Summary
O ensaio químico de reticulação BS3 revela expressão reduzida do receptor GABAA na superfície celular em cérebros de camundongos sob condições de estresse psicossocial crônico.
Abstract
A ansiedade é um estado de emoção que afeta variavelmente os comportamentos dos animais, incluindo as funções cognitivas. Sinais comportamentais de ansiedade são observados em todo o reino animal e podem ser reconhecidos como respostas adaptativas ou mal-adaptativas a uma ampla gama de modalidades de estresse. Roedores fornecem um modelo experimental comprovado para estudos translacionais abordando os mecanismos integrativos da ansiedade nos níveis molecular, celular e de circuito. Em particular, o paradigma do estresse psicossocial crônico provoca respostas desadaptativas mimetizando fenótipos comportamentais semelhantes aos da ansiedade/depressão que são análogos entre humanos e roedores. Enquanto estudos anteriores mostram efeitos significativos do estresse crônico no conteúdo de neurotransmissores no cérebro, o efeito do estresse nos níveis de receptores de neurotransmissores é pouco estudado. Neste artigo, apresentamos um método experimental para quantificar os níveis de superfície neuronal de receptores de neurotransmissores em camundongos sob estresse crônico, especialmente com foco nos receptores do ácido gama-aminobutírico (GABA), que estão implicados na regulação da emoção e cognição. Usando o reticulador químico irreversível impermeável à membrana, bissulfosuccinimidil suberato (BS3), mostramos que o estresse crônico diminui significativamente a disponibilidade superficial dos receptores GABAA no córtex pré-frontal. Os níveis de superfície neuronal dos receptores GABAA são o processo limitante da taxa para a neurotransmissão GABA e poderiam, portanto, ser usados como um marcador molecular ou um proxy do grau de fenótipos ansiosos/depressivos em modelos animais experimentais. Esta abordagem de reticulação é aplicável a uma variedade de sistemas receptores para neurotransmissores ou neuromoduladores expressos em qualquer região do cérebro e espera-se que contribua para uma compreensão mais profunda dos mecanismos subjacentes à emoção e cognição.
Introduction
Os receptores de neurotransmissores estão localizados na superfície da membrana plasmática neuronal ou intracelularmente nas endomembranas (por exemplo, o endossomo, o retículo endoplasmático [RE] ou o aparelho trans-Golgi) e transitam dinamicamente entre esses dois compartimentos, dependendo de estados fisiológicos intrínsecos nos neurônios ou em resposta a atividades de redes neurais extrínsecas 1,2. Uma vez que os neurotransmissores recém-secretados provocam suas funções fisiológicas principalmente através do pool de receptores localizados na superfície, os níveis de receptores de superfície para um determinado neurotransmissor são um dos determinantes críticos de sua capacidade de sinalização dentro do circuito neural3.
Vários métodos estão disponíveis para monitorar os níveis de receptores de superfície em neurônios cultivados, incluindo o ensaio de biotinilação de superfície4, o ensaio de imunofluorescência com um anticorpo específico em condições não permeabilizadas5 ou o uso de um transgene de receptor geneticamente fundido com um indicador óptico fluorescente sensível ao pH (por exemplo, pHluorin)6. Por outro lado, essas abordagens são limitadas ou impraticáveis ao avaliar os níveis de receptores de superfície in vivo. Por exemplo, o procedimento de biotinilação de superfície pode não ser prático para processar grandes quantidades e números de amostras de tecidos cerebrais in vivo devido ao seu preço relativamente alto e às etapas subsequentes necessárias para purificar as proteínas biotiniladas em esferas conjugadas com avidina. Para neurônios embutidos na arquitetura tridimensional do cérebro, a baixa acessibilidade de anticorpos ou dificuldades na quantificação baseada em microscópio podem representar uma limitação significativa para avaliar os níveis de receptores de superfície in vivo. Para visualizar a distribuição dos receptores de neurotransmissores em cérebros intactos, métodos não invasivos, como a tomografia por emissão de pósitrons, poderiam ser usados para medir a ocupação do receptor e estimar os níveis de receptores de superfície7. No entanto, essa abordagem depende criticamente da disponibilidade de radioligantes específicos, equipamentos caros e conhecimentos especiais, tornando-a menos acessível para uso rotineiro pela maioria dos pesquisadores.
Aqui, descrevemos um método simples e versátil para medir os níveis de receptores de superfície em cérebros de animais experimentais ex vivo usando um reticulante químico solúvel em água, impermeável por membrana, bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3)8,9. BS3 tem como alvo aminas primárias na cadeia lateral de resíduos de lisina e pode covalentemente reticular proteínas em estreita proximidade umas das outras. Quando fatias cerebrais são preparadas na hora a partir de uma região de interesse e incubadas em um tampão contendo BS3, os receptores de superfície celular são reticulados com proteínas vizinhas e, assim, transformam-se em espécies de maior peso molecular, enquanto os receptores intracelulares associados à endomembrana permanecem inalterados. Portanto, os pools de receptores intracelulares e de superfície podem ser separados por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE) e quantificados por western blot usando anticorpos específicos para o receptor a ser estudado.
