Summary
Viene fornita una pipeline sperimentale per descrivere quantitativamente il modello locomotore dei topi che camminano liberamente utilizzando il toolbox MouseWalker (MW), che va dalle registrazioni video iniziali e dal tracciamento all'analisi post-quantificazione. Un modello di lesione da contusione del midollo spinale nei topi viene impiegato per dimostrare l'utilità del sistema MW.
Abstract
L'esecuzione di programmi motori complessi e altamente coordinati, come camminare e correre, dipende dall'attivazione ritmica dei circuiti spinali e sovraspinali. Dopo una lesione del midollo spinale toracico, la comunicazione con i circuiti a monte è compromessa. Questo, a sua volta, porta a una perdita di coordinazione, con un potenziale di recupero limitato. Quindi, per valutare meglio il grado di recupero dopo la somministrazione di farmaci o terapie, vi è la necessità di nuovi strumenti più dettagliati e accurati per quantificare l'andatura, la coordinazione degli arti e altri aspetti fini del comportamento locomotore in modelli animali di lesioni del midollo spinale. Diversi saggi sono stati sviluppati nel corso degli anni per valutare quantitativamente il comportamento di camminata libera nei roditori; Tuttavia, di solito mancano misurazioni dirette relative alle strategie di andatura, ai modelli di impronta e alla coordinazione. Per ovviare a queste carenze, viene fornita una versione aggiornata del MouseWalker, che combina una passerella di riflessione interna totale frustrata (fTIR) con un software di tracciamento e quantificazione. Questo sistema open-source è stato adattato per estrarre diversi output grafici e parametri cinematici, e una serie di strumenti di post-quantificazione può essere per analizzare i dati di output forniti. Questo manoscritto dimostra anche come questo metodo, unito a test comportamentali già stabiliti, descriva quantitativamente i deficit locomotori a seguito di lesioni del midollo spinale.
Introduction
L'efficace coordinazione di quattro arti non è esclusiva degli animali quadrupedi. La coordinazione degli arti anteriori-posteriori nell'uomo rimane importante per svolgere diversi compiti, come il nuoto e le alterazioni della velocità mentre si cammina1. Varie cinematiche degli arti2 e del programma motorio 1,3,4, così come i circuiti di feedback propriocettivo5, sono conservati tra l'uomo e altri mammiferi e dovrebbero essere considerati quando si analizzano le opzioni terapeutiche per i disturbi motori, come la lesione del midollo spinale (SCI)6,7,8.
Per camminare, diverse connessioni spinali dagli arti anteriori e posteriori devono essere correttamente cablate e attivate ritmicamente, il che richiede input dal cervello e feedback dal sistema somatosensoriale 2,9,10. Queste connessioni culminano nei generatori di pattern centrali (CPG), che si trovano a livello cervicale e lombare per gli arti anteriori e posteriori, rispettivamente 1,9,10. Spesso, dopo la SCI, l'interruzione della connettività neuronale e la formazione di una cicatrice gliale inibitoria12 limitano il recupero della funzione locomotoria, con esiti che variano dalla paralisi totale alla funzione ristretta di un gruppo di arti a seconda della gravità della lesione. Gli strumenti per quantificare con precisione la funzione locomotoria dopo SCI sono fondamentali per monitorare il recupero e valutare gli effetti dei trattamenti o di altri interventi clinici6.
Il test metrico standard per i modelli di contusione murina della SCI è la scala del topo Basso (BMS)13,14, un punteggio non parametrico che considera la stabilità del tronco, la posizione della coda, il passo plantare e la coordinazione degli arti anteriori-posteriori in un'arena di campo aperto. Anche se il BMS è estremamente affidabile per la maggior parte dei casi, richiede almeno due valutatori esperti per osservare tutti gli angoli del movimento animale al fine di tenere conto della variabilità naturale e ridurre i pregiudizi.
Sono stati sviluppati anche altri test per valutare quantitativamente le prestazioni motorie dopo SCI. Questi includono il test rotarod, che misura il tempo trascorso su un cilindro rotante15; la scala orizzontale, che misura il numero di ringhiere mancate e pinze positive16,17; e il beam walking test, che misura il tempo impiegato da un animale e il numero di fallimenti che fa quando attraversa una trave stretta18. Nonostante rifletta una combinazione di deficit motori, nessuno di questi test produce informazioni locomotorie dirette sulla coordinazione degli arti anteriori-posteriori.
