Summary
提供了一个实验管道，用于使用MouseWalker（MW）工具箱定量描述自由行走的小鼠的运动模式，范围从初始视频记录和跟踪到定量后分析。使用小鼠脊髓挫伤损伤模型来证明MW系统的有用性。
Abstract
复杂且高度协调的运动程序（例如步行和跑步）的执行取决于脊柱和脊髓上回路的节律激活。胸椎脊髓损伤后，与上游回路的通信受损。这反过来又导致协调的丧失，恢复潜力有限。因此，为了更好地评估给予药物或治疗后的恢复程度，有必要使用新的、更详细和准确的工具来量化脊髓损伤动物模型中步态、肢体协调和其他运动行为的精细方面。多年来，已经开发了几种测定方法来定量评估啮齿动物的自由行走行为;然而，它们通常缺乏与步进步态策略、足迹模式和协调相关的直接测量。为了解决这些缺点，提供了MouseWalker的更新版本，它将受挫的全内反射（fTIR）走道与跟踪和量化软件相结合。这个开源系统已经适应于提取几个图形输出和运动学参数，并且一组后量化工具可以分析提供的输出数据。这份手稿还展示了这种方法如何与已经建立的行为测试相结合，定量描述脊髓损伤后的运动缺陷。
Introduction
四肢的有效协调并非四足动物所独有。人类的前肢-后肢协调对于完成多项任务仍然很重要，例如游泳和行走时的速度改变1.各种肢体运动学2 和运动程序1，3，4 以及本体感觉反馈回路5 在人类和其他哺乳动物之间是保守的，在分析运动障碍（例如脊髓损伤 （SCI）6，7，8）的治疗方案时应考虑这些选择。
为了行走，来自前肢和后肢的几个脊柱连接需要正确连接和有节奏地激活，这需要来自大脑的输入和来自体感系统的反馈2，9，10。这些连接在中央模式发生器（CPG）中达到顶峰，它们分别位于前肢和后肢的颈椎和腰椎水平1，9，10。通常，在 SCI 之后，神经元连接的破坏和抑制性神经胶质瘢痕12 的形成限制了运动功能的恢复，结果从完全瘫痪到一组肢体功能受限不等，具体取决于损伤的严重程度。精确量化 SCI 后运动功能的工具对于监测恢复和评估治疗或其他临床干预措施的效果至关重要6.
SCI 小鼠挫伤模型的标准度量测定是巴索小鼠量表 （BMS）13，14，这是一种非参数评分，考虑了空旷场地的躯干稳定性、尾部位置、足底步和前肢-后肢协调。尽管BMS在大多数情况下非常可靠，但它需要至少两名经验丰富的评分员来观察动物运动的所有角度，以解释自然变异性并减少偏差。
还开发了其他测定方法来定量评估SCI后的运动性能。其中包括旋转测试，它测量在旋转圆柱体上花费的时间15;水平梯子，测量错过栏杆和正梯子抓斗的数量16，17;以及横梁行走测试，该测试测量动物在穿越窄梁时所花费的时间和失败次数18.尽管反映了运动缺陷的组合，但这些测试都没有产生关于前肢 - 后肢协调的直接运动信息。
为了具体和更彻底地分析步行行为，已经开发了其他测定方法来重建步数循环和步态策略。一个例子是足迹测试，其中动物的墨水爪子在一张白纸上画一个图案19.虽然执行简单，但提取步幅等运动学参数既麻烦又不准确。此外，缺乏动态参数，例如步进周期的持续时间或腿定时协调，限制了其应用;事实上，这些动态参数只能通过分析啮齿动物穿过透明表面的逐帧视频来获取。对于SCI研究，研究人员使用跑步机从侧面分析了步行行为，包括重建步数循环和测量每个腿关节的角度变化4，20，21。尽管这种方法可以提供非常丰富的信息6，但它仍然专注于一组特定的肢体，并且缺乏额外的步态特征，例如协调性。
为了填补这些空白，Hamers及其同事开发了一种基于光学触摸传感器的定量测试，使用受挫全内反射（fTIR）22。在这种方法中，光线通过内部反射 穿过 玻璃传播，在按压爪子时散射，最后被高速相机捕获。最近，这种方法的开源版本，称为MouseWalker，已经可用，这种方法将fTIR走道与跟踪和量化软件包23相结合。使用这种方法，用户可以提取大量定量参数，包括步数、空间和步态模式、脚印定位和前肢-后肢协调，以及视觉输出，例如脚印模式（模仿墨水爪测定6）或相对于身体轴的站立阶段。重要的是，由于其开源性质，可以通过更新 MATLAB 脚本包来提取新参数。
在这里，更新了以前发布的 MouseWalker23 系统组件。提供了如何设置它的说明，以及实现最佳视频质量、跟踪条件和参数采集所需的所有步骤。还共享了其他量化后工具，以增强对MouseWalker（MW）输出数据集的分析。最后，通过在脊髓损伤（SCI）背景下获得一般运动性能的可量化值，特别是步道周期和前肢 - 后肢协调，证明了该工具的有用性。
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Protocol
所有处理、手术和术后护理程序均由医学研究所分子内部委员会 （ORBEA） 和葡萄牙动物伦理委员会 （DGAV） 根据欧洲共同体指南（指令 2010/63/EU）和葡萄牙动物护理法 （DL 113/2013） 批准，许可证为 0421/000/000/2022。本研究使用9周龄的雌性C57Bl / 6J小鼠。尽一切努力尽量减少动物的数量并减少研究中使用的动物的痛苦。MATLAB脚本和MW软件的独立版本是开源的，可在GitHub上获得。
存储库 （https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker）。虽然MW软件是在MATLAB R2012b中开发的，但它已经适应在MATLAB R2022b中运行。 图1 显示了MW的分析工作流程。