O estresse crônico leve imprevisível (EMCU) é um paradigma experimental bem estabelecido para induzir estresse psicossocial crônico em roedores10. A SCMC provoca fenótipos comportamentais ansiosos/depressivos e déficits cognitivos por meio da modulação de uma série de sistemas de neurotransmissores, incluindo o GABA e seus receptores10,11. Em particular, o receptor GABA A contendo a subunidade α5 (α5-GABAA R) está implicado na regulação da memória e das funções cognitivas12,13, sugerindo o possível envolvimento de funções alteradas dessa subunidade em déficits cognitivos induzidos pelo SGCU. Neste protocolo, usamos o ensaio de reticulação BS3 para quantificar os níveis de α5-GABAAR expresso na superfície no córtex pré-frontal de camundongos expostos à EMCU em comparação com camundongos controles não estressados.
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Protocol
Todo o trabalho com animais neste protocolo foi concluído de acordo com o Ontario Animals for Research Act (RSO 1990, Capítulo A.22) e o Canadian Council on Animal Care (CCAC) e foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais.
1. Preparação dos animais
- Determinar o número de animais a serem usados nos experimentos e dividi-los em grupos apropriados ou coortes experimentais. Veja a seção de discussão para uma discussão sobre o tamanho do grupo, sexo e poder estatístico.
NOTA: Este protocolo é personalizado para camundongos (cepa C57BL6/J; 2-4 meses de idade; tipicamente 20-30 g de peso corporal; números equivalentes de machos e fêmeas a serem usados). - Colocar os animais sob condições de SCMS ou controle sem estresse por 5-8 semanas, seguindo o protocolo descrito anteriormente14.
- Após o último procedimento de UCMS, permitir que os animais permaneçam em suas gaiolas domésticas por 1 dia antes de usá-los para o ensaio de reticulação para evitar efeitos agudos de estresse na expressão do receptor.
2. Preparação das soluções estoque
- Prepare e armazene as seguintes soluções conforme instruído antes do ensaio.
- Preparar 5 M de NaCl dissolvendo 14,6 g de NaCl em 40 mL de água deionizada. Conservar à temperatura ambiente (TR).
- Preparar 1,08 M de KCl dissolvendo 3,22 g de KCl em 40 mL de água deionizada. Loja na RT.
- Preparar 400 mM MgCl 2 dissolvendo 3,25 g de MgCl 2·6H 2O em 40 mL de água deionizada. Loja na RT.
- Preparar 1 M de glicina dissolvendo 3 g de glicina em 40 ml de água deionizada e conservar a 4 °C.
- Preparar 1 M de ditiotreitol (TDT) dissolvendo 1,54 g de TDT em 10 ml de água deionizada. Filtrar-esterilizar através de um filtro com um tamanho de poro de 0,2 μm, e alíquota em tubos de 2 mL. Conservar a -20 °C.
- Preparar 10% Nonidet-P40 (NP-40) diluindo-o na proporção de 1:10 (v/v) em água deionizada. Loja na RT.
- Preparar EDTA 0,5 M (pH = 8,0) e armazenar em RT.
- Preparar tampão HEPES 1 M (pH = 7,2-7,5) e conservar a 4 °C.
- Preparar 2,5 M ou 45% (p/v) de glicose e conservar a 4 °C.
3. Preparação do posto de trabalho
- No dia do ensaio de reticulação BS3, reunir os seguintes materiais na sala de dissecção dos animais (Figura 1), com vários itens pré-resfriados sobre gelo: um balde de gelo, um bloco de temperatura metálico (pré-resfriado sobre gelo), PBS gelado em tubo cônico de 50 mL e PBS congelado em placa de Petri, papel filtro umedecido com PBS e colocado sobre uma superfície plana resfriada ou gelo azul, uma matriz cerebral (intervalo de 1 mm para inserção da lâmina de barbear) pré-resfriada no gelo, lâminas de barbear (~10) pré-resfriadas no gelo, ferramentas de dissecção (tesoura, pinça, sonda curva), um punch de tecido, papel de limpeza com spray de etanol 70% e toalhas de papel, pontas de pipeta (200 μL), um pipetador (P200), um cronômetro, um bloco de notas, uma caneta e tubos de microcentrífuga (1,5 mL).
- Antes do ensaio, rotule os tubos de microcentrífuga com as informações da amostra (por exemplo, número de identificação do animal, tipo de tratamento [SCMS versus sem estresse (NS)], região cerebral, com ou sem BS3, etc.).
