Summary
BS3化学架橋アッセイは、慢性心理社会的ストレス条件下でのマウス脳における細胞表面GABAA 受容体発現の減少を明らかにします。
Abstract
不安は、認知機能を含む動物の行動にさまざまに影響を与える感情の状態です。不安の行動徴候は動物界全体で観察され、広範囲のストレスモダリティに対する適応的または不適応的な反応として認識することができます。げっ歯類は、分子、細胞、および回路レベルでの不安の統合メカニズムに対処するトランスレーショナル研究のための実証済みの実験モデルを提供します。特に、慢性心理社会的ストレスパラダイムは、人間とげっ歯類に類似した不安/抑うつのような行動表現型を模倣する不適応反応を誘発します。以前の研究では、脳内の神経伝達物質の内容に対する慢性ストレスの有意な影響が示されていますが、神経伝達物質受容体レベルに対するストレスの影響は十分に研究されていません。本稿では、慢性ストレス下マウスの神経伝達物質受容体の神経表面レベルを定量する実験方法を、特に情動や認知の調節に関与するγ-アミノ酪酸(GABA)受容体に着目して紹介します。膜不透過性の不可逆化学架橋剤であるビススルホスクシンイミジルスベレート(BS3)を使用して、慢性ストレスが前頭前野におけるGABAA 受容体の表面利用可能性を大幅に下方制御することを示しています。GABAA 受容体のニューロン表面レベルは、GABA神経伝達の律速プロセスであるため、実験動物モデルにおける不安/抑うつ様表現型の程度の分子マーカーまたはプロキシとして使用できます。この架橋アプローチは、あらゆる脳領域で発現する神経伝達物質や神経調節物質の様々な受容体系に適用可能であり、情動や認知のメカニズムのより深い理解に貢献することが期待されます。
Introduction
神経伝達物質受容体は、神経細胞の原形質膜表面または細胞内の内膜(エンドソーム、小胞体[ER]、トランスゴルジ体など)に局在し、ニューロンの内因性生理学的状態に応じて、または外因性ニューラルネットワーク活動に応答して、これら2つのコンパートメント間を動的に往復します1,2.新たに分泌された神経伝達物質は、主に表面局在化した受容体のプールを介して生理学的機能を誘発するので、所与の神経伝達物質の表面受容体レベルは、神経回路内のそのシグナル伝達能力の重要な決定要因の1つである3。
培養ニューロンの表面受容体レベルをモニタリングするには、表面ビオチン化アッセイ4、非透過処理条件下での特異的抗体を用いた免疫蛍光アッセイ5、pH感受性蛍光光学指示薬(pHluorinなど)6と遺伝的に融合した受容体導入遺伝子の使用など、いくつかの方法があります。対照的に、これらのアプローチは、 インビボで表面受容体レベルを評価する場合、限定的であるか実用的ではありません。例えば、表面ビオチン化手順は、その比較的高い価格およびアビジン結合ビーズ上のビオチン化タンパク質を精製するために必要な後続のステップのために、in vivo 脳組織の大量およびサンプル数の処理には実用的ではないかもしれない。3次元脳構造に埋め込まれたニューロンの場合、抗体のアクセシビリティが低いか、顕微鏡ベースの定量が難しいため、 in vivoでの表面受容体レベルを評価する上で大きな制限が生じる可能性があります。無傷の脳における神経伝達物質受容体の分布を視覚化するために、陽電子放出断層撮影法などの非侵襲的方法を使用して、受容体占有率を測定し、表面受容体レベルを推定することができます7。ただし、このアプローチは、特定の放射性リガンド、高価な機器、および特別な専門知識の可用性に大きく依存しているため、ほとんどの研究者が日常的に使用することは困難になっています。
ここでは、水溶性で膜を透過しない化学架橋剤であるビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)8,9を使用して、実験動物の脳の表面受容体レベルをex vivoで測定するための簡単で汎用性の高い方法について説明します。BS3はリジン残基の側鎖にある第一級アミンを標的とし、互いに近接したタンパク質を共有結合的に架橋することができます。脳スライスを関心のある領域から新たに調製し、BS3を含むバッファー中でインキュベートすると、細胞表面受容体は隣接するタンパク質と架橋され、したがって、より高分子量の種に変換されますが、細胞内膜内関連受容体は修飾されません。したがって、表面受容体プールと細胞内受容体プールは、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、研究対象の受容体に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって定量することができます。