1. 设置鼠标步行者 （MW） 设备
- 如前所述组装MW装置23，或适应实验设计的特定需求（有关设置的更多详细信息，请参见 材料表 和 补充图1 ）。
注意：步行竞技场可以做得更宽，以容纳更大的动物，如老鼠。 -
验证动物行走的有机玻璃是否干净且无划痕。使用光滑的清洁布，并尽量减少使用高浓度的有机溶剂，如氨或乙醇，这可能会损坏有机玻璃（建议使用3%过氧化氢，7%乙醇或任何兼容且适当的有机玻璃消毒剂）。如有必要，请更换有机玻璃。
- 为高速摄像机设置快速镜头和大光圈（即较小的光圈值）以捕获大量光线，因为这有助于记录fTIR信号（参见 材料表）。
注意：镜头不应产生光学失真，尤其是在图像边缘。可以通过记录已知图案（例如条纹或正方形）然后在 ImageJ/FIJI 24 上测量块的大小来测试光学畸变（使用线条工具，然后单击分析 >测量）。例如，一个 1 厘米大小的正方形在图像中心和边缘应具有相同的像素尺寸。变化应小于 5%。 - 从背景灯箱点亮五彩 LED 灯条。
- 点亮人行道灯箱上的白色 LED 灯条。
注意：彩色LED也可以使用25 ，以方便区分封装/主体/背景。 - 在房间灯熄灭的情况下，验证背景灯箱和走道的光强度。如有必要，使用电位计或半透明塑料调整强度。这些必须进行优化，以便像素强度按以下顺序增加：动物的身体<背景<脚印。
- 要检查动物身体/背景/脚印的像素强度，请在 ImageJ/FIJI24 上打开图像序列，然后单击分析 >测量。封装信号不应过饱和，因为这会阻止定义封装的边界（即脚趾和脚垫）（补充图2）。
- 在视频录制软件上调整人行道的图像对比度。对比度可以通过两种方式进行调整：调暗或增加 LED 灯条上的照明，或者调整相机镜头光圈。
- 正确放置镜头，使其处于相同的高度，位于 45° 反射镜的中心，并与人行道垂直 （90°）。这将沿左右走道生成一个恒定比例的图像。
注意：避免在多个录制会话中更改摄像机位置（距离、高度和方向）。如有必要，标记应放置三脚架的地板。这将保持图像功能。 - 将镜头聚焦在有机玻璃表面。这可以使用接触有机玻璃表面的非破坏性物体进行测试。
注意：使用较低的光圈镜头值，景深会变小，从而使对焦更加困难。 - 确保在测定过程中所有设置保持不变，因为它们可能会改变录制视频的像素强度。
2. 视频采集
- 在测试之前，确保小鼠熟悉房间和设备。至少保存 1 天用于习惯化（第 0 天）。为避免过度训练，请在与其他行为测试不同的日期（最好是第二天）进行MW测试。
- 在视频录制软件中，确保至少 50 厘米的人行道可见。
- 调整录制设置以截断人行道区域。这将减小视频大小并优化视频采集。
- 在每次会议前拍摄常规尺子的照片或短视频。稍后将在“设置窗口”中使用每厘米的像素数来校准视频。
- 开始视频采集，抓住尾巴根部将动物放在走道边缘，以免受伤。确保动物向前移动到平台的最边缘。以至少 100 帧/秒的速度执行视频录制，以确保平稳的步态过渡。
- 如果需要，通过轻轻敲击走道墙壁或打响/拍打手指来激励动物移动。但是，请避免物理轻推，因为这可能会影响结果。
- 将视频直接保存为 TIFF （使用 LZW 压缩）、JPEG 或 PNG 格式的图像序列。如果摄像机录制为原始MOV文件，请在ImageJ / FIJI24 中打开文件并单击 文件>另存为 图像序列（或使用其他软件，例如LosslessCut25），将视频转换为图像序列>。
注意：大多数动物在被放入人行道后立即开始行走;因此，建议在放置动物之前开始视频采集。
3. 为 MW 跟踪软件准备视频
- 拍摄足够多的每只鼠标的完整运行。每个条件要拍摄的动物数量和完整运行的数量必须根据每个实验设计决定。完全运行是指鼠标在没有长时间停止的情况下走过整个 50 厘米的人行道（在本实验中，选择了三个完整的运行）。
注意：根据图像采集软件的不同，可能需要将视频裁剪到最小的ROI。这将提高跟踪和输出生成的速度。 - 在 ImageJ/FIJI24 中，通过单击图像>“堆栈” >“工具”>“创建子堆栈”，选择鼠标在屏幕上的帧。MW上的跟踪要求头部和尾部在所有帧中都可见。但是，可以从单个视频录制中创建多个子堆栈，这些子堆栈稍后将表示每次运行。
- 通过单击“文件”>“另 存为图像序列”，将每个子堆栈分别保存在不同的文件夹中>。MW 软件随后会在每次开始分析运行时自动在每个目录中创建一个子文件夹。
4. 追踪
- 打开 MATLAB，将包含 MW 脚本的文件夹添加到工作目录，然后在主命令行上运行 “MouseWalker.m”。
注意：使用 MATLAB 下的 MW 软件可以在 MATLAB 的主控制台上查看跟踪错误消息并选择所需的输出数据（通过打开主脚本文件 “MouseEvaluate.m” 并将输出更改为 1 或 0：excel 文件、脚步图、姿势轨迹和步态模式）。 - 将视频文件夹加载为“输入目录”。还可以选择输出文件夹;但是，这不是必需的，因为MW软件会在“输入目录”中自动创建一个名为“结果”的新文件夹。
- 使用箭头“<<”、“<”、“>>”和“>”检查视频帧是否全部正确加载到 MW 软件中。
- 转到所有校准和阈值参数所在的“设置窗口”。这些设置可能会根据背景和足迹的像素强度以及主体和足迹的最小尺寸以及其他因素而变化（请参阅 补充图 2 中的示例）。通过单击“ 预览 ”按钮来测试更改某些参数的效果。