Per analizzare in modo specifico e più approfondito il comportamento della camminata, sono stati sviluppati altri saggi per ricostruire i cicli di passi e le strategie di deambulazione. Un esempio è il test dell'impronta, in cui le zampe inchiostrate di un animale disegnano un motivo su un foglio di carta bianca19. Sebbene semplice nella sua esecuzione, estrarre parametri cinematici come la lunghezza del passo è ingombrante e impreciso. Inoltre, la mancanza di parametri dinamici, come la durata del ciclo di step o la coordinazione leg-timed, ne limita le applicazioni; In effetti, questi parametri dinamici possono essere acquisiti solo analizzando fotogramma per fotogramma video di roditori che camminano attraverso una superficie trasparente. Per gli studi SCI, i ricercatori hanno analizzato il comportamento a piedi da una vista laterale utilizzando un tapis roulant, compresa la ricostruzione del ciclo dei passi e la misurazione delle variazioni angolari di ciascuna articolazione della gamba 4,20,21. Anche se questo approccio può essere estremamente informativo6, rimane focalizzato su un insieme specifico di arti e manca di caratteristiche aggiuntive dell'andatura, come la coordinazione.
Per colmare queste lacune, Hamers e colleghi hanno sviluppato un test quantitativo basato su un sensore tattile ottico che utilizza la riflessione interna totale frustrata (fTIR)22. In questo metodo, la luce si propaga attraverso il vetro attraverso la riflessione interna, si disperde premendo la zampa e, infine, viene catturata da una telecamera ad alta velocità. Più recentemente, è stata resa disponibile una versione open source di questo metodo, chiamata MouseWalker, e questo approccio combina una passerella fTIR con un pacchetto software di tracciamento e quantificazione23. Utilizzando questo metodo, l'utente può estrarre un ampio set di parametri quantitativi, tra cui modelli di passo, spaziali e di andatura, posizionamento dell'impronta e coordinazione degli arti anteriori-posteriori, nonché output visivi, come i modelli di impronta (imitando il saggio della zampa inchiostrata6) o le fasi di posizione rispetto all'asse del corpo. È importante sottolineare che, a causa della sua natura open source, è possibile estrarre nuovi parametri aggiornando il pacchetto di script MATLAB.
Qui viene aggiornato l'assembly pubblicato in precedenza del sistema MouseWalker23 . Viene fornita una descrizione di come configurarlo, con tutti i passaggi necessari per ottenere la migliore qualità video, le condizioni di tracciamento e l'acquisizione dei parametri. Ulteriori strumenti di post-quantificazione sono inoltre condivisi per migliorare l'analisi del set di dati di output MouseWalker (MW). Infine, l'utilità di questo strumento è dimostrata ottenendo valori quantificabili per le prestazioni locomotorie generali, in particolare i cicli di step e la coordinazione arto anteriore-posteriore, in un contesto di lesione del midollo spinale (SCI).
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Protocol
Tutte le procedure di trattamento, chirurgiche e post-operatorie sono state approvate dal Comitato Interno Molecolare dell'Instituto de Medicina (ORBEA) e dal Comitato Portoghese di Etica degli Animali (DGAV) in conformità con le linee guida della Comunità Europea (Direttiva 2010/63/UE) e la legge portoghese sulla cura degli animali (DL 113/2013) con licenza 0421/000/000/2022. Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57Bl/6J di 9 settimane. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo il numero di animali e per ridurre la sofferenza degli animali utilizzati nello studio. Lo script MATLAB e la versione standalone del software MW sono open-source e sono disponibili su GitHub
repository (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Mentre il software MW è stato sviluppato in MATLAB R2012b, è stato adattato per funzionare in MATLAB R2022b. La Figura 1 illustra il flusso di lavoro di analisi del MW.
1. Configurazione dell'apparato MouseWalker (MW)
- Assemblare l'apparato MW come descritto in precedenza23, o adattarlo alle esigenze specifiche del progetto sperimentale (vedere la tabella dei materiali e la figura supplementare 1 per maggiori dettagli sulla configurazione).
NOTA: L'arena pedonale può essere allargata per ospitare animali più grandi, come i ratti. -
Verifica che il plexiglass dove camminano gli animali sia pulito e privo di graffi. Utilizzare un panno liscio e ridurre al minimo l'uso di solventi organici come ammoniaca o etanolo in alte concentrazioni, che possono danneggiare il plexiglass (si consiglia il 3% di perossido di idrogeno, il 7% di etanolo o qualsiasi disinfettante compatibile e appropriato per il plexiglass). Se necessario, sostituire il plexiglass.