予測不可能な慢性軽度ストレス(UCMS)は、げっ歯類に慢性心理社会的ストレスを誘発するための確立された実験パラダイムです10。UCMSは、GABAとその受容体を含む一連の神経伝達物質系の調節を介して、不安/抑うつのような行動表現型と認知障害を誘発します10,11。特に、α5サブユニット含有GABAA受容体(α5-GABAAR)は、記憶および認知機能の調節に関与しており12,13、UCMS誘発性認知障害におけるこのサブユニットの機能の変化の関与の可能性を示唆している。このプロトコルでは、BS3架橋アッセイを使用して、UCMSに曝露されたマウスの前頭前野における表面発現α5-GABAARのレベルを、非ストレス対照マウスと比較して定量しました。
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Protocol
このプロトコルのすべての動物作業は、オンタリオ州動物研究法(RSO 1990、第A.22章)およびカナダ動物管理評議会(CCAC)に従って完了し、施設動物管理委員会によって承認されました。
1.動物の準備
- 実験に使用する動物数を決定し、それらを適切なグループまたは実験コホートに分割します。グループのサイズ、性別、および統計的検出力の説明については、ディスカッションのセクションを参照してください。
注:このプロトコルは、マウス(C57BL6 / J系統、生後2〜4か月、通常は体重20〜30 g、使用するオスとメスの同数)用にカスタマイズされています。 - 動物をUCMSまたは非ストレス条件下で5〜8週間制御し、前述のプロトコルに従います14。
- 最後のUCMS手順の後、受容体発現に対する急性ストレスの影響を避けるために、動物を架橋アッセイに使用する前に、動物を自宅のケージに1日間滞在させます。
2. 原液の調製
- アッセイ前の指示に従って、以下の溶液を調製して保管してください。
- 14.6 g の NaCl を 40 mL の脱イオン水に溶解して、5 M の NaCl を調製します。室温(RT)で保存してください。
- 3.22 g の KCl を 40 mL の脱イオン水に溶解して、1.08 M の KCl を調製します。RTで保存してください。
- 3.25gのMgCl2・6H2Oを40mLの脱イオン水に溶解することにより、400mMMgCl2を調製する。RTで保存してください。
- 3 gのグリシンを40 mLのイオン交換水に溶解して1 Mのグリシンを調製し、4°Cで保存します。
- 1.54 gのDTTを10 mLの脱イオン水に溶解して、1 Mのジチオスレイトール(DTT)を調製します。孔径0.2 μmのフィルターでろ過滅菌し、2 mLチューブに分注します。-20°Cで保存してください。
- 10%ノニデット-P40(NP-40)を脱イオン水で1:10(v / v)の比率で希釈して調製します。RTで保存してください。
- 0.5 M EDTA(pH = 8.0)を調製し、室温で保存します。
- 1 M HEPESバッファー(pH = 7.2-7.5)を調製し、4°Cで保存します。
- 2.5 Mまたは45%(w / v)グルコースを調製し、4°Cで保存します。
3.ワークステーションの準備
- BS3架橋アッセイの日に、次の材料を動物解剖室(図1)に集め、氷上で事前に冷却したいくつかのアイテム:アイスバケット、金属温度ブロック(氷上で事前に冷却)、50 mLの円錐管に氷冷したPBS、ペトリ皿に凍結したPBS、PBSで湿らせたろ紙を冷やした平らな表面または青い氷の上に置きます。 氷上で予め冷却した脳マトリックス(かみそりの刃の挿入に1mm間隔)、氷上で予め冷却したかみそりの刃(~10)、解剖器具(はさみ、鉗子、湾曲したプローブ)、ティッシュパンチ、70%エタノールスプレー拭き取り紙とペーパータオル、ピペットチップ(200μL)、ピペッター(P200)、ストップウォッチ、メモ帳、ペン、マイクロ遠心チューブ(1.5mL)。
- アッセイの前に、微量遠心チューブにサンプル情報(例えば、動物ID番号、治療タイプ[UCMS対ストレスなし(NS)]、脳領域、BS3の有無など)を標識します。
注:BS3架橋アッセイでは、各脳領域から2つのサンプルを収集する必要があります。一方のサンプルは架橋(BS3を使用)に使用され、もう一方は非架橋反応(BS3なし)にコントロールとして使用されます。したがって、12匹のマウスにおける2つの脳領域(すなわち、前頭前野[PFC]および海馬[HPC])からサンプリングするために、初期サンプリング用に48本のチューブ(=12匹のマウス×2領域×2サンプル)を標識する(セクション6で使用する)。後で保管するために、追加の2セットの48チューブにラベルを付けます(各サンプルの2つの異なる容量[100 μL、300 μL]を保存するため)(セクション7で使用)。したがって、このコホートサイズに対して合計144本のチューブにラベルを付ける必要があります。
- アッセイの前に、微量遠心チューブにサンプル情報(例えば、動物ID番号、治療タイプ[UCMS対ストレスなし(NS)]、脳領域、BS3の有無など)を標識します。