- 使用不同的绘图样式，包括“身体+脚+尾巴”、“仅身体”、“仅脚”和“仅尾巴”，以帮助区分调整阈值参数后的身体部位。
- 利用右侧面板上的工具测量亮度或大小（分别使用“亮度”和“标尺”按钮）。只要相机距离保持不变，所有设置都可以保存为“默认”。
- 调整阈值参数后，检查视频是否已准备好进行自动跟踪。转到第一帧，然后单击 自动 开始跟踪。可以实时执行此步骤，并且需要几分钟，具体取决于视频的大小和计算机的性能。
- 如果自动跟踪错误地标记了身体特征，请取消自动跟踪，输入新设置，然后重新启动该过程。
- 跟踪完成后，检查是否需要手动更正。要更正，请使用中间面板选择或取消选择，并指示右前 （RF）、右后部 （RH）、左前 （LF） 和左后后 （LH） 爪脚印、头部、鼻子、身体（分为两段）和尾部位置（分为四段）的位置。按“保存”按钮 保存 更改。
注意：所有按钮和大多数命令都有一个快捷键（有关详细信息，请查看相关手册23）。为了方便视频滚动和键盘快捷键的执行，可以使用带有可编程按钮和穿梭轮的硬件控制器，如 Contour ShuttlePro V2。 - 点击 评估 从跟踪的视频生成输出文件。根据所选的所需输出（请参阅步骤 4.1），此步骤可能需要几分钟时间。
- 检查所有图形输出数据图是否保存在“结果”文件夹中。通过检查一些图形输出来验证跟踪的准确性，例如“立场轨迹”，其中可以检查所有爪子位置是否一致。
- 如果发现错误，请手动更正跟踪（如果可能;否则，请删除“结果”文件夹，然后使用新设置再次执行自动跟踪），然后再次单击 “评估 ”命令。
- 检查MW软件生成的所有定量测量值是否保存在Excel电子表格中，并汇总在“1.Info_Sheet”。确保公式分隔的 excel 选项与脚本匹配。小数点分隔符必须是“，”，千位分隔符必须是“;”。
- 使用“MouseMultiEvaluate.m”脚本将所有运行的测量值聚集到一个新文件中进行分析。
- 首先，生成一个包含所有视频的文件夹路径的.txt文件（例如“视频文件.txt”）。确保每行对应于一个视频。
- 然后，将“MouseMultiEvaluate（'Videofiles.txt'）”写入命令行。将在工作目录中生成一个名为“ResultSummary.xls”的 excel 文件（请参阅 GitHub 存储库中的示例）。
注意： 图2 表示MW软件从一只记录的动物的视频中获得的图形输出。
5. 运动学数据分析工作流程
- 根据以下先决条件，编辑步骤 4.10 中生成的 Excel 工作表，其中包含要使用提供的 Python 脚本进行处理的数据。
- 在第一列标题中，指定实验条件。为组/条件名称后面的每一行命名（来自同一组的个人必须具有相同的名称）。第一组必须是控件或基线（这仅对于热图绘图（步骤 5.6）是必需的）。
- 在第二列中，指定动物 ID。这是强制性的，尽管此信息不会用于绘图生成。
- 在第三列以后，选择将用于分析的电机参数。确保第一行是参数的名称（这些名称稍后将出现在图中）。
- 打开 Anaconda Navigator，然后执行 Spyder 以打开提供的 Python 脚本。
注意：所有脚本都是用Python 3.9.13开发的，在Anaconda Navigator 2.1.4中使用Spyder 5.2.2执行，并且可以在材料表和GitHub存储库中找到（其中包括其他 材料 ，例如视频示例，Excel示例文件和FAQ文档）。可以在 Anaconda Navigator 之外执行脚本;但是，此图形用户界面更加用户友好。 - 使用“Rawdata_PlotGenerator.py”生成原始数据图。这将允许将每个参数可视化为速度的函数。
- 在Spyder中打开“Rawdata_PlotGenerator.py”，然后单击 “播放 ”按钮运行代码。
- 在自动窗口中选择要分析的 Excel 文件和工作表名称。如果工作表名称未更改，请填写“Sheet1”。
- 原始数据图将显示在绘图控制台（右上方面板）中。要保存绘图，请单击绘图控制台中的 保存 图像或 保存所有图像 按钮。
- 使用脚本“Residuals_DataAnalysis”计算用于数据分析的残差。此脚本将生成一个 CSV 文件，其中包含所有电机参数的残差计算。
注意：MW 提取的许多测量步态参数随速度而变化（例如，摆动速度、步长、站立持续时间、站姿直线度和步态指数）。因此，建议对基线实验的每个参数与速度执行最佳拟合回归模型，然后确定与此回归模型相关的每个实验组的残差值。然后将数据表示为与残差归一化线26 的差值。- 在Spyder中打开“Residuals_DataAnalysis.py”，然后单击 “播放 ”按钮运行代码。
- 在自动窗口中选择要分析的 Excel 文件和工作表名称。如果工作表名称未更改，请填写“Sheet1”。
- 将 CSV 文件保存在与数据相同的文件夹中。控件（或基线）必须是 Excel 文件中的第一个组。
- 使用“PCA_PlotGenerator.py”脚本执行主成分分析 （PCA）。
注意：这种无监督降维方法用于生成更简洁的数据表示27，28，29（图3A，B）。PCA 脚本包括以下步骤。首先通过居中和缩放对数据进行预处理，然后PCA算法计算协方差矩阵以确定变量之间的相关性，并计算协方差矩阵的特征向量和特征值以识别主成分。选择前两个或三个主分量分别用于在 2D 或 3D 图中表示数据。图中的每个点对应于一种动物，并代表一个不同的抽象变量。颜色编码的点用于区分特定组。因此，点簇反映了相应个体共享的相似行走模式。- 在Spyder中打开“PCA_PlotGenerator.py”，然后单击 “播放 ”按钮运行代码。
