS3 가교 반응에 의해 우발적으로 생성된 관련 없는 항원과 교차 반응하기 시작했음을 시사합니다. 항체 특이성은 BS3 가교 반응의 유무에 관계없이 철저히 결정되며, 가능한 경우 주어진 관심 단백질에 대해 녹아웃 조직 샘플을 사용하는 것이 이상적입니다. (3) 여기에 기술된 현재의 프로토콜은 각각의 GABA가 있는 세포 타입을 다루지 않는다AR 서브타입(예를 들어, 뉴런 및 성상세포)이 발현된다. 일부 GABA의 경우AR 아형(예: α1, α5)은 뉴런에서 주로 발현됩니다18이 프로토콜에 설명된 바와 같이, 벌크 뇌 조직을 사용하여 얻은 가교 분석 데이터는 뉴런 표면 수준을 반영하는 정보를 제공해야 합니다. 그러나 다른 GABA의 경우AR 아형(예: α2)은 뉴런과 성상교세포 모두에서 고도로 발현됩니다18, 뉴런 대 성상교세포의 수용체 표면 수준을 개별적으로 연구하는 것이 중요합니다. 이를 위해, 종래의 세포 분류(예를 들어, 형광 활성화 세포 분류[FACS]19)는 BS3 가교 프로토콜에 통합될 수 있고; 세포 분류를 위한 세포 해리 단계는 BS3 담금질 단계 후에 수행할 수 있지만 FACS에 대한 모든 절차 및 조건(예: 사용할 완충액, 온도, 배양 시간)이 가교 분석의 절차와 호환되는지 확인해야 합니다. 또한, FACS 접근법은 GABA에 대해서만 사용될 수 있다AR 아형은 과동수 세포 구획(예: α2)에 국한된 것으로 알려져 있지만 원위 수상돌기(예: α5)가 풍부한 아형에는 국한되지 않습니다.18말초 또는 원위 세포 구획은 세포 분류에 필요한 광범위한 세포 해리 단계 동안 손실될 가능성이 높기 때문입니다. (4) 마지막으로, 고분자량 단백질 종의 밀도 측정을 기반으로 표면 수준을 직접 평가하기보다는 수용체 총량에서 막내막 관련 수용체의 양을 빼서 표면 수용체 수준을 계산했을 때 결과가 더 일관성이 있음을 발견했습니다. 이는 PVDF 멤브레인으로의 이러한 고분자량 단백질 종의 전달 효율이 더 작은 크기(예: α5-GABA의 경우 ~55kDa)의 원래 온전한 단백질보다 더 가변적이기 때문일 수 있습니다A따라서 결과 섹션에 설명된 방법과 의 범례를 따르는 것이 좋습니다. 그림 8 표면 수용체 수준을 계산합니다.
GABAAR에 대한 만성 스트레스의 영향 외에도 BS3 가교 분석은 여러 신경학적 또는 신경정신과적 상태를 조사하기 위한 실험적 조작을 통해 유전자 변형 마우스 또는 설치류 모델에도 적용할 수 있습니다. 이 분석은 쥐 뇌의 측좌핵에서 글루타메이트 수용체의 표면 발현에 대한 코카인 유도 효과를 포착하는 데 성공적으로 사용되었습니다20,21. 이 분석은 또한 이형접합체 BDNF 녹아웃 마우스의 PFC에서 α5-GABAAR의 감소된 표면 발현을 보여주기 위해 사용되었습니다22. 또 다른 이전 연구에서, 쥐의 간성 뇌병증 모델에서 수반되는 공간 학습 결손은 이 가교 분석에 기초한 글루타메이트 및 GABAA 수용체의 변경된 표면 발현과 인과적으로 연관되어 있었다23. 요약하면, BS3 화학적 가교 분석은 뇌의 다양한 수용체 시스템뿐만 아니라 거의 모든 다른 말초 조직 또는 기관에서 뇌 영역별 및 상황 의존적 변화를 포착하기 위한 다목적 도구를 제공합니다. 이 분석은 또한 강장제 억제(특히 α5-GABAAR의 경우), 극저온 전자 현미경 및 표면 비오티닐화의 전기생리학적 기록과 같은 표면 수용체 수준을 평가하기 위한 다른 방법과 병행하여 수행하여 결과를 교차 비교 및 검증할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.
Acknowledgments
저자는 연구 기간 동안 동물을 돌봐준 CAMH 동물 시설 직원에게 감사를 표합니다. 이 연구는 캐나다 보건 연구소 (CIHR 프로젝트 보조금 # 470458 TT), CAMH의 디스커버리 펀드 (TP), 정신 분열증 및 우울증 연구를위한 전국 연합 (NARSAD 상 # 25637 ES) 및 캠벨 가족 정신 건강 연구소 (ES). E.S.는 새로운 GABAergic 화합물을 클리닉에 도입하는 데 전념하는 바이오 제약 회사인 Damona Pharmaceuticals의 설립자입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
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