- さらに、実験室で次の機器が利用可能であることを確認してください:卓上冷蔵マイクロ遠心分離機、超音波破砕機、チューブ回転子(冷蔵室または冷蔵庫内[4°C]で使用される)、サンプルを保管するための冷凍庫(-80°C)、およびサンプルの一時保管用のドライアイスのバケツ(セクション7で使用)
4. 作業溶液とバッファーの調製
注:アッセイの朝に、以下の溶液を調製してください。この計算は、12匹のマウスからの2つの脳領域(すなわち、PFCおよびHPC)を処理するために必要な解に基づいている。
- 表1に記載の人工脳脊髄液(aCSF、pH = 7.4)を調製する。750 μLのaCSFを各サンプリングチューブ(ステップ3.1.1でラベル付けされた48本のチューブ)に分注し、氷上の金属温度ブロックに入れてバッファーを事前に冷却します。
- 表2に記載のように溶解バッファーを調製します。氷上で保存します(サンプルあたり400 μLを使用します)。
- 5 mM クエン酸ナトリウムバッファー(pH = 5.0)中の52 mM BS3ストック溶液(26x)を調製します。
- まず、100 mMクエン酸(原液A)と100 mMクエン酸ナトリウム(原液B)を用意する。
- ストックAとストックBを脱イオン水で1:20の比率で希釈します。1.9 mLの水にそれぞれ100 μLを加えて、それぞれ5 mMクエン酸(ストックC)と5 mMクエン酸ナトリウム(ストックD)を調製します。
- ストックC410 μLとストックD590 μLを混合して、5 mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH = 5.0)を調製しました(溶液E、1 mL)。
- pH指示薬ストリップを使用して溶液EのpHを確認します。
- 24 mgのBS3を806.4 μLの溶液Eに30秒間ボルテックスして溶解し、BS3ストック溶液(26x)を調製します。
- 非架橋サンプルのビヒクルコントロールとして使用するために、さらに1 mLの溶液Eを調製します。
注:他の準備が整い、実験が開始されようとしているときに、BS3ストック溶液を準備してください。BS3は、使用するまで4°Cで乾燥させて保管する必要があります。再構成されると、BS3は約≤3時間のみアクティブになります。5 mMクエン酸ナトリウム緩衝液(溶液E)のpHは経時的に上昇し、BS3加水分解が促進されることが報告されているため、溶液Eはストック溶液AおよびBから新鮮に調製することをお勧めします9。低温でのBS3の溶解度は限られているため、再構成されたBS3はRTで保持してください。 再構成されたBS3を3時間で使い切り、再構成されたBS3を凍結/解凍または再利用しないでください。
5.脳組織の解剖
注:このステップ以降、少なくとも2人が調整された方法で協力する必要があります。一人が動物の解剖に焦点を当てている間(ステップ5.2-5.10およびステップ6.3)、もう一人はタイムキーパーとして働き、アッセイの調整を支援する必要があります(ステップ5.1、ステップ6.1、ステップ6.2、ステップ6.4、およびステップ6.5)
- 解剖のために最初の動物を住居エリアから解剖室に連れて行きます。
注:急性ストレッサー(例:.、新しい環境、血液の臭い)が脳タンパク質のダイナミクスに影響を与える可能性があるため、動物は解剖エリアから離れた自宅のケージに保管し、解剖室に個別に持ち込んですぐに斬首する必要があります。 - 頸部脱臼とそれに続く断頭によってマウスを安楽死させる。脳を頭蓋骨から急速に取り出し、ペトリ皿の氷冷PBSに10〜15秒間沈めます(図2)。
注:麻酔薬は神経伝達物質受容体の表面提示レベルに影響を与える可能性があるため、動物はBS3実験のために麻酔されていません9。 - 冷やした脳を氷の上の脳マトリックスに入れ、脳の腹側を上に向けてください(図3)。
- 最初のかみそりの刃を嗅球と嗅花柄の境界に挿入して、脳を冠状に切断します(図4)。3〜4枚の追加のかみそりの刃を使用して、脳の前部を1mm間隔で冠状に連続的に切断します。
- 挿入されたすべてのかみそりの刃を一緒に保持し、脳の後部を脳マトリックスの後ろに残して、冠状スライスを脳マトリックスから持ち上げます。鉗子を使用してかみそりの刃を互いに分離し、脳スライスを上に向けて平らで冷やした表面に置きます(図5)。
- 対象領域を含むスライスを特定します。PFCをサンプリングするには、嗅柄を含む最初のスライスの後方の2番目と3番目のスライスを選択します。
- ティッシュパンチを使用して関心領域を除去し(ビデオ1)、冷やしたカミソリの刃の上に置き、組織を2つに均等に分割します(たとえば、左半球と右半球の組織で、半分はBS3架橋反応に使用し、残りの半分は、目的の標的タンパク質が両方の半球で等しく発現している場合は、架橋なしの制御に使用されます)。