- 在自动窗口中选择要分析的 Excel 文件和工作表名称。如果工作表名称未更改，请填写“Sheet1”。
- 确保 PCA 2D 和 3D 图显示在打印控制台（右上方面板）中。每种颜色代表不同的组，图例显示在绘图旁边。要保存绘图，请单击绘图控制台中的 保存图像 。
- 使用“Heatmap_PlotGenerator.py”生成热图。确保热图生成器创建一个表，显示每个电机参数27 的基线组（或对照组）与其他组之间的统计差异（图4）。每列描绘一个组，每行与特定的电机参数相关。
注意：统计分析是使用单因素方差分析进行的，然后是Tukey的事后检验（用于正态分布）或Kruskal-Wallis 方差分析，然后是邓恩事后检验（对于非正态分布）。异常值被排除在分析之外。 P 值由颜色代码表示，红色和蓝色阴影分别表示相对于对照（或基线）的增加或减少。色阴影表示统计显著性，较深的颜色表示较高的显著性，较浅的颜色表示较低的显著性。对应于 P < 0.001;** 对应于 P < 0.01;和 * 对应于 P < 0.05。白色表示无变化。- 在Spyder中打开“Heatmap_PlotGenerator.py”，然后单击 “播放 ”按钮运行代码。
- 在自动窗口中选择要分析的 Excel 文件和工作表名称。如果工作表名称未更改，请填写“Sheet1”。
- 在第二个自动窗口中选择数据类型：原始数据或残差数据。如果未选择某个选项，则残差数据为默认值。
- 热图将显示在绘图控制台（右上方面板）中。要保存绘图，请单击绘图控制台中的 保存图像 。
注意：控件（或基线）必须是 Excel 文件中的第一个组。
- 使用“Boxplots_PlotGenerator.py”生成箱线图。该工具将允许生成箱线图，表示每组所有电机参数的值分布（图 5、图 6 和图 7）。
注意：每个框都包含中位数作为中间线，框的下边缘和上边缘分别表示 25% 和 75% 的四分位数。晶须表示完整数据集的范围，不包括异常值。异常值定义为分别低于或高于 25% 和 75% 四分位数的四分位数范围 1.5 倍的任何值。- 在Spyder中打开“Boxplots_PlotGenerator.py”，然后单击 “播放 ”按钮运行代码。
- 在自动窗口中选择要分析的 Excel 文件和工作表名称。如果工作表名称未更改，请填写“Sheet1”。
- 在第二个自动窗口中选择数据类型：原始数据或残差数据。如果未选择某个选项，则残差数据为默认值。
- 箱线图将显示在绘图控制台（右上方面板）中。要保存绘图，请单击绘图控制台中的 保存 图像或 保存所有图像 按钮。
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Representative Results
标准BMS系统描述了SCI14之后的总运动缺陷。由于其主观性，其他定量测定通常与BMS一起进行，以产生更详细和精细的运动评估。然而，这些测试未能显示有关步步周期、步进模式和前肢-后肢协调的具体信息，这对于了解脊柱回路如何维持功能并适应不完全的 SCI 非常重要。本节展示了MW工具箱如何帮助监测SCI后运动功能的恢复，并添加有关步行行为的相关信息。
将研究样品分为两组9周龄的雌性C57Bl / 6J小鼠：SCI实验组（n = 11），其中动物接受椎板切除术，然后使用无限地平线撞击器在T9 / T10椎柱水平进行中度至重度挫伤（见 材料表）;以及假损伤对照组（n = 10），其中仅在同一柱水平上进行椎板切除术（图1，步骤1）。监测SCI和假损伤动物的运动行为30 d。MW测试在手术前习惯日（基线）和受伤后15天，22天和30天（dpi）进行（图1，步骤2）。为了进行比较，小鼠在手术前以1 dpi，3 dpi，7 dpi，14 dpi，21 dpi和30 dpi平行进行BMS测试（补充图3）。在跟踪使用MW获得的所有视频后，然后生成两种类型的输出文件：图形输出，显示每次运行后几个参数的可视化表示，以及运动学输出，总结所有可测量的电机参数（图1，步骤3和步骤4）。
因此，使用一组 Python 脚本（请参阅 材料表 和 GitHub 存储库链接），获得了原始数据图（图 1，步骤 5）。由于大多数参数受动物速度的影响，因此在受伤前执行基线组的回归模型以及每种情况的测量残差值（图1，步骤6）。为了检查运动学曲线以及对照组（假）组和实验组（SCI）之间的显着差异，对所有运动学参数（总共79个）进行了三阶主成分分析（PCA），并生成了热图，其中包含最能描述数据集的电机参数集合（总共33个）（图1，步骤7a，b）。最后，将SCI后受影响的特定运动参数与受伤前的基线进行比较（图1，步骤7c）。