NOTA: Para os ensaios de reticulação BS3, duas amostras de cada região do cérebro devem ser coletadas; uma amostra será utilizada para reticulação (com BS3) e a outra para reação sem reticulação (sem BS3) como controle. Portanto, para coletar amostras de duas regiões cerebrais (ou seja, o córtex pré-frontal [PFC] e o hipocampo [HPC]) em 12 camundongos, marque 48 tubos para amostragem inicial (= 2 amostras × 2 regiões × 12 camundongos) (a ser usado na seção 6). Rotular dois conjuntos adicionais de 48 tubos para armazenamento posterior (para armazenar dois volumes diferentes [100 μL, 300 μL] de cada amostra) (a utilizar na secção 7). Assim, é necessário rotular 144 tubos no total para este tamanho de coorte.
- Antes do ensaio, rotule os tubos de microcentrífuga com as informações da amostra (por exemplo, número de identificação do animal, tipo de tratamento [SCMS versus sem estresse (NS)], região cerebral, com ou sem BS3, etc.).
- Além disso, certifique-se de que os seguintes equipamentos estão disponíveis no laboratório: uma microcentrífuga refrigerada de mesa, um sonicador, um rotador de tubo (a utilizar na câmara fria ou no interior do frigorífico [4 °C]), um congelador (-80 °C) para armazenar amostras e um balde de gelo seco para o armazenamento temporário das amostras (a utilizar na secção 7)
4. Preparação das soluções de trabalho e dos tampões
NOTA: Na manhã do ensaio, prepare as seguintes soluções. Este cálculo é baseado nas soluções necessárias para processar duas regiões cerebrais (ou seja, o PFC e HPC) de 12 camundongos.
- Preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF, pH = 7,4) conforme mencionado na Tabela 1. Distribuir 750 μL de aCSF em cada tubo de recolha (os 48 tubos marcados no passo 3.1.1) e colocá-los no bloco de temperatura metálica sobre gelo para pré-arrefecer o tampão.
- Prepare o tampão de lise conforme mencionado na Tabela 2. Conservar no gelo (400 μL a utilizar por amostra).
- Preparar uma solução-mãe BS3 52 mM (26x) em tampão citrato de sódio 5 mM (pH = 5,0).
- Primeiro, preparar 100 mM de ácido cítrico (estoque A) e 100 mM de citrato de sódio (estoque B).
- Diluir o estoque A e o estoque B na proporção de 1:20 com água deionizada. Adicionar 100 μL cada a 1,9 mL de água para preparar 5 mM de ácido cítrico (estoque C) e 5 mM de citrato de sódio (estoque D), respectivamente.
- Misturar 410 μL de C e 590 μL de cal D para preparar um tampão citrato de sódio 5 mM (pH = 5,0) (solução E, 1 ml).
- Confirmar o pH da solução E utilizando uma tira indicadora de pH.
- Dissolver 24 mg de BS3 em 806,4 μL de solução E por vórtice durante 30 s para preparar a solução-mãe BS3 (26x).
- Preparar mais 1 ml de solução E para utilizar como controlo do veículo para as amostras não reticuladas.
NOTA: Prepare a solução de estoque BS3 quando todo o resto estiver pronto e o experimento estiver prestes a começar. O BS3 deve ser armazenado dessecado a 4 °C até à sua utilização. Uma vez reconstituída, a BS3 permanece ativa apenas por aproximadamente ≤3 h. Como o pH do tampão citrato de sódio 5 mM (solução E) aumenta ao longo do tempo, causando hidrólise acelerada do BS3, recomenda-se que a solução E seja preparada fresca a partir das soluções-mãe A e B9. Devido à solubilidade limitada da BS3 a baixas temperaturas, mantenha a BS3 reconstituída em RT. Use a BS3 reconstituída em 3 h e não congele/descongele ou reutilize a BS3 reconstituída.
5. Dissecção dos tecidos cerebrais
NOTA: A partir desta etapa, pelo menos duas pessoas devem trabalhar juntas de forma coordenada. Enquanto uma pessoa se concentra na dissecção do animal (passos 5.2-5.10 e passo 6.3), a outra pessoa deve trabalhar como cronometrista e ajudar a coordenar o ensaio (passo 5.1, passo 6.1, passo 6.2, passo 6.4 e passo 6.5)
- Trazer o primeiro animal para dissecação da área de alojamento para a sala de dissecação.
NOTA: Como os estressores agudos (por exemplo, um ambiente novo, o cheiro de sangue) podem afetar a dinâmica das proteínas cerebrais, os animais devem ser mantidos em suas gaiolas domésticas colocadas longe da área de dissecção e, em seguida, ser trazidos individualmente para a sala de dissecção para decapitação imediata. - Eutanásia do camundongo por deslocamento cervical seguido de decapitação. Remova o cérebro rapidamente para fora do crânio e submerja-o em PBS gelado em uma placa de Petri por 10-15 s (Figura 2).
NOTA: Os animais não são anestesiados para experimentos com BS3, pois qualquer agente anestésico poderia potencialmente influenciar o nível de apresentação superficial dos receptores de neurotransmissores9. - Coloque o cérebro resfriado na matriz cerebral sobre gelo, com o lado ventral do cérebro voltado para cima (Figura 3).