- Impostare la fotocamera ad alta velocità con un obiettivo veloce e un'ampia apertura (ad esempio, valori F-stop più piccoli) per catturare una grande quantità di luce, in quanto ciò aiuta a registrare i segnali fTIR (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: l'obiettivo non deve generare distorsioni ottiche, in particolare ai bordi dell'immagine. Le distorsioni ottiche possono essere testate registrando un modello noto (ad esempio, strisce o quadrati) e quindi misurando la dimensione dei blocchi su ImageJ / FIJI24 (utilizzare lo strumento linea e quindi fare clic su Analizza > misura). Ad esempio, un quadrato di 1 cm dovrebbe avere le stesse dimensioni in pixel sia al centro dell'immagine che sui bordi. Le variazioni dovrebbero essere inferiori al 5%. - Illuminare la striscia luminosa LED multicolore dalla scatola luminosa di sfondo.
- Illuminare la striscia luminosa bianca a LED dalla scatola luminosa della passerella.
NOTA: Un LED colorato può anche essere utilizzato25 per facilitare la distinzione dell'impronta / corpo / sfondo. - Con le luci della stanza spente, verificare l'intensità luminosa della scatola luminosa di sfondo e della passerella. Regolare l'intensità, se necessario, utilizzando un potenziometro o una plastica semi-opaca. Questi devono essere ottimizzati in modo che l'intensità dei pixel aumenti nel seguente ordine: corpo dell'animale < sfondo < impronte.
- Per controllare l'intensità dei pixel del corpo / sfondo / impronte dell'animale, apri la sequenza di immagini su ImageJ / FIJI24 e fai clic su Analizza > misura. Il segnale di impronta non deve essere troppo saturo, in quanto ciò impedirà la definizione dei confini dell'impronta (cioè dita dei piedi e cuscinetti dei piedi) (Figura supplementare 2).
- Regolare il contrasto dell'immagine della passerella sul software di registrazione video. Il contrasto può essere regolato in due modi: attenuando o aumentando l'illuminazione sulla striscia LED o regolando l'apertura dell'obiettivo della fotocamera.
- Posizionare correttamente la lente alla stessa altezza e al centro dello specchio riflettente a 45° e perpendicolare (90°) alla passerella. Ciò genererà un'immagine costantemente proporzionale lungo la passerella sinistra-destra.
NOTA: evitare di modificare la posizione della videocamera (distanza, altezza e orientamento) tra le sessioni di registrazione multiple. Se necessario, contrassegnare il pavimento in cui posizionare il treppiede. Ciò manterrà le caratteristiche dell'immagine. - Focalizzare la lente sulla superficie del plexiglass. Questo può essere testato utilizzando un oggetto non dannoso che tocca la superficie del plexiglass.
NOTA: con valori di obiettivo F-stop più bassi, la profondità di campo si ridurrà, rendendo così più difficile la messa a fuoco. - Assicurati che tutte le impostazioni rimangano inalterate durante il test, poiché potrebbero modificare l'intensità dei pixel dei video registrati.
2. Acquisizione video
- Assicurarsi che i topi abbiano familiarità con la stanza e l'apparato prima del test. Risparmiare almeno 1 giorno per l'assuefazione (giorno 0). Per evitare un allenamento eccessivo, eseguire il test MW in un giorno diverso dagli altri test comportamentali (preferibilmente il giorno dopo).
- Nel software di registrazione video, assicurarsi che almeno 50 cm della passerella siano visibili.
- Regolare le impostazioni di registrazione per troncare la regione della passerella. Ciò ridurrà le dimensioni del video e ottimizzerà l'acquisizione video.
- Scatta una foto o un breve video di un righello normale prima di ogni sessione. Il numero di pixel per centimetro verrà successivamente utilizzato nella "finestra delle impostazioni" per calibrare i video.
- Inizia l'acquisizione video e posiziona l'animale sul bordo della passerella afferrando la base della coda per evitare lesioni. Assicurati che gli animali si muovano fino al bordo estremo della piattaforma. Esegui le registrazioni video con almeno 100 fotogrammi / s per garantire transizioni di andatura fluide.
- Se necessario, motivare gli animali a muoversi toccando delicatamente la parete della passerella o schioccando / battendo le dita. Tuttavia, evitare spintoni fisici, in quanto ciò potrebbe influire sui risultati.
- Salva i video direttamente come sequenze di immagini in formato TIFF (con compressione LZW), JPEG o PNG. Nel caso in cui la fotocamera registri come file MOV grezzo, convertire i video in sequenze di immagini aprendo il file in ImageJ / FIJI24 e facendo clic su File > Salva come sequenza >di immagini (o utilizzando un altro software, come LosslessCut25).
NOTA: la maggior parte degli animali inizia a camminare subito dopo essere stata messa nella passerella; Pertanto, si consiglia di avviare l'acquisizione video prima di posizionare l'animale.
3. Preparazione dei video per il software di tracciamento MW
- Filma abbastanza tirature complete di ogni singolo mouse. Il numero di animali da filmare per condizione e il numero di cicli completi devono essere decisi in base a ciascun disegno sperimentale. Una corsa completa è quando il mouse percorre l'intero 50 cm della passerella senza fermate prolungate (in questo esperimento, sono state selezionate tre corse complete).