图 1：MW 分析工作流程的示意图。 （1）选择动物进行椎板切除术（假对照组）或椎板切除术，然后进行脊髓损伤（实验组）。（2）然后在受伤前一天和受伤后第15、22和30天对动物进行行为测定。（3） MW生成两种类型的输出数据：（a）多个参数的图形可视化，例如站姿轨迹，步态和步进模式，以及（b）所有可测量电机参数的运动学摘要。（4）所有对照和实验数据都使用MATLAB上的“MouseMultiEvaluate.m”脚本聚集到一个文件中。（5） Python 的“RawData_PlotGenerator”脚本生成所有可测量电机参数如何根据速度变化的可视化表示。如果参数与速度不相关，则可以跳到 （7）;但是，由于SCI之后的大多数参数都强烈依赖于速度，因此应使用Python的“Residual_DataAnalysis”脚本生成模型（6）。生成每个电机参数的残差值后，进行数据分析（7）：（a）使用带有“PCA_PlotGenerator”脚本的参数选择进行主成分分析（PCA）;（b） 使用“Heatmap_PlotGenerator”脚本创建热图，以显示不同参数的条件之间的统计显著差异;c） 使用“BoxPlot_PlotGenerator”脚本评估 SCI 后更改的几个单独参数。所有脚本都可以在材料表和 GitHub 存储库链接中找到。脚本以红色显示。请点击此处查看此图的大图。
从MW收集的图形输出数据中，可以确认SCI后脚印视觉显示中众所周知的突然变化。在MW生成的“数字墨水”测定中，检测到后爪缺乏支撑（图2A），同时左后爪和右后爪的足迹面积减少（图2B），从15 dpi开始保持（数据未显示）。此外，在每个步骤周期内，MW计算与站立阶段（即爪子着陆和升空前的时间）和摆动阶段（即肢体离开地面的时间）相关的参数。因此，MW可以生成视觉“站立轨迹”，该轨迹考虑了身体中心和轴相对于每条腿的位置及其在站姿阶段23期间的足迹中心。为每只动物获得的整体 姿势轨迹 显示出几个独特的特征（图2C）。该数据显示，在SCI之后，从15 dpi开始，后爪在着陆和升空时的姿态轨迹更短，爪子位置更随机（图2C）。
图 2：MW 软件从跟踪视频中获得的代表性图形输出。 （A）一只SCI动物的“数字墨水”打印，在几个时间点显示每个爪子的不同颜色：红色（右前），黄色（左前），绿色（右后）和蓝色（左后）。（B）一只SCI动物在15 dpi下的左前（LF），左后（LH），右前（RF）和右后（RH）的脚印。（C）一只SCI动物在多个时间点的“立场轨迹”。其中一条腿的 AEP 和 PEP 在第一个面板中进行了说明。AEP 和 PEP 的“足迹聚类”对应于每个视频中平均 AEP 或 PEP 坐标的标准偏差。缩写：dpi = 受伤后天数;厘米 = 厘米;px = 像素。请点击此处查看此图的大图。
接下来，在通过MW计算后分析运动输出（图3和图4）。为了获得数据集的更简洁的描述，并测试从MW获得的运动学运动参数是否足以描述SCI动物随时间变化的运动缺陷，进行了PCA27。值得注意的是，数据中40%的方差可以在第一个分量（PC1：40.1%）中解释，该分量将具有SCI的动物组与其他动物分开，p值低于0.001基于单因素方差分析检验（图3A，B）在所有时间点（15 dpi，22 dpi和30 dpi）。其他组件的贡献也很差（PC2：11%和PC3：8.6%）。每个组件的每个电机参数贡献的分配权重如补充图4所示。此外，数据集中的方差不足以反映随时间的变化（即，在15 dpi，22 dpi和30 dpi之间），这复制了先前描述的运动恢复平台14。总之，这些结果表明，从MW获得的运动学参数强烈描述了SCI后在所有时间点观察到的运动缺陷。
图 3：残余数据分析后由 MW 软件获得的所有运动电机参数 （79） 的主成分 分析。 （A） 三组分 PCA 分析的 3D 可视化。（B） 2D 可视化，圆圈代表收集数据的 50%。在 PC1 中，15 dpi、22 dpi 和 30 dpi 的 SCI 组与假手术组和基线（受伤前）显著不同， p 值< 0.001，由单因子方差分析确定。每个单独的小点或三角形代表每只动物三个视频的平均值，而较大的点或三角形代表平均点（每个条件n = 10-11，基线组n = 21）。每个组件的贡献在每个轴上指示。缩写：dpi = 受伤后天数;SCI = 脊髓损伤;PC = 主成分。 请点击此处查看此图的大图。
然后，根据对数据集的描述强度（总共 33 个）选择一组电机参数，并生成热图（图 4）。事实上，大多数运动参数在所有时间点（15 dpi、22 dpi 和 30 dpi）都显示出 SCI 后的剧烈变化，而假损伤的对照组仅在 30 dpi 时显示出显着变化。假手术组的这些变化可以用挥杆速度的整体下降来解释，可能是由于测试习惯，这将在后面讨论。
值得注意的是，SCI动物的行走速度比假伤对照组慢（数据未显示）。然而，与速度无关，在15 dpi和30 dpi下，SCI动物表现出较高的摆动持续时间，较低的站立持续时间和较低的占空比指数，这与站立持续时间/步进周期23有关。这些结果表明，上述腿部位置的改变是SCI的特征，如其他动物模型30，31，32所示，与速度改变无关（图4）。
还应该提到的是，左右同步不受影响，因为没有观察到前肢和后肢的“相位”指数的显着变化10，23 （图4），表明左右肢之间的耦合完好无损。
此外，SCI小鼠在前肢和后肢均表现出较低的“站立直线度”指数（位移/路径长度）（图4）。此参数测量迹线相对于理想条件的线性程度，理想条件将是一条直线（范围从 0 到 1，表示线性迹线）27。因此，这些结果表明该组中有很强的直行能力。