- Inserir a primeira lâmina de barbear através da borda entre o bulbo olfatório e o pedúnculo olfatório para cortar o cérebro coronalmente (Figura 4). Usando três a quatro lâminas de barbear adicionais, corte em série a parte anterior do cérebro coronalmente com intervalos de 1 mm.
- Levante as fatias coronais da matriz cerebral mantendo todas as lâminas de barbear inseridas juntas, deixando a parte posterior do cérebro para trás na matriz cerebral. Use pinças para separar as lâminas de barbear umas das outras e coloque-as na superfície plana e gelada com o corte cerebral voltado para cima (Figura 5).
- Identifique as fatias que contêm a região de interesse. Para amostragem do PFC, escolher o segundo e terceiro cortes posteriores ao primeiro corte contendo o pedúnculo olfatório.
- Remova a região de interesse usando um punch de tecido (Vídeo 1), coloque-a de lado na lâmina de barbear resfriada e divida uniformemente o tecido em dois (por exemplo, tecidos do hemisfério esquerdo versus direito, com uma metade a ser usada para a reação de reticulação BS3 e a outra metade para o controle sem reticulação se a proteína-alvo de interesse for igualmente expressa em ambos os hemisférios).
- Pique cada tecido em pedaços na lâmina de barbear usando a ponta fina da pinça com vários movimentos verticais contra a lâmina (Vídeo 2) em vez de triturar ou triturar os tecidos. Isso maximizará a área de superfície acessível ao BS3 sem comprometer severamente a integridade da membrana das células. Imediatamente após a picagem, transfira os tecidos picados para os tubos apropriados (ver passo 6.3).
- Para a amostragem do HPC, retire a parte posterior do cérebro da matriz e coloque o cérebro em papel de filtro umedecido sobre a superfície plana resfriada, com o lado dorsal voltado para cima (Figura 6).
- Usando uma sonda curva e pinças, e aproximando-se do lado dorsal (Vídeo 3), dissecar o HPC (metade dorsal, metade ventral ou ambos) de ambos os hemisférios (metade para a reticulação BS3 e a outra metade para o controle). Pique cada tecido como no passo 5.8 e transfira o tecido para tubos apropriados (ver passo 6.3).
NOTA: Todo o tempo de dissecção para cada animal deve ser mantido em ~5 min para que as condições experimentais e os resultados sejam consistentes.
6. Reação de reticulação
- Levar o próximo animal para dissecção da área de alojamento para a sala de dissecção quando a dissecção do cérebro do rato anterior estiver prestes a terminar (passo 5.10).
- Colocar o tubo pré-refrigerado no gelo (a partir do passo 4.1) com 30 μL de solução BS3 (26x) ou solução E do veículo imediatamente antes de os tecidos picados estarem prontos para serem transferidos para os tubos adequados. Troque as pontas dos tubos entre os tubos para garantir que nenhum BS3 esteja contaminado nos tubos de controle sem reticulação.
- Transferir os tecidos picados (dos passos 5.8 e 5.10) para os tubos apropriados e, em seguida, começar a dissecar o próximo animal (passo 5.2)
- Inverter e misturar o tubo para quebrar os pedaços de tecido em pedaços menores (Vídeo 4), e começar a incubar as amostras no rotador do tubo na câmara fria por 30 min a 2 h. Registre a hora de início da incubação BS3 para cada tubo. Consulte a seção de discussão para obter o tempo ideal de incubação.
- Atenuar a reacção picando o tubo com 78 μL de glicina 1 M e incubar a amostra durante 10 minutos a 4 °C com rotação constante. Registre o tempo de início e término da têmpera para cada tubo. Continue auxiliando a pessoa com foco na dissecação do animal, trazendo o próximo animal (passo 6.1) e ajudando com ligações cruzadas (passo 6.2).
NOTA: Trate cada amostra com o mesmo tempo exato em todas as amostras. Se a sala de dissecção estiver longe da câmara fria, é altamente recomendável que uma terceira pessoa seja recrutada para participar da incubação e têmpera da amostra na câmara fria.
7. Lise tecidual, preparação de proteínas e western blot
- Após 10 min de têmpera (passo 6.5), girar as amostras a 20.000 x g a 4 °C durante 2 min e eliminar o sobrenadante. Se uma terceira pessoa estiver disponível, prossiga para a etapa 7.2; caso contrário, congele rapidamente as amostras em gelo seco e pause o ensaio aqui até que a dissecção cerebral (secção 5) e a ligação cruzada (secção 6) para todos os animais estejam concluídas.
- Adicionar 400 μL de tampão de lise gelado por tubo.
- Sonicar as amostras por 1 s cinco vezes com intervalos de 5 s entre elas, mantendo as amostras no gelo.
- Gire amostras a 20.000 x g por 2 min para desdobrar detritos de tecido insolúveis (pellet) e salvar o sobrenadante.