- 組織をすりつぶしたり粉砕したりする代わりに、鉗子の細い先端を使用して、ブレードに対して複数の垂直方向の動き(ビデオ2)を使用して、各組織をかみそりの刃で細かく刻みます。これにより、細胞の膜の完全性を著しく損なうことなく、BS3がアクセスできる表面積が最大化されます。ミンチの直後に、ミンチした組織を適切なチューブに移します(ステップ6.3を参照)。
- HPCをサンプリングするには、脳の後部をマトリックスから取り出し、背側を上に向けて、冷やした平らな面の湿らせたろ紙の上に脳を置きます(図6)。
- 湾曲したプローブと鉗子を使用し、背側からアプローチし(ビデオ3)、両方の半球(BS3架橋用の半分とコントロール用の残りの半分)からHPC(背側半分、腹側半分、またはその両方)を解剖します。ステップ5.8のように各組織を細かく刻み、組織を適切なチューブに移します(ステップ6.3を参照)。
注:実験条件と結果の一貫性を保つために、各動物の解剖時間全体を~5分に保つ必要があります。
6.架橋反応
- 前のマウスの脳の解剖が終わりに近づいたら、次の解剖動物を収容場所から解剖室に連れて行きます(ステップ5.10)。
- 細切した組織を適切なチューブに移す準備ができる直前に、氷上で事前に冷却したチューブに30 μLのBS3溶液(26x)またはビヒクル溶液Eをスパイクします(ステップ4.1から)。チューブ間のピペットチップを交換して、架橋のないコントロールチューブにBS3が汚染されていないことを確認します。
- 細かく刻んだ組織(ステップ5.8およびステップ5.10)を適切なチューブに移し、次の動物の解剖を開始します(ステップ5.2)
- チューブを反転させて混合し、組織の塊を細かく砕き(ビデオ4)、冷蔵室のチューブローテーターでサンプルを30分から2時間インキュベートし始めます。各チューブのBS3インキュベーションの開始時間を記録します。最適なインキュベーション時間については、ディスカッションセクションを参照してください。
- チューブに78 μLの1 Mグリシンを加えて反応を停止し、さらにサンプルを一定の回転で4°Cで10分間インキュベートします。各チューブの焼入れの開始時間と終了時間を記録します。次の動物を連れてきて(ステップ6.1)、架橋を手伝う(ステップ6.2)ことによって、動物の解剖に焦点を合わせている人を助け続けます。
注意: すべてのサンプルでまったく同じタイミングで各サンプルを処理します。解剖室が冷蔵室から遠く離れている場合は、冷蔵室でのサンプルインキュベーションとクエンチに参加する第三者を募集することを強くお勧めします。
7.組織溶解、タンパク質調製、およびウェスタンブロット
- 10分間のクエンチ(ステップ6.5)後、サンプルを20,000 x g で4°Cで2分間回転させ、上清を廃棄します。第三者が対応可能な場合は、手順 7.2 に進みます。それ以外の場合は、ドライアイス上でサンプルを急速凍結し、すべての動物の脳解剖(セクション5)と架橋(セクション6)が完了するまでここでアッセイを一時停止します。
- チューブあたり400 μLの氷冷溶解バッファーを追加します。
- サンプルを氷上に保ちながら、間に5秒間隔で1秒間5回サンプルを超音波処理します。
- サンプルを20,000 x g で2分間回転させて不溶性組織破片(ペレット)をスピンアウトし、上清を保存します。
- ビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いてタンパク質濃度を測定するために5 μLの上清を使用します。
- 残りの上清を2つのチューブに分割します。一方のチューブには、後続のウェスタンブロット用の上清が100 μL含まれており、もう一方のチューブには、-80 °Cでの長期保存用の残り(~300 μL)が含まれています。 適量の4x SDSサンプルバッファー(β2-メルカプトエタノールを添加したもの)をサンプルに加え、70°Cで10分間インキュベートします。
- 電気泳動用アクリルアミドゲル(SDS-PAGE)でウェルあたり10〜20 μgのタンパク質を流し、ウェスタンブロット分析のためにタンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに移します。
- 0.1%Tween-20(TBS-T)を含むトリス緩衝生理食塩水に溶解した5%(w / v)スキムミルクでPVDFメンブレンをRTで1時間ブロックします。
- メンブレンをTBS-Tで2回短時間洗浄し、TBS-Tで希釈した一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。
- 一次抗体をRTでTBS-Tで10分間ずつ3回洗い流します。