对于每个站姿阶段，MW绘制身体振荡的重建，从爪子触地开始 - 前极端位置，或AEP - 并在升空之前结束 - 后极端位置，或PEP（参见 图2C中的示例）。AEP 和 PEP 的“足迹聚类”测量每个视频中平均 AEP 或 PEP 坐标的标准偏差。SCI动物在所有时间点都显示出AEP的后爪 足迹聚类 增加，并且仅在15 dpi时观察到假损伤组的显着影响（图4）。这表明SCI动物在秋千后着陆时无法正确定位后肢。此外，PEP 的前爪“足迹聚类”减少，而 PEP 的后爪足迹聚类减少，为 30 dpi（图 4）。这些结果与在绘制的“姿势痕迹”中观察到的结果一致，并表明受伤后前爪的位置变得更加受限。
最后，根据爪子位置的变化，爪子引起的步态策略和“压力”发生了变化，通过该区域的平均亮度来衡量（图4），这将进一步讨论。
图4：热图显示了与手术前一天相比比较SCI动物和假损伤动物的显着改变的运动参数的集合，这是MW在残余数据分析后获得的。 n = 10-11 每个条件;基线组包括手术前一天的所有动物，n = 21。数据由统计分析后的 p 值表示，使用单因素方差分析，然后是 Tukey 事后检验（对于正态分布）或 Dunn 事后检验（对于非正态分布）。P 值由颜色代码表示，红色和蓝色阴影分别表示相对于基线的减少或增加。色调表示统计显著性，颜色越深表示显著性越高，颜色越浅表示显著性越低;< 0.001;**P < 0.01;*P < 0.05。白色表示无变化。缩写：dpi = 受伤后天数;SCI = 脊髓损伤;s = 秒;毫秒 = 毫秒;平均 = 平均;F = 前;H = 后腿;AEP = 前极端位置;PEP = 后极端位置;LF = 左前;LH = 左后腿;RF = 右前方;RH = 右后腿。请点击此处查看此图的大图。
随后，我们试图了解哪些个体参数最适合描述SCI动物在不同损伤阶段（即15 dpi，22 dpi和30 dpi）的运动缺陷。我们首先检查了阶梯周期参数，这些参数显示了后肢从完全瘫痪发展到部分功能时前肢和后肢之间的差异（图5）。虽然前肢的平均摆动速度相对于基线（受伤前）显着增加，但后肢摆动速度没有显着变化（尽管有低于基线的趋势）（图5A，B）。同时，前肢的平均步长减少，后肢没有显着变化（图5C，D）。毫不奇怪，受伤的小鼠在15 dpi以后表现出前肢摆动持续时间减少和后肢摆动持续时间的反向增加（图5E，F）。综上所述，这些结果表明前肢采用了更快的节律，每个后肢周期有两个前肢周期。这种 2：1 的循环比之前已在大鼠1，33 的 SCI 半切术后描述过，并说明了前肢 - 后肢协调缺陷的一个关键方面，在小鼠中30 dpi后无法恢复。
图 5：前爪和后爪在受伤前 1 天的几个时间点以及 SCI 动物在 15 dpi、22 dpi 和 30 dpi 下的阶跃循环参数 （n = 11）。 （A，B）前爪和后爪相对于基线的平均摆动速度。（中，四）前爪和后爪相对于基线的平均步长。（中、女）前爪和后爪相对于基线的平均摆动持续时间。在箱线图中，中位数由中线表示，箱体的下边缘和上边缘分别表示 25% 和 75% 的四分位数;晶须表示完整数据集的范围。异常值由单个点表示。统计分析采用单因素方差分析，然后进行Tukey事后检验（正态分布）或邓恩事后检验（非正态分布）。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001。缩写：dpi = 受伤后天数;SCI = 脊髓损伤;厘米 = 厘米;s = 秒。请点击此处查看此图的大图。
MW软件还能够通过测量分配给特定腿部组合的帧数来计算小鼠的步进模式，这可以作为特定步态策略存在的代理。在较慢的速度下，未受伤的小鼠倾向于采用“步行步态”，其中大多数框架具有单腿摆动（无论爪子位置如何）。在跑道上最常见的中速下，小鼠会变成小跑步态，其中最具代表性的配置是对角线腿摆动。最后，在更高的速度下，小鼠使用“奔驰步态”，三条腿同时摆动23，34。其他不太常见的配置包括起搏步态，主要表现为侧腿摆动（左腿或右腿）和“束缚/跳跃步态”，后肢或前肢同时摆动10。但是，应该记住，在SCI的背景下，其中一些配置，例如三腿摆动，可以反映有缺陷的后肢爪定位，因此与特定的步态策略（在这种情况下，奔驰）不完全匹配。因此，通过单独比较支腿配置来简化分析。
在进行残差分析后，注意到对角线摆动的患病率下降，伴随着所有时间点的单次摆动减少（图6A，B）。更有趣的是，横向摆动的患病率有所增加（图6C）。 起搏式步态 对于普通 C57BL/6J 鼠标来说并不典型;然而，已经报道在大鼠1的SCI半切术后发生。这种相位模式不足以改变前肢或后肢 相位指数 （如图 3所示），但说明了从后肢到前肢的脊柱反馈缺陷。此外，前肢/后肢摆动的患病率自然增加（图6D），可能是由于后肢足底步步不正确，以及三条腿摆动的增加（图6E）。
图 6：不同步进摆动配置的平均指数 。 显示了 SCI 动物在几个时间点 （n = 11） 的 （A） 对角线、（B） 单、（C） 横向、（D） 前/后和 （E） 三条腿摆动。在箱线图中，中位数由中线表示，箱体的下边缘和上边缘分别表示 25% 和 75% 的四分位数;晶须表示完整数据集的范围。异常值由单个点表示。使用单因素方差分析进行统计分析，然后进行Tukey事后检验（用于正态分布）或Dunn事后检验（针对非正态分布）。**P < 0.01;P < 0.001。缩写：dpi = 受伤后天数;SCI = 脊髓损伤;NA = 不适用。 请点击此处查看此图的大图。