- Utilizar 5 μL do sobrenadante para medir a concentração de proteínas utilizando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
- Divida o restante do sobrenadante em dois tubos; um tubo contém 100 μL de sobrenadante para o western blot subsequente, e o outro tubo contém o resto (~300 μL) para armazenamento a longo prazo a -80 °C. Adicionar uma quantidade adequada de tampão de amostra SDS 4x (suplementado com β2-mercaptoetanol) às amostras e incubar a 70 °C durante 10 min.
- Executar 10-20 μg de proteína por poço em um gel de acrilamida para eletroforese (SDS-PAGE) e, em seguida, transferir proteínas para a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) para análise de western blot.
- Bloquear a membrana de PVDF em leite desnatado a 5% (p/v) dissolvido em solução salina tamponada com Tris contendo Tween-20 a 0,1% (TBS-T) por 1 h no TR.
- Lave brevemente a membrana duas vezes com TBS-T e incube-a com o anticorpo primário diluído em TBS-T durante a noite a 4 °C.
- Lavar o anticorpo primário três vezes por 10 min cada em TBS-T na RT.
- Incubar a membrana com anticorpo secundário conjugado à peroxidase de raiz forte diluído em TBS-T por 1 h no TR.
- Lavar o anticorpo secundário três vezes por 10 min cada em TBS-T no TR.
- Incubar a membrana em reagente de quimioluminescência aprimorado e detectar o sinal usando o aparelho de documentação em gel.
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Representative Results
Para demonstrar a viabilidade do ensaio de reticulação BS3 para avaliar os níveis de superfície α5-GABAA R no PFC de camundongos, realizamos 10 μg de cada uma das amostras de proteína BS3-reticulada e não-reticulada em SDS-PAGE e analisamos as proteínas por western blot usando um anticorpo anti-α5-GABAAR (policlonal de coelho) (Figura 7). As amostras de proteína não-reticulada deram a quantidade total de α5-GABA A R em ~55 kDa, enquanto as amostras de proteína reticulada BS3 deram uma certa quantidade de α5-GABA A R associado à endomembrana (migrando a ~55 kDa) juntamente com espécies proteicas de maior peso molecular representando complexos proteicos covalentemente reticulados com α5-GABAAR. Para a quantificação dos níveis de α5-GABAA R na superfície, podemos avaliar a extensão da depleção de α5-GABAAR a ~55 kDa do pool total na reticulação, já que a subunidade então muda para posições de maior peso molecular. Na prática, os níveis superficiais de α5-GABA A R podem ser calculados subtraindo-se a quantidade de α5-GABA A R associadoà endomembrana (a ~55 kDa na faixa de amostra reticulada) dos níveis totais de α5-GABAAR(a ~55 kDa na faixa de amostra não reticulada).
Em seguida, avaliamos os efeitos do UCMS (em 3 semanas e 5 semanas) na superfície e nos níveis totais de α5-GABAAR no PFC de camundongos. Neste experimento, a fim de seguir o curso temporal da reação de reticulação, preparamos as amostras em 1 h, 2 h e 3 h após a adição de BS3. Como as reações de reticulação BS3 pareceram atingir um platô em 2 h, os dados no ponto de tempo de 1 h foram usados para plotar o gráfico. Observamos uma redução significativa e progressiva nos níveis de α5-GABAAR de superfície no PFC em 3 semanas e 5 semanas de UCMS, em comparação com os camundongos controle sem estresse (Figura 8). Os dados mostraram alterações insignificantes ou nenhuma aparente nos níveis de receptores totais nessas condições experimentais, sugerindo que o estresse crônico impactou especificamente o tráfego de α5-GABAAR para a superfície celular.