NOTA: a seconda del software di acquisizione delle immagini, potrebbe essere necessario ritagliare i video in base al ROI più piccolo. Ciò aumenterà la velocità di tracciamento e generazione dell'output. - In ImageJ/FIJI24, selezionare i fotogrammi in cui il mouse è sullo schermo facendo clic su Image > Stack > Tools > Crea un substack. Il tracciamento sul MW richiede che la testa e la coda siano visibili in tutti i telai. È possibile, tuttavia, creare diversi substack da una singola registrazione video, che in seguito rappresenterà ogni esecuzione.
- Salva ogni substack separatamente in cartelle diverse facendo clic su File > Salva come sequenza >immagine. Il software MW crea automaticamente una sottocartella in ogni directory ogni volta che si inizia ad analizzare un'esecuzione.
4. Tracciamento
- Apri MATLAB, aggiungi la cartella contenente lo script MW alla directory di lavoro ed esegui "MouseWalker.m" sulla riga di comando principale.
NOTA: L'utilizzo del software MW in MATLAB consente di visualizzare i messaggi di errore di tracciamento sulla console principale di MATLAB e di selezionare i dati di output desiderati (aprendo il file di script principale "MouseEvaluate.m" e modificando gli output su 1 o 0: il file excel, i grafici dei passi, le tracce di posizione e i modelli di andatura). - Carica la cartella video come "Directory di input". Si può anche scegliere la cartella di output; tuttavia, questo non è un requisito in quanto il software MW crea automaticamente una nuova cartella chiamata "Risultati" all'interno della "Directory di input".
- Utilizzando le frecce "<<", "<", ">>" e ">" controlla se i fotogrammi video sono tutti caricati correttamente all'interno del software MW.
- Vai alla finestra "Impostazioni" dove si trovano tutti i parametri di calibrazione e soglia. Queste impostazioni possono variare a seconda dell'intensità dei pixel dello sfondo e delle impronte, nonché delle dimensioni minime del corpo e delle impronte, tra gli altri fattori (vedere l'esempio nella Figura supplementare 2). Prova l'effetto della modifica di alcuni parametri facendo clic sul pulsante Anteprima .
- Usa i diversi stili di trama, tra cui "corpo + piedi + coda", "solo corpo", "solo piedi" e "solo coda", per aiutare a discriminare le parti del corpo dopo aver regolato i parametri di soglia.
- Sfrutta gli strumenti sul pannello di destra per misurare la luminosità o le dimensioni (usando rispettivamente i pulsanti "luminosità" e "righello"). Tutte le impostazioni possono essere salvate come "predefinite" purché la distanza della fotocamera rimanga la stessa.
- Dopo aver regolato i parametri di soglia, verificare che il video sia pronto per il tracciamento automatico. Vai al primo fotogramma e fai clic su Auto per avviare il monitoraggio. Questo passaggio può essere seguito in tempo reale e richiede alcuni minuti, a seconda delle dimensioni del video e delle prestazioni del computer.
- Se il rilevamento automatico etichetta erroneamente le caratteristiche del corpo, annulla il rilevamento automatico, inserisci nuove impostazioni e riavvia il processo.
- Una volta completato il monitoraggio, controlla se è necessaria una correzione manuale. Per correggere, utilizzare il pannello centrale per selezionare o deselezionare e indicare la posizione delle impronte della zampa anteriore destra (RF), posteriore destra (RH), anteriore sinistra (LF) e posteriore sinistra (LH), testa, naso, corpo (diviso in due segmenti) e posizioni della coda (divisa in quattro segmenti). Salvare le modifiche premendo il pulsante Salva .
NOTA: tutti i pulsanti e la maggior parte dei comandi hanno una scorciatoia da tasto (controllare il manuale associato per i dettagli23). Per facilitare lo scorrimento video e l'esecuzione di scorciatoie da tastiera, è possibile utilizzare un controller hardware con pulsanti programmabili e una rotella navetta come il Contour ShuttlePro V2. - Fare clic su Valuta per generare i file di output dal video tracciato. A seconda dell'output desiderato selezionato (vedere il passaggio 4.1), questo passaggio può richiedere alcuni minuti.
- Verificare che tutti i grafici dei dati di output siano salvati nella cartella "Risultati". Verificare l'accuratezza del tracking esaminando alcune delle uscite grafiche, come le "Stance traces", dove è possibile verificare se tutte le posizioni delle zampe sono coerenti.
- Se viene identificato un errore, correggere manualmente il rilevamento (se possibile; altrimenti, eliminare la cartella "Risultati" ed eseguire nuovamente il rilevamento automatico con nuove impostazioni) e fare nuovamente clic sul comando Valuta .