- TBS-Tで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体でメンブレンをRTで1時間インキュベートします。
- 二次抗体をRTのTBS-Tでそれぞれ10分間3回洗い流します。
- 増強化学発光試薬中でメンブレンをインキュベートし、ゲルドキュメンテーション装置を用いてシグナルを検出します。
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Representative Results
マウスPFCの表面α5-GABA A Rレベルを評価するためのBS3架橋アッセイの実現可能性を実証するために、SDS-PAGE上でBS3架橋タンパク質サンプルと非架橋タンパク質サンプルをそれぞれ10 μg実行し、抗α5-GABAAR抗体(ウサギポリクローナル)を用いたウェスタンブロットでタンパク質を分析しました(図7)。非架橋タンパク質サンプルは~55 kDaでの総量のα5-GABAA Rを与え、BS3架橋タンパク質サンプルは一定量の膜内関連α5-GABA A R(~55 kDaで移行)と、α5-GABAARに共有結合で架橋されたタンパク質複合体を表す高分子量タンパク質種を与えました。表面のα5-GABA A Rレベルの定量化のために、サブユニットがより高い分子量の位置に移動するため、架橋時に全プールから~55 kDaでのα5-GABAARの枯渇の程度を評価することができます。実際には、α5-GABA A Rの表面レベルは、総α5-GABA A Rレベル(非架橋サンプルレーンでは~55 kDa)から膜内関連Α5-GABAARの量(架橋サンプルレーンでは~55 kDa)を差し引くことによって計算できます。
次に、UCMS(3週間および5週間)がマウスPFCの表面および総α5-GABAARレベルに及ぼす影響を評価した。 この実験では、架橋反応の経時変化を追跡するために、BS3を添加してから1時間、2時間、および3時間でサンプルを調製しました。BS3架橋反応は2時間でプラトーに達するように見えたので、1時間の時点でのデータを使用してグラフをプロットしました。UCMSの3週間および5週間で、ストレスのない対照マウスと比較して、PFCの表面α5-GABAARレベルの有意かつ漸進的な減少が観察されました(図8)。データは、これらの実験条件下での総受容体レベルの明らかな変化をごくわずかまたはまったく示さず、慢性ストレスが細胞表面へのα5-GABAAR輸送に特異的に影響を与えたことを示唆しています。
図1:BS3架橋アッセイで使用される解剖ツール。 ろ紙を氷冷PBSで湿らせ、青い氷の平らな面に置きます。PBSを充填し、アッセイの1日前に-20°Cで保存したペトリ皿を氷上に置きます。脳マトリックスとかみそりの刃は氷の上で事前に冷やされています。はさみ(1つは大、もう1つは小)、鉗子(1つは大、数つは小)、および組織パンチはすべて、アッセイの前に洗浄されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスの脳全体を頭蓋骨から解剖し、氷冷したPBSに入れた。 脳全体を頭蓋骨から取り出した直後に、氷上でのペトリ皿に氷冷したPBSに10〜15秒間沈めました。これにより、脳の代謝が遅くなり、タンパク質の輸送と分解が最小限に抑えられると同時に、組織が硬くなり、その後の脳のスライスが容易になります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:脳マトリックスに配置されたマウスの脳。 氷冷したPBSに沈めたマウスの脳を脳マトリックスに移し、腹側を上に向けて置いた。かみそりの刃とマトリックスは氷上で事前に冷却されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:脳マトリックスにおけるマウス脳の冠状切片。 最初の事前に冷却されたかみそりの刃を嗅球と嗅花柄の間の境界を通して挿入し、脳を冠状に切片化し始めました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マウス脳の連続冠状切片。 マウス脳の前部は、5本の剃刀の刃を脳マトリックスに直列に挿入して冠状に切断した(1mm間隔)。挿入されたすべてのブレードを一緒に保持し、マトリックスから持ち上げ、鉗子を使用して互いに分離し、脳スライスを上に向けて冷却された平らな面に置きました。(左上)嗅球;(左中央)最初のセクション。2番目(左下)および3番目(右上)の切片をPFC組織のサンプリングに使用しました。(右下)4番目のセクション。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:海馬を解剖するための脳の後部。 脳の前部をかみそりの刃で冠状に切断した後(左)、脳の後部(中央)を脳マトリックスから取り出し、冷却した表面のPBS湿らせたろ紙の上に置きます(右)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:細胞表面におけるGABAARのBS3架橋。 