Figura 1: Ferramentas de dissecção utilizadas no ensaio de reticulação BS3. O papel de filtro é umedecido com PBS gelado e colocado na superfície plana de gelo azul. Uma placa de Petri preenchida com PBS e armazenada a -20 °C 1 dia antes do ensaio é colocada no gelo. A matriz cerebral e as lâminas de barbear são pré-resfriadas no gelo. Tesouras (uma grande, outra pequena), pinças (uma grande, algumas pequenas) e um soco de tecido são todos limpos antes do ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cérebro inteiro de camundongos dissecado para fora do crânio e colocado em PBS gelado. Imediatamente depois que todo o cérebro foi removido do crânio, ele foi submerso em PBS gelado por 10-15 s em uma placa de Petri sobre gelo. Isso retarda o metabolismo cerebral e minimiza o tráfego e a degradação de proteínas, ao mesmo tempo em que ajuda o tecido a se tornar mais duro, o que torna o fatiamento cerebral subsequente mais fácil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Um cérebro de camundongo colocado na matriz cerebral. O cérebro de camundongo resfriado submerso em PBS gelado foi transferido para a matriz cerebral e colocado com o lado ventral voltado para cima. As lâminas de barbear e a matriz foram pré-resfriadas no gelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Corte coronal de um cérebro de camundongo na matriz cerebral. A primeira lâmina de barbear pré-refrigerada foi inserida através da borda entre o bulbo olfatório e o pedúnculo olfatório para iniciar a secção coronária do cérebro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Cortes coronais seriados de um cérebro de camundongo. A parte anterior do cérebro de camundongos foi cortada coronalmente inserindo-se cinco lâminas de barbear em série na matriz cerebral (intervalos de 1 mm). Todas as lâminas inseridas foram mantidas juntas, retiradas da matriz, separadas umas das outras usando pinças e colocadas na superfície plana resfriada com o corte cerebral voltado para cima. (Canto superior esquerdo) O bulbo olfativo; (meio à esquerda) a primeira seção; o segundo (inferior esquerdo) e terceiro (superior direito) cortes foram utilizados para amostragem dos tecidos do CPF; (canto inferior direito) a quarta seção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Parte posterior do cérebro para dissecação do hipocampo. Depois que a parte anterior do cérebro foi cortada coronalmente com lâminas de barbear (esquerda), a parte posterior do cérebro (média) foi retirada da matriz cerebral e colocada em papel de filtro umedecido PBS na superfície gelada (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Reticulação BS3 de GABAAR na superfície celular. Na presença de BS3, α5-GABA AR na superfície da membrana plasmática é reticulado (XL) com proteínas anônimas próximas a ele, como outras subunidades GABA A R dentro do conjunto GABAAR pentamérico ou proteínas vizinhas adicionais (X), mas não com proteínas (Y) longe dele. Assim, o α5-GABAAR aparece como uma espécie proteica de alto peso molecular (HMW) no blot. α5-GABAAR no endossomo permanece intacto e migra no tamanho esperado de ~55 kDa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Níveis de superfície α5-GABAAR afetados pelo SCUM. Foram avaliados os níveis totais e superficiais de α5-GABAAR no PFC de camundongos sob as condições sem estresse e UCMS (3 semanas e 5 semanas). Para acompanhar o curso temporal da reação de reticulação, as amostras foram preparadas em 1 h, 2 h e 3 h após a adição de BS3. Foram utilizados camundongos fêmeas (2-3 meses, N = 4/grupo). Os níveis de α5-GABAA R intactos em 55 kDa para cada condição foram primeiramente normalizados pelos níveis correspondentes de αTubulina e, em seguida, usados para calcular os níveis totais e associados à membrana α5-GABAAR (a partir das amostras sem reticuladas [No Xlink] e reticuladas [Xlink], respectivamente). Posteriormente, os níveis de receptores de superfície foram calculados subtraindo-se a quantidade associada à endomembrana dos níveis totais. Como as reações de reticulação BS3 pareciam atingir um platô em 2 h, os dados no momento de 1 h foram usados para plotar o gráfico (média ± EPM). Efeitos significativos do estresse crônico sobre os níveis de α5-GABA A R na superfície foram observados, e esse efeito foi dependente da duração do UCMS, uma vez que uma diminuição progressiva nos níveis deα5-GABAAR na superfície foi identificada ao longo do período do UCMS. *p < 0,05, **p < 0,01 (teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Trabalho conc. | Solução de estoque | Quantidade de solução estoque a ser dispensada |
| CaCl2 de 1,2 mM | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| NaCl de 147 mM | 5 M (34x) | 1176,5 μL |
| KCl de 2,7 mM | 1,08 M (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM de glicose | 2,5 M (250x) | 160 μL |
| Água deionizada | 37.563 mL | |
| Total | 40 mL | |
| * O caldo de CaCl2 deve ser preparado na hora no dia do experimento. | ||
Tabela 1: Composição do líquido cefalorraquidiano artificial.
| Trabalho conc. | Solução de estoque | Quantidade de solução estoque a ser dispensada |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| NaCl de 500 mM | 5 M (10x) | 2 mL |
| EDTA de 2 mM | 0,5 M (250x) | 80 μL |
| TDT de 1 mM | 1 M (1000x) | 20 μL |
| 0,1% NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| Coquetel inibidor de protease | 100x | 200 μL |
| Água deionizada | 17 mL | |
| Total | 20 mL |
Tabela 2: Composição do tampão de lise
Vídeo 1: Isolando o PFC usando um punch de tecido. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Picando o PFC usando pinças. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 3: Dissecando o HPC usando uma sonda curva e pinças. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 4: Inversão-mistura de uma amostra de tecido. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Embora o impacto do estresse psicossocial crônico sobre comportamentos (i.e., emocionalidade e déficits cognitivos) e alterações moleculares (i.e., expressão reduzida de genes GABAérgicos e déficits associados na neurotransmissão GABAérgica) estejam bem documentados10, os mecanismos subjacentes a tais déficits precisam ser investigados mais adiante. Em particular, dado o estudo recente mostrando que o estresse crônico afeta significativamente o proteoma neuronal através da sobrecarga nas funções de RE e, portanto, estresse elevado de RE15, permanece uma questão sobre se o estresse crônico afeta o tráfego de GABA A R através da membrana de RE e como o tráfego alterado ou os níveis de superfíciede GABAAR poderiam estar causalmente ligados à psicopatologia.