最后，可以从MW中提取的另一个读数是“压力”作为亮度/面积的量度。随着速度的提高，与地面的接触面积减小，压力增加，因此对基线数据进行了线性回归，并测量了每个条件的残差值。人们注意到，前 爪的压力在所有 时间点上都显着增加，但这种效应的强度往往会随着时间的推移而降低，因为左前爪的变化在 30 dpi 时已经失去了统计意义（图 7A，C）。对左侧的这种特定影响可以用侧向损伤来解释，在本研究中，这可能优先影响脊髓的右侧。然而，正如预期的那样，受伤小鼠在所有时间点上后爪施加 的压力 都降低了，没有增加的趋势（图7B，D）。
图7：SCI动物后爪和前爪在几个时间点引起的压力（n = 11）。 （A）左前爪、（B）左后爪、（C）右前爪和（D）右后爪引起的压力，显示为与基线（受伤前一天）的相对差异。在箱线图中，中位数表示为中线，箱体的下边缘和上边缘分别表示 25% 和 75% 的四分位数;晶须表示完整数据集的范围。异常值由单个点表示。使用单因素方差分析进行统计分析，然后进行Tukey事后检验（用于正态分布）或Dunn事后检验（针对非正态分布）。**P < 0.01;P < 0.001。缩写：dpi = 受伤后天数;SCI = 脊髓损伤;厘米 = 厘米;px = 像素。 请点击此处查看此图的大图。
综上所述，这项研究说明了MW系统定量描述由SCI引起的运动损伤的能力，由于其他测试限制，有时可以忽略这些损伤。此外，它强调了SCI挫伤小鼠模型中随时间推移的局限性功能恢复。
补充图 1：MW 硬件组件。 （A）此设置划分如下：I-fTIR走道;二. fTIR支助基地和员额;三、人行道墙;IV - 45°镜;和 V - 背景背光。（B）Base-U-通道和人行道边线的特写图像。（三）人行道墙的设计。（D） 45°镜子设置的特写图像。缩写：cm = 厘米。 请点击此处下载此文件。
补充图2：fTIR视频的单帧，其中指示了像素强度和区域区域。 本研究中用于视频分析的身体、背景和足迹的像素强度显示在括号之间，并以红色表示，所有这些都针对图像清晰度进行了优化。应调整光强度，以便在不同区域之间获得适当的区分。身体和脚印的相对区域用黄色虚线表示。区域和像素强度都是在ImageJ/FIJI中获取的。 请点击此处下载此文件。
补充图3：本研究中分析的小鼠的BMS总分和（B）子分（n = 10-11）。 所有数据均表示为平均±SEM。 使用双向重复测量方差分析进行统计分析，然后进行邦弗朗尼事后检验;P < 0.001。缩写：BMS = 低音鼠标秤。 请点击此处下载此文件。
补充图4：每个组件的每个电机参数贡献的指定权重。 PCA 中 （A） PC1、（B） PC2 和 （C） PC3 残差分析后每个电机参数（共 79 个）的分配权重。截止线在0.04毫秒和-0.04处绘制。缩写：ms = 毫秒;平均 = 平均;SD = 标准偏差;F = 前;H = 后腿;AEP = 前极端位置;PEP = 后极端位置;LF = 左前;LH = 左后腿;RF = 右前方;RH = 右后腿;按 = 压力。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
在这里，通过分析SCI后的运动行为来证明MouseWalker方法的潜力。它为步进、足迹和步态模式的特定变化提供了新的见解，否则其他标准测试会错过这些变化。除了提供 MW 包的更新版本外，还使用提供的 Python 脚本描述了数据分析工具（请参阅步骤 5）。
由于MW生成了一个大型数据集和反映高维运动过程的运动学参数集合，因此采用了PCA;事实上，PCA已被广泛用于其他运动学数据集中，类似于这个数据集27，35，36（图3）。这种降维技术是一种简单而稳健的方法，具有最少的假设，可以定量识别运动学轮廓并快速将其与控制或基线条件区分开来。此外，生成热图以迅速识别与基线在统计上不同的参数（图4），以后可以单独分析（图5，图6和图7）。
随后，展示了可以从MW中提取的特定参数如何说明SCI动物中观察到的强劲运动缺陷，例如协调性。协调是以有组织的方式使用每个肢体执行任务的能力。通常，协调是通过梯子16，17 上的错误/积极事件的数量或在旋转15上花费的时间来间接衡量的。显然，MW计算了步进周期中爪子定位的变化（足迹模式）和“站立直线度”指数27。结果表明，这两个参数都受到损伤的显着影响（图4）。
此外，MW允许用户提取与时间动力学相关的参数。在SCI动物中观察到摆动/站立持续时间的显着破坏（图4），并且发现SCI小鼠通过加速前肢步步周期来补偿后肢支撑的丧失，从而减少前肢步长和平均摆动时间（图5）。这种影响可能与重心的转移有关，这迫使前爪承受更多的体重1。同样，它可能归因于长上升的本体脊髓通路的丧失，这些通路负责前肢和后肢 CPG 之间的协同相互作用1，9，32，最终导致前肢-后肢节律分离。
步态的特性可以说明运动网络的模块化组织1，34。尽管步进模式不是本例23中采用的步态策略的直接代表，但仍然可以得出一些重要的观察结果。在SCI小鼠的步进模式中观察到重要的改变（图6）。受伤的动物开始采用横向摆动（类似起搏的步态），对角线摆动也有所减少。这些适应似乎与试图协调前肢和后肢有关，再次证明了损伤下方和上方脊柱轨道之间的分离，这并没有恢复1，9，32。
SCI后的有限恢复也通过后肢肌肉活力的降低得到证实，如平均 压力 所衡量（图7）。因此，前肢被迫支撑更多的体重，这增加了 压力。虽然这里没有分析许多与肌肉动力学相关的参数（即屈肌和伸肌协调性7，21），但这种定量测量可以直接读取肢体支撑量。