BS3の存在下では、原形質膜表面のα5-GABA A Rは、五量体GABA A Rアセンブリ内の他のGABAARサブユニットや追加の隣接タンパク質(X)など、それに近い匿名タンパク質と架橋(XL)されますが、それから遠く離れたタンパク質(Y)とは架橋されません。したがって、α5-GABAARは、ブロット上に高分子量(HMW)タンパク質種として現れる。エンドソーム上のα5-GABAARは無傷のままで、~55 kDaの予想サイズで移動します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:UCMSの影響を受ける表面α5-GABAARレベル。 無ストレスおよびUCMS(3週間および5週間)条件下でのマウスのPFCにおけるα5-GABAAARの総レベルおよび表面レベルの両方を評価した。架橋反応の経時変化に従うために、BS3を添加してから1時間、2時間、および3時間後にサンプルを調製した。雌マウス(2〜3ヶ月、N = 4 /群)を使用した。各条件の55 kDaでの無傷のα5-GABA A Rレベルを、最初に対応するαチューブリンレベルによって正規化し、次に総および膜内に関連するα5-GABAARレベルを計算するために使用されました(それぞれ、架橋なし[Xlinkなし]および架橋[Xlink]サンプルから)。続いて、表面受容体レベルは、総レベルから膜内会合量を差し引くことによって計算した。BS3架橋反応は2時間でプラトーに達するように見えたので、1時間の時点でのデータを使用してグラフをプロットしました(SEM±平均)。表面α5-GABA A Rレベルに対する慢性ストレスの有意な影響が観察され、表面α5-GABAARレベルの漸進的な減少がUCMS期間にわたって確認されたため、この効果はUCMS期間に依存しました。*p < 0.05, **p < 0.01 (ダンの多重比較によるクラスカル-ウォリス検定)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 作業コンク。 | 原液 | 分注する原液の量 |
| 1.2 ミリリットル CaCl2 | 480 ミリリットル (400倍) * | 100 μL |
| 20 mM ヘペス | 1メートル(50倍) | 800 μL |
| 147 mM 塩化ナトリウム | 5メートル(34倍速) | 1176.5 μL |
| 2.7 ミリリットル KCl | 1.08メートル(400倍) | 100 μL |
| 1 ミリム MgCl2 | 400ミリリットル(400倍) | 100 μL |
| 10 mM グルコース | 2.5メートル(250倍) | 160 μL |
| 脱イオン水 | 37.563ミリリットル | |
| トータル | 40ミリリットル | |
| ※CaCl2 ストックは実験当日に調製したてのものとしてください。 | ||
表1:人工脳脊髄液の組成。
| 作業コンク。 | 原液 | 分注する原液の量 |
| 25 mM ヘペス | 1メートル(40倍) | 500 μL |
| 500 mM 塩化ナトリウム | 5メートル(10倍) | 2ミリリットル |
| 2 mM EDTA | 0.5メートル(250倍) | 80 μL |
| 1 ミリリットル DTT | 1メートル(1000倍) | 20 μL |
| 0.1% NP-40 | 10% (100倍) | 200 μL |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル | 100倍 | 200 μL |
| 脱イオン水 | 17ミリリットル | |
| トータル | 20ミリリットル |
表2:溶解バッファーの組成
ビデオ1:ティッシュパンチを使用してPFCを分離する。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:鉗子を使用してPFCをミンチします。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ3:湾曲したプローブと鉗子を使用してHPCを解剖する。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ4:組織サンプルの反転混合。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