- Verificare che tutte le misure quantitative generate dal software MW siano salvate su un foglio di calcolo Excel e riassunte su "1. Info_Sheet". Verificare che le opzioni di Excel per le delimitazioni delle formule corrispondano allo script. Il separatore decimale deve essere "," e i separatori delle migliaia devono essere ";".
- Utilizzare lo script "MouseMultiEvaluate.m" per riunire le misurazioni di tutte le esecuzioni in un nuovo file per l'analisi.
- Per iniziare, genera un file .txt contenente i percorsi delle cartelle per tutti i video (ad esempio "Videofile.txt"). Assicurati che ogni riga corrisponda a un singolo video.
- Quindi, scrivi "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" nella riga di comando. Un file excel denominato "ResultSummary.xls" verrà generato nella directory di lavoro (vedere un esempio nel repository GitHub).
NOTA: La Figura 2 rappresenta le uscite grafiche ottenute dal software MW dai video di un animale registrato.
5. Flusso di lavoro di analisi cinematica dei dati
- Modificare il foglio Excel generato nel passaggio 4.10, che contiene i dati per l'elaborazione utilizzando gli script Python forniti, in base ai seguenti prerequisiti.
- Nell'intestazione della prima colonna specificare la condizione sperimentale. Assegnare un nome a ogni riga dopo il nome del gruppo/condizione (gli individui degli stessi gruppi devono avere lo stesso nome). Il primo gruppo deve essere il controllo o la linea di base (questo è obbligatorio solo per il plotting della mappa di calore, passaggio 5.6).
- Nella seconda colonna, specificare l'ID animale. Questo è obbligatorio, anche se queste informazioni non verranno utilizzate per la generazione della trama.
- Dalla terza colonna in poi, scegliere i parametri del motore che verranno utilizzati per l'analisi. Assicurarsi che la prima riga sia il nome del parametro (questi nomi appariranno in seguito nei grafici).
- Apri Anaconda Navigator ed esegui Spyder per aprire gli script Python forniti.
NOTA: Tutti gli script sono stati sviluppati con Python 3.9.13, sono stati eseguiti con Spyder 5.2.2 in Anaconda Navigator 2.1.4 e sono disponibili nella tabella dei materiali e nel repository GitHub (dove sono inclusi materiali aggiuntivi, come un esempio video, un file di esempio excel e un documento FAQ). È possibile eseguire gli script al di fuori di Anaconda Navigator; Tuttavia, questa interfaccia utente grafica è più user-friendly. - Utilizzare il "Rawdata_PlotGenerator.py" per generare i grafici di dati non elaborati. Ciò consentirà la visualizzazione di ogni parametro in funzione della velocità.
- Apri "Rawdata_PlotGenerator.py" in Spyder ed esegui il codice facendo clic sul pulsante Riproduci .
- Selezionare il file Excel da analizzare e il nome del foglio nella finestra automatica. Se il nome del foglio non è stato modificato, scrivere "Foglio1".
- I grafici dei dati grezzi appariranno nella console di stampa (pannello in alto a destra). Per salvare i grafici, fare clic sul pulsante Salva immagine o Salva tutte le immagini nella console di stampa.
- Utilizzare lo script "Residuals_DataAnalysis" per calcolare i residui per l'analisi dei dati. Questo script genererà un file CSV con i calcoli dei residui per tutti i parametri del motore.
NOTA: Molti dei parametri di andatura misurati estratti dal MW variano con la velocità (ad esempio, velocità di oscillazione, lunghezza del passo, durata della posizione, rettilineità della posizione e indici di andatura). Pertanto, si consiglia di eseguire un modello di regressione ottimale di ogni singolo parametro rispetto alla velocità per l'esperimento di base e quindi di determinare i valori residui per ciascun gruppo sperimentale in relazione a questo modello di regressione. I dati sono quindi espressi come differenza dalla linea normalizzata residua26.- Apri "Residuals_DataAnalysis.py" in Spyder ed esegui il codice facendo clic sul pulsante Riproduci .
- Selezionare il file Excel da analizzare e il nome del foglio nella finestra automatica. Se il nome del foglio non è stato modificato, scrivere "Foglio1".
- Salvare il file CSV nella stessa cartella dei dati. È obbligatorio che il controllo (o baseline) sia il primo gruppo nel file Excel.
- Utilizzare lo script "PCA_PlotGenerator.py" per eseguire un'analisi dei componenti principali (PCA).