O ensaio de crosslinking BS3 mostrado neste protocolo servirá como uma abordagem poderosa para responder a algumas dessas perguntas. Por exemplo, a SCSU é conhecida por provocar uma série de alterações comportamentais, incluindo déficits cognitivos, comportamento semelhante à ansiedade e fenótipos anedonicos, dependendo da duração da SGCU10. Portanto, seria possível estudar o curso temporal e o grau de mudanças induzidas pelo SGCU nos níveis de superfície α5-GABAAR por amostragem de cérebros de camundongos em pontos de tempo sucessivos desde o início da SGCU (por exemplo, 1 semana, 3 semanas, 5 semanas), e também seria possível comparar com os fenótipos comportamentais observados em cada ponto de tempo. Subtiposadicionais de GABA A R (por exemplo, α1, α2) e o receptor para neuromoduladores conhecidos por serem afetados pelo estresse crônico (por exemplo, o receptor TrkB para fator neurotrófico derivado do cérebro [BDNF])10 poderiam ser testados simultaneamente usando as mesmas amostras. Como alguns desses sistemas e subtipos de receptores estão seletivamente implicados em domínios comportamentais específicos (por exemplo, sedação, ansiedade, cognição)11, vale a pena correlacionar as mudanças comportamentais com o tipo e o grau de receptores afetados pela SCUC em cada momento.
Abaixo estão os pontos críticos a serem considerados para várias etapas do protocolo. O primeiro passo é determinar o número necessário e suficiente de animais para uso com base no planejamento experimental e análise de potência. Por exemplo, para estudar o efeito do estresse crônico nos níveis de receptores de GABAA de superfície, preparamos rotineiramente um grupo de camundongos (N = 6/sexo) para serem expostos ao UCMS por 5 semanas e outro grupo (N = 6/sexo) para ser mantido sob condições sem estresse. Espera-se que esse tamanho de grupo (N = 24 no total, incluindo ambos os sexos) dê poder estatístico suficiente para detectar uma diferença de ~20% nos níveis de receptores, permitindo assim avaliar tanto os efeitos do estresse quanto os efeitos sexuais. Notadamente, é relatado que o estresse crônico causa diferenças sexo-dependentes nos desfechos comportamentais e moleculares10. Por exemplo, as mulheres são geralmente mais propensas a desenvolver sintomas depressivos do que os homens. Consistentemente, nossos estudos usando cérebros humanos post-mortem e roedores indicam níveis mais elevados de patologias comportamentais e moleculares em indivíduos do sexo feminino; níveis de downregulated da somatostatina (SST), um marcador molecular para depressão, são mais robustos em mulheres entre pacientes deprimidos16, e o aumento da emocionalidade é mais robusto em modelos de camundongos fêmeas replicando aspectos da patologia depressiva do que em homens15,17. Portanto, recomenda-se que qualquer desenho experimental que aborde os efeitos do estresse crônico em desfechos psicopatológicos deve incluir um número adequado de homens e mulheres para garantir o poder estatístico na análise dos dados e identificar possíveis efeitos dependentes do sexo.
O tempo ótimo de incubação com BS3 deve ser determinado em experimentos piloto para cada receptor a ser estudado. Relata-se que o tráfego de receptores pode ocorrer lentamente, mesmo a baixas temperaturas durante a incubação das amostras9. Para capturar níveis precisos de receptores de superfície no momento da dissecção cerebral, o ideal seria minimizar o tempo de incubação e escolher o ponto de tempo imediatamente antes que a reação de reticulação atinja o platô (30 min a 2 h a 4 °C).