慢性的な心理社会的ストレスが行動(すなわち、感情および認知障害)および分子変化(すなわち、GABA作動性遺伝子の発現低下およびそれに伴うGABA作動性神経伝達の欠損)に与える影響は十分に文書化されているが10、そのような欠陥の根底にあるメカニズムはさらなる調査が必要である。特に、慢性ストレスが小胞体機能の過負荷、ひいては小胞体ストレスの上昇を通じてニューロンプロテオームに有意に影響を及ぼすことを示す最近の研究15を考えると、慢性ストレスが小胞体膜を介したGABA A R輸送に影響を与えるかどうか、およびGABAARの輸送または表面レベルの変化が精神病理学と因果関係がある可能性があるかどうかについては疑問が残ります。
このプロトコルに示されているBS3架橋アッセイは、これらの質問のいくつかに答えるための強力なアプローチとして機能します。たとえば、UCMSは、UCMS10の期間に応じて、認知障害、不安様行動、無快感表現型などの一連の行動変化を誘発することが知られています。したがって、UCMSの開始から連続する時点(例えば、1週間、3週間、5週間)でマウス脳をサンプリングすることにより、表面α5-GABAAARレベルのUCMS誘発性変化の経時変化および程度を研究することが可能であり、各時点で観察された行動表現型と相互比較することも可能であろう。追加のGABAARサブタイプ(例:α1、α2)および慢性ストレスの影響を受けることが知られている神経調節物質の受容体(例:脳由来神経栄養因子[BDNF]のTrkB受容体)10 を、同じサンプルを使用して同時にテストできます。これらの受容体系およびサブタイプのいくつかは、特定の行動領域(例えば、鎮静、不安、認知)11に選択的に関与しているため、行動の変化を、各時点でUCMSによって影響を受ける受容体のタイプおよび程度と相関させることは価値がある。
以下は、プロトコルのいくつかのステップで考慮すべき重要なポイントです。最初のステップは、実験計画と検出力分析に基づいて、使用する必要かつ十分な数の動物を決定することです。例えば、表面GABAA受容体レベルに対する慢性ストレスの影響を研究するために、我々は日常的にUCMSに5週間曝露されるマウス群(N = 6/性)と、ストレスのない条件下で飼育される別の群(N = 6/性)を準備します。このグループサイズ(N = 男女を含めて合計24)は、受容体レベルの~20%の差を検出するのに十分な統計的検出力を与えると期待され、ストレス効果と性効果の両方を評価することができます。特に、慢性ストレスは行動的および分子的転帰に性依存的な違いを引き起こすことが報告されています10。たとえば、女性は一般的に男性よりも抑うつ症状を発症する傾向があります。一貫して、人間の死後脳とげっ歯類の脳を使用した私たちの研究は、女性被験者の行動および分子病理のレベルが高いことを示しています。うつ病の分子マーカーであるソマトスタチン(SST)のレベルの低下は、うつ病患者の女性でより堅牢であり16、感情の増加は、うつ病の病状の側面を再現する女性のマウスモデルで男性よりも堅牢です15,17。したがって、精神病理学的転帰に対する慢性ストレスの影響に対処する実験デザインには、データ分析における統計的検出力を確保し、起こりうる性依存性の影響を特定するために、男性と女性の両方の適切な数を含めることが推奨される。
BS3との最適なインキュベーション時間は、研究する各受容体のパイロット実験で決定する必要があります。受容体トラフィッキングは、サンプルインキュベーション中の低温でもゆっくりと起こる可能性があることが報告されています9。脳解剖時の正確な表面受容体レベルを捕捉するには、インキュベーション時間を最小限に抑え、架橋反応がプラトーに達する直前の時点(4°Cで30分から2時間)を選択することが理想的です。
BS3架橋アッセイに関連するいくつかの操作上の制限に気づきました。(1)まず、生理的pH範囲内の自然加水分解によって引き起こされるBS3の半減期が比較的短い(2〜3時間)ため、この時間枠内で動物の解剖と架橋反応を完了する必要があります。これにより、一度に解剖できる動物の数を最大12匹に制限しました。実験者が12匹以上の動物を解剖することを計画している場合は、実験コホートをいくつかのグループに分け、それぞれが12匹未満の動物を含むことをお勧めします。1つのグループのアッセイが完了した後、BS3の新しいバッチを新たに準備して、次のグループの後続の架橋アッセイで使用する必要があります。同様に、1匹の動物から解剖される関心のある領域の数は制限されるべきです。架橋アッセイのために2つの脳領域(PFC、HPC)から定期的にサンプリングしますが、これは、サンプル間のばらつきを最小限に抑えて一貫した結果を得るために解剖できる脳領域の最大数です。(2)第二に、ウェスタンブロットで使用される抗体の特異性を注意深く評価する必要があります。BS3化学架橋反応は、各抗体によって検出されるタンパク質の抗原性に予期しない影響を与える可能性があります。その結果、α5-GABAが1つあることを見出しました。