NOTA: Questo metodo di riduzione della dimensionalità non supervisionato viene utilizzato per generare una rappresentazione più succintadi 27,28,29 dei dati (Figura 3A, B). Lo script PCA include i passaggi seguenti. I dati vengono prima pre-elaborati mediante centraggio e scalamento, dopodiché l'algoritmo PCA calcola la matrice di covarianza per determinare le correlazioni tra le variabili e calcolare gli autovettori e gli autovalori della matrice di covarianza per identificare i componenti principali. I primi due o tre componenti principali sono scelti per la rappresentazione dei dati in grafici 2D o 3D, rispettivamente. Ogni punto nei grafici corrisponde a un animale e rappresenta una variabile astratta diversa. I punti codificati a colori vengono utilizzati per distinguere i gruppi specifici. Come tale, gruppi di punti riflettono modelli di camminata simili condivisi dagli individui corrispondenti.- Apri "PCA_PlotGenerator.py" in Spyder ed esegui il codice facendo clic sul pulsante Riproduci .
- Selezionare il file Excel da analizzare e il nome del foglio nella finestra automatica. Se il nome del foglio non è stato modificato, scrivere "Foglio1".
- Assicuratevi che i grafici PCA 2D e 3D vengano visualizzati nella console di stampa (pannello in alto a destra). Ogni colore rappresenta un gruppo diverso e la legenda viene visualizzata accanto alla trama. Per salvare la trama, fare clic su Salva immagine nella console di stampa.
- Usa "Heatmap_PlotGenerator.py" per generare una mappa di calore. Assicurarsi che il generatore di mappe di calore crei una tabella che mostri le differenze statistiche tra il gruppo di base (o gruppo di controllo) e gli altri gruppi per ciascun parametro motore27 (Figura 4). Ogni colonna rappresenta un gruppo e ogni linea si riferisce a un parametro motore specifico.
NOTA: L'analisi statistica è stata condotta con un ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Tukey (per le distribuzioni normali) o da un ANOVA di Kruskal-Wallis seguito dal test post hoc di Dunn (per le distribuzioni non normali). I valori anomali sono stati esclusi dall'analisi. I valori P sono rappresentati da un codice colore, con sfumature rosse e blu che indicano rispettivamente un aumento o una diminuzione rispetto al controllo (o linea di base). La tonalità di colore rappresenta la significatività statistica, con i colori più scuri che mostrano una significatività più elevata e i colori più chiari che mostrano una significatività inferiore. corrisponde a P < 0,001; ** corrisponde a P < 0,01; e * corrisponde a P < 0,05. Il bianco non indica alcuna variazione.- Apri "Heatmap_PlotGenerator.py" in Spyder ed esegui il codice facendo clic sul pulsante Riproduci .
- Selezionare il file Excel da analizzare e il nome del foglio nella finestra automatica. Se il nome del foglio non è stato modificato, scrivere "Foglio1".
- Selezionare il tipo di dati nella seconda finestra automatica: dati grezzi o dati residui. Se un'opzione non è selezionata, i dati residui sono l'impostazione predefinita.
- La mappa di calore verrà visualizzata nella console di stampa (pannello in alto a destra). Per salvare la trama, fare clic su Salva immagine nella console di stampa.
Nota : è obbligatorio che il controllo (o linea di base) è il primo gruppo nel file di Excel.
- Utilizzare "Boxplots_PlotGenerator.py" per generare i boxplot. Questo strumento consentirà la generazione di boxplot che rappresentano la distribuzione dei valori per tutti i parametri del motore per ciascun gruppo (Figura 5, Figura 6 e Figura 7).
Nota : ogni casella contiene la mediana come linea mediana e i bordi inferiore e superiore delle caselle rappresentano rispettivamente i quartili 25% e 75%. I baffi rappresentano l'intervallo dell'intero set di dati, esclusi i valori anomali. I valori anomali sono definiti come qualsiasi valore pari a 1,5 volte l'intervallo interquartile inferiore o superiore rispettivamente al quartile del 25% e del 75%.- Apri "Boxplots_PlotGenerator.py" in Spyder ed esegui il codice facendo clic sul pulsante Riproduci .
- Selezionare il file Excel da analizzare e il nome del foglio nella finestra automatica. Se il nome del foglio non è stato modificato, scrivere "Foglio1".
- Selezionare il tipo di dati nella seconda finestra automatica: dati grezzi o dati residui. Se un'opzione non è selezionata, i dati residui sono l'impostazione predefinita.
- I boxplot appariranno nella console di stampa (pannello in alto a destra). Per salvare i grafici, fare clic sul pulsante Salva immagine o Salva tutte le immagini nella console di stampa.