这种MW分析也可以与标准BMS测试配合使用，该测试测量肢体旋转，爪子位置，尾巴位置和步步错误。一般来说，SCI小鼠的最高得分为4-5，最高子得分为3，这意味着它们可以偶尔执行到频繁的步骤，但大多在爪子抬起和/或着陆时旋转14（补充图2）。很明显，为什么SCI组中后爪的AEP值发生了显着变化，因为在摆动阶段四肢的非平行定位可能会影响爪子坐标。此外，在BMS中，由于存在阻止踩踏的实例或事件，例如踩下和跳跃14，后备箱通常被归类为严重。虽然无法量化对接行为或阻止踩踏的实例，但检测到MW中的后爪步步受限，具有更高的摆动持续时间（图5F），增加的三次腿摆动（图6E）和更低的压力（图7B-D）。此外，观察到前/后摆动显着增加（图6D）。对于这种行为表现，可能有两种互补的解释。首先，测量跳跃样步态，这在BMS测试中已经可以观察到。然而，这种行为也可能与双后肢缺乏正确的足底踩踏有关，导致足部拖拽或背部放置。总体而言，这些观察结果支持了SCI后树干稳定性严重受损的说法。最后，在 BMS 测试中得分高于 5 的要求之一是协调14，为此，评分者在测试期间必须至少遵守三次可访问的通过。其中，三个或更多可访问的通道中的两个需要归类为协调（即前肢和后肢交替）。从MW数据中，可以提取客观测量值，站立直线度指数和足迹聚类，直接量化协调，而与动物速度或可及的通过无关（图4）。此外，通过测量步进策略，可以客观地量化肢体之间的交替（图6）。这些参数清楚地表明，SCI小鼠始终不能直线行走并错位后肢。
虽然MW工具箱是研究SCI后运动缺陷的有用策略，但应考虑其一些局限性。首先，与采集参数（即相机位置、焦点、光强度）保持一致至关重要，这样才能保持时间点之间的图像特征。其次，人们注意到重复会导致习惯，这反过来又导致速度下降。这也有助于增加饲养/梳理行为，并在中途停止。对于受伤的动物，也有靠在人行道墙壁上的倾向，并在中途停止的次数增加。由于这些行为不是运动评估的一部分，因此不得考虑它们。首先，研究人员应该选择动物连续行走的视频，头部笔直。为了抵消这些行为对研究结果的影响，连续记录小鼠至少四到五次跑步，并允许沿着人行道向任一方向奔跑。之后，选择三个最佳记录的运行，并在ImageJ / FIJI24 （180°旋转）上调整到相同的方向。因此，每只动物由每个时间点汇集在一起的三次运行平均值表示。每种条件的动物数量越多，也可以降低预期的变异性。此外，应该注意的是，这种运动测试仅在达到足底步进后才推荐，因为跟踪系统是为微调运动评估而设计的。在这项研究中，注意到在 15 dpi 之前，MW 测试对运动评估不利，因为足部阻力增加和足底放置不正确，这可能会影响跟踪（数据未显示）。最后，某些参数（例如 足迹聚类）对生成的回归模型进行的外推非常敏感。因此，代码进行了相应的调整（请参阅 GitHub 链接中脚本中的文档）。
总体而言，MW可以强烈区分SCI动物和假损伤对照，并且MW也可以与已建立的测试合作，作为研究SCI后运动缺陷的宝贵方法。此外，还表明可以使用提供的Python脚本轻松地从MW数据集生成定量输出。这些工具提供了一个有效的实验管道，可以生成丰富多样的定量和图形输出集，这些输出补充了原始MW输出文件，并且可以进行更改以满足研究人员在分析和图形表示类型方面的目标。
该工具箱是研究其他运动相关疾病或运动功能障碍的宝贵方法，而不仅仅是与脊髓损伤相关的疾病或运动功能障碍。Skarlatou等人10 已经证明，发育过程中的重要支架蛋白Afadin中的特定突变通过产生两个中央管在脊髓中引起异常表型。这种缺陷导致左右肢体交替的丧失和肢体同步的患病率更高，这是典型的 跳跃步态。Stauch等人10 还说明，这种类型的系统可以根据用户的需要进行调整。在这种情况下，它被用于研究大鼠帕金森病模型中的特定行为缺陷。因此，该工具箱在不同的模型中具有广泛的应用，在这些模型中，预计会出现电机干扰，并且可以与现场已经建立的行为协议相结合。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者感谢Laura Tucker和Natasa Loncarevic对手稿的评论以及Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes的啮齿动物设施给予的支持。作者希望感谢Prémios Santa Casa Neurociências - 脊髓损伤研究奖Melo e Castro（MC-36/2020）对L.S.和C.S.M.的财政支持。这项工作得到了科学与技术基金会（FCT）（PTDC/BIA-COM/0151/2020）、iNOVA4Health（UIDB/04462/2020和UIDP/04462/2020）和LS4FUTURE（LA/P/0087/2020）的支持，得到了CEEC个人首席研究员合同（2021.02253.CEECIND）的支持。AFI得到了FCT（2020.08168.BD）的博士奖学金的支持。AMM得到了FCT博士奖学金的支持（PD/BD/128445/2017）。I.M.得到了FCT的博士后奖学金（SFRH / BPD / 118051 / 2016）的支持。DNS得到了FCT博士奖学金的支持（SFRH / BD / 138636 / 2018）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
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