あるR抗体( 材料一覧)は、α5-GABAの有無にかかわらず、BS3架橋サンプルにおいて特異的に強い~50 kDaバンドを誤って検出したあるサンプル中のRタンパク質;この~50 kDaバンドは、α5-GABA由来の組織サンプルでも見られましたあるRノックアウトマウスは、この抗体がBS3架橋反応によって偶然生成された無関係な抗原と交差反応し始めたことを示唆している。抗体の特異性は、BS3架橋反応の有無にかかわらず、理想的には、目的のタンパク質に対してノックアウト組織サンプル(利用可能な場合)を使用して徹底的に決定することをお勧めします。(3)ここに記載されている現在のプロトコルは、各GABAが属する細胞型に対応していませんあるRサブタイプが発現される(例えば、ニューロンおよびアストロサイト)。いくつかのGABAのためにある主にニューロンで発現されるRサブタイプ(例えば、α1、α5)18バルク脳組織を用いて得られた架橋アッセイデータは、このプロトコルに記載されているように、ニューロン表面レベルを反映する情報を提供するはずである。ただし、他のGABAの場合あるニューロンとアストロサイトの両方で高発現するRサブタイプ(例えば、α2)18、ニューロンとアストロサイトの受容体表面レベルを別々に研究することは興味深い。この目的のために、従来の細胞ソーティング(例えば、蛍光活性化セルソーティング[FACS]19)は、BS3架橋プロトコルに統合されてもよい。細胞ソーティングのための細胞解離ステップは、BS3クエンチングステップの後に行うことができますが、FACSのすべての手順と条件(使用するバッファー、温度、インキュベーション時間など)が架橋アッセイの手順と条件と互換性があることを検証する必要があります。さらに、FACSアプローチはGABAに対してのみ使用することができるあるRサブタイプは、ペリソマティック細胞コンパートメントに局在することが知られているが(例:α2)、遠位樹状突起に富むサブタイプ(例:α5)には局在しない18末梢または遠位の細胞コンパートメントは、細胞選別に必要な広範な細胞解離ステップ中に失われる可能性が高いためです。(4)最後に、高分子量タンパク質種のデンシトメトリーに基づいて表面レベルを直接評価するのではなく、受容体の総量から膜内関連受容体の量を差し引いて表面受容体レベルを計算すると、結果がより一貫していることがわかりました。これは、PVDF膜へのこれらの高分子量タンパク質種の転写効率が、より小さなサイズ(例えば、α5-GABAの場合は~55 kDa)の元のインタクトタンパク質の転写効率よりも変動するためと考えられますあるしたがって、結果のセクションで説明されている方法との凡例に従うことをお勧めします。 図 8 表面受容体レベルを計算する。
GABAARに対する慢性ストレスの影響とは別に、BS3架橋アッセイは、多くの神経学的または神経精神医学的状態を調査するための実験的操作を伴う遺伝子改変マウスまたはげっ歯類モデルにも適用できます。このアッセイは、ラット脳の側坐核におけるグルタミン酸受容体の表面発現に対するコカイン誘発効果を捕捉するために首尾よく使用されている20,21。このアッセイはまた、ヘテロ接合型BDNFノックアウトマウス22のPFCにおけるα5−GABAAのARの表面発現の低下を示すためにも使用されている。別の以前の研究では、ラットの肝性脳症のモデルにおいて、付随する空間学習障害は、この架橋アッセイに基づいてグルタミン酸およびGABAA受容体の表面発現の変化と因果関係があった23。要約すると、BS3化学架橋アッセイは、脳内のさまざまな受容体系、ならびに事実上他の末梢組織または器官における脳領域特異的および文脈依存的変化を捕捉するための汎用性の高いツールを提供します。このアッセイは、強壮性阻害(特にα5-GABAARの場合)の電気生理学的記録、極低温電子顕微鏡法、表面ビオチン化など、表面受容体レベルを評価するための他の方法と並行して実施して、結果を相互比較および検証することもできます。
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Disclosures
著者らは利益相反を報告していない。
Acknowledgments
著者らは、研究期間中にわたって動物の世話をしてくれたCAMH動物施設のスタッフに感謝しています。この研究は、カナダ健康研究所(CIHRプロジェクト助成金#470458からT.T.へ)、CAMHからのディスカバリー基金(T.P.へ)、統合失調症とうつ病に関する研究のための全国同盟(ESへのNARSAD賞#25637)、およびキャンベルファミリーメンタルヘルス研究所(ESへ)。E.S.は、新規GABA作動性化合物を臨床に持ち込むことに専念するバイオ医薬品であるダモナファーマシューティカルズの創設者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
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