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Representative Results
Il sistema BMS standard descrive i deficit motori lordi dopo SCI14. A causa della sua natura soggettiva, altri saggi quantitativi vengono generalmente eseguiti insieme al BMS per produrre una valutazione più dettagliata e fine della locomozione. Tuttavia, questi test non riescono a mostrare informazioni specifiche sui cicli di passi, sui modelli di passo e sulla coordinazione degli arti anteriori-posteriori, che è estremamente importante per capire come i circuiti spinali mantengono la funzione e si adattano a una SCI incompleta. Questa sezione mostra come il toolbox MW può aiutare a monitorare il recupero della funzione locomotoria dopo SCI e aggiungere informazioni rilevanti sul comportamento a piedi.
Il campione di studio è stato diviso in due gruppi di topi femmina C57Bl/6J di età compresa tra 9 settimane: un gruppo sperimentale SCI (n = 11), in cui gli animali sono stati sottoposti a laminectomia seguita da una lesione da contusione da moderata a grave a livello della colonna vertebrale T9 / T10 utilizzando un Infinite Horizon Impactor (vedi Tabella dei materiali); e un gruppo di controllo finto-ferito (n = 10), in cui solo la laminectomia è stata eseguita allo stesso livello di colonna (Figura 1, fase 1). Il comportamento locomotore della SCI e degli animali finti è stato monitorato per 30 giorni. Il test MW è stato eseguito il giorno di assuefazione prima dell'intervento chirurgico (basale) e 15 giorni, 22 giorni e 30 giorni dopo l'infortunio (dpi) (Figura 1, fase 2). Per motivi di confronto, i topi sono stati sottoposti al test BMS in parallelo prima dell'intervento chirurgico e a 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi e 30 dpi (Figura supplementare 3). Dopo aver tracciato tutti i video ottenuti con il MW, sono stati quindi generati due tipi di file di output: output grafici, che mostrano rappresentazioni visive di diversi parametri dopo ogni esecuzione, e uscite cinematiche, che riassumono tutti i parametri motori misurabili (Figura 1, passo 3 e passo 4).
Di conseguenza, utilizzando un set di script Python (vedere Tabella dei materiali e il collegamento al repository GitHub), sono stati ottenuti i grafici dei dati grezzi (Figura 1, passaggio 5). Poiché la maggior parte dei parametri è influenzata dalla velocità dell'animale, è stato eseguito un modello di regressione del gruppo basale prima della lesione insieme ai valori residui misurati per ciascuna condizione (Figura 1, fase 6). Per verificare i profili cinematici e le differenze significative tra il gruppo di controllo (sham) e quello sperimentale (SCI), tutti i parametri cinematici (totale di 79) sono stati sottoposti a un'analisi delle componenti principali (PCA) a tre ordini ed è stata generata una mappa di calore con una raccolta di parametri motori che meglio descrivono il set di dati (totale di 33) (Figura 1, fase 7a, b). Infine, i parametri motori specifici che sono stati influenzati dopo la SCI sono stati confrontati con la linea di base prima della lesione (Figura 1, Fase 7c).
Figura 1: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro di analisi del MW. (1) Gli animali sono selezionati per laminectomia (gruppo di controllo fittizio) o laminectomia seguita da una lesione del midollo spinale (gruppo sperimentale). (2) Gli animali sono quindi sottoposti a un test comportamentale il giorno prima della lesione e nei giorni 15, 22 e 30 dopo l'infortunio. (3) Il MW genera due tipi di dati di output: (a) visualizzazioni grafiche di diversi parametri, come tracce di posizione, andatura e schemi di passo, e (b) un riepilogo cinematico di tutti i parametri motori misurabili. (4) Tutti i dati di controllo e sperimentali sono riuniti in un unico file utilizzando lo script "MouseMultiEvaluate.m" su MATLAB. (5) Lo script "RawData_PlotGenerator" per Python genera una rappresentazione visiva di come tutti i parametri misurabili del motore variano in base alla velocità. Se i parametri non sono correlati alla velocità, si potrebbe saltare a (7); tuttavia, poiché la maggior parte dei parametri dopo SCI dipende fortemente dalla velocità, un modello dovrebbe essere generato (6) usando lo script "Residual_DataAnalysis" per Python. Dopo aver generato i valori residui per ciascun parametro motore, viene effettuata l'analisi dei dati (7): (a) viene eseguita un'analisi della componente principale (PCA) utilizzando una selezione di parametri con uno script "PCA_PlotGenerator"; (b) viene creata una mappa di calore con uno script "Heatmap_PlotGenerator", per mostrare le differenze statisticamente significative tra le condizioni per diversi parametri; e c) diversi parametri individuali che vengono modificati dopo che SCI sono stati valutati con lo script "BoxPlot_PlotGenerator". Tutti gli script sono disponibili nel collegamento Tabella dei materiali e repository GitHub. Gli script sono mostrati in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Dai dati grafici raccolti dal MW, è stato possibile confermare il noto brusco cambiamento nella visualizzazione visiva delle impronte dopo SCI. Nel saggio "Digital-ink" generato dal MW, è stata rilevata la mancanza di supporto delle zampe posteriori (Figura 2A), insieme a una diminuzione dell'area di impronta sia per le zampe posteriori sinistra che destra (Figura 2B), che è stata mantenuta da 15 dpi in poi (dati non mostrati). Inoltre, all'interno di ogni ciclo di step, il MW calcola i parametri relativi alla fase di posizione (cioè il tempo tra il touchdown della zampa e prima del decollo) e la fase di oscillazione (cioè il tempo in cui l'arto è fuori terra). Come tale, il MW può generare "tracce di posizione" visive, che prendono in considerazione la posizione del centro e dell'asse del corpo in relazione a ciascuna gamba e il loro centro di impronta durante le fasi di posizione23. Le tracce di posizione generale ottenute per ciascun animale hanno mostrato diverse caratteristiche uniche (Figura 2C). Questi dati hanno mostrato che dopo SCI, le zampe posteriori avevano tracce di posizione più corte e un posizionamento della zampa più casuale sia al touchdown che al decollo da 15 dpi in poi (Figura 2C).