Observamos várias limitações operacionais associadas aos ensaios de crosslinking BS3. (1) Primeiro, devido à meia-vida relativamente curta (2-3 h) da BS3 causada pela hidrólise espontânea dentro da faixa fisiológica de pH, é necessário completar a dissecção animal e a reação de reticulação dentro desse período de tempo. Isso nos levou a limitar o número de animais que poderíamos dissecar de cada vez a um máximo de 12. Se o experimentador planeja dissecar mais de 12 animais, recomenda-se dividir a coorte experimental em vários grupos, com cada um contendo menos de 12 animais. Após a conclusão do ensaio para um grupo, um novo lote de BS3 deve ser preparado para ser usado em ensaios de reticulação subsequentes para o próximo grupo. Na mesma linha, o número de regiões de interesse a serem dissecadas de um animal deve ser limitado. Nós rotineiramente amostramos de duas regiões cerebrais (PFC, HPC) para o ensaio de reticulação, e este é o número máximo de regiões cerebrais que podemos dissecar para obter resultados consistentes com mínima variabilidade entre as amostras. (2) Em segundo lugar, a especificidade dos anticorpos usados no western blot deve ser cuidadosamente avaliada. A reação química de reticulação BS3 pode ter um efeito inesperado sobre a antigenicidade das proteínas detectadas por cada anticorpo. Descobrimos que um α5-GABAUmAnticorpo R (especificado no Tabela de Materiais) detectou erroneamente uma forte banda de ~50 kDa especificamente em amostras reticuladas BS3, independentemente da presença ou ausência do α5-GABAUmproteína R na amostra; esta banda de ~50 kDa foi observada mesmo em amostras de tecido de α5-GABAUmCamundongos knockout R, sugerindo que esse anticorpo começou a reagir de forma cruzada com antígenos irrelevantes gerados acidentalmente pela reação de reticulação BS3. Recomenda-se que a especificidade do anticorpo seja minuciosamente determinada com e sem reações de reticulação BS3, idealmente usando amostras de tecido knockout, se disponíveis, para uma determinada proteína de interesse. (3) O protocolo atual descrito aqui não aborda os tipos celulares em que cada GABAUmO subtipo R é expresso (por exemplo, neurônios e astrócitos). Para alguns GABAUmSubtipos R (por exemplo, α1, α5) que são predominantemente expressos em neurônios18, os dados do ensaio de crosslinking obtidos usando tecidos cerebrais em massa, conforme descrito neste protocolo, devem fornecer informações que reflitam os níveis da superfície neuronal. No entanto, para outros GABAUmSubtipos R (por exemplo, α2) que são altamente expressos em neurônios e astrócitos18, é de interesse estudar os níveis de superfície do receptor em neurônios versus astrócitos separadamente. Para esse fim, a classificação celular convencional (por exemplo, classificação de células ativadas por fluorescência [FACS]19) pode ser integrado ao protocolo de reticulação BS3; a etapa de dissociação celular para a classificação celular pode ser feita após a etapa de têmpera BS3, mas é preciso validar que todos os procedimentos e condições para FACS (por exemplo, os tampões a serem usados, temperatura, tempo de incubação) são compatíveis com aqueles no ensaio de reticulação. Além disso, a abordagem FACS pode ser usada apenas para GABAUmSubtipos R conhecidos por estarem localizados no compartimento celular perissomático (por exemplo, α2), mas não para os subtipos enriquecidos em dendritos distais (por exemplo, α5)18, porque os compartimentos celulares periféricos ou distais são provavelmente perdidos durante a extensa etapa de dissociação celular necessária para a classificação celular. (4) Finalmente, descobrimos que os resultados são mais consistentes quando calculamos os níveis de receptores de superfície subtraindo a quantidade de receptores associados à endomembrana da quantidade total de receptores, em vez de avaliar diretamente os níveis de superfície com base na densitometria de espécies proteicas de alto peso molecular. Isso provavelmente ocorre porque a eficiência de transferência dessas espécies de proteínas de alto peso molecular para a membrana de PVDF é mais variável do que a da proteína original intacta de tamanho menor (por exemplo, ~55 kDa para α5-GABAUmR). Recomenda-se, portanto, seguir o método descrito na seção de resultados e a legenda de Figura 8 para calcular os níveis de receptores de superfície.
Além dos efeitos do estresse crônico sobre o GABAAR, o ensaio de reticulação BS3 também pode ser aplicado a camundongos geneticamente modificados ou modelos de roedores com manipulações experimentais para investigar uma série de condições neurológicas ou neuropsiquiátricas. Este ensaio tem sido usado com sucesso para capturar os efeitos induzidos pela cocaína sobre a expressão superficial de receptores de glutamato no núcleo accumbens de cérebros de ratos20,21. O ensaio também foi usado para mostrar expressão superficial reduzida de α5-GABAAR no PFC de camundongos knockout heterozigotos BDNF22. Em outro estudo anterior, no modelo de encefalopatia hepática em ratos, os déficits de aprendizagem espacial associados foram causalmente ligados à expressão superficial alterada de receptores de glutamato e GABAA com base neste ensaio de reticulação23. Em resumo, o ensaio de reticulação química BS3 fornece uma ferramenta versátil para capturar mudanças específicas da região cerebral e dependentes do contexto em uma variedade de sistemas receptores no cérebro, bem como em praticamente quaisquer outros tecidos ou órgãos periféricos. Este ensaio também pode ser conduzido em paralelo com outros métodos de avaliação dos níveis de receptores de superfície, como o registro eletrofisiológico da inibição tônica (especialmente no caso do α5-GABAAR), microscopia eletrônica criogênica e biotinilação de superfície, para comparar e validar os resultados.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem à equipe do biotério do CAMH pelos cuidados com os animais durante todo o estudo. Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant #470458 to T.T.), pelo Discovery Fund do CAMH (para T.P.), pela National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (prêmio NARSAD #25637 para E.S.) e pelo Campbell Family Mental Health Research Institute (para E.S.). E.S. é o fundador da Damona Pharmaceuticals, uma biofarmacêutica dedicada a trazer novos compostos gabaérgicos para a clínica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E.
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