Figura 2: Output grafici rappresentativi ottenuti dal software MW dai video di tracciamento. (A) Stampe a "inchiostro digitale" per un animale SCI che mostrano ogni zampa con un colore diverso: rosso (anteriore destro), giallo (anteriore sinistro), verde (posteriore destro) e blu (posteriore sinistro) in diversi punti temporali. (B) Impronte per la parte anteriore sinistra (LF), posteriore sinistra (LH), anteriore destra (RF) e posteriore destra (RH) di un animale SIC a 15 dpi. (C) "Tracce di posizione" per un animale SIC in diversi momenti. L'AEP e il PEP per una delle tappe sono illustrati nel primo pannello. Il "clustering dell'impronta" sia per l'AEP che per il PEP corrisponde alla deviazione standard delle coordinate medie AEP o PEP in ciascun video. Abbreviazioni: dpi = giorni post-infortunio; cm = centimetro; px = pixel. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Successivamente, le uscite cinematiche sono state analizzate dopo essere state calcolate dal MW (Figura 3 e Figura 4). Per ottenere una rappresentazione più concisa del set di dati e verificare se i parametri cinematici ottenuti dal MW fossero sufficienti per rappresentare i deficit locomotori riscontrati negli animali SCI nel tempo, è stato eseguito un PCA27. Evidentemente, il 40% della varianza nei dati potrebbe essere spiegato nel primo componente (PC1: 40,1%), che ha separato il gruppo di animali che avevano una SCI dal resto, con un valore p inferiore a 0,001 basato su un test ANOVA unidirezionale (Figura 3A, B) in tutti i punti temporali (15 dpi, 22 dpi e 30 dpi). C'è stato anche uno scarso contributo da parte delle altre componenti (PC2: 11% e PC3: 8,6%). Il peso assegnato a ciascun contributo dei parametri del motore per ciascun componente è illustrato nella figura supplementare 4. Inoltre, la varianza nel set di dati non era sufficiente a riflettere le differenze nel tempo (cioè tra 15 dpi, 22 dpi e 30 dpi), che replica il plateau precedentemente descritto di recupero locomotore14. Complessivamente, questi risultati indicano che i parametri cinematici ottenuti dal MW descrivono fortemente i deficit motori osservati dopo SCI in tutti i punti temporali.
Figura 3: Analisi delle componenti principali di tutti i parametri cinematici del motore (79) ottenuti dal software MW dopo l'analisi dei dati residui. (A) Una visualizzazione 3D dell'analisi PCA a tre componenti. (B) Una visualizzazione 2D con cerchi che rappresentano il 50% dei dati raccolti. Nel PC1, che spiegava oltre il 40% della varianza, il gruppo SCI a 15 dpi, 22 dpi e 30 dpi era significativamente diverso dal gruppo fittizio e dal basale (prima dell'infortunio), con un valore p < 0,001, come determinato da un ANOVA unidirezionale. Ogni singolo piccolo punto o triangolo rappresenta la media di tre video per ogni animale, mentre i punti o triangoli più grandi rappresentano il punto medio (n = 10-11 per condizione, n = 21 per il gruppo basale). Il contributo di ciascun componente è indicato in ciascun asse. Abbreviazioni: dpi = giorni post-infortunio; SCI = lesione del midollo spinale; PC = componente principale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Quindi, è stata selezionata una raccolta di parametri motori in base alla forza con cui ha descritto il set di dati (33 in totale) ed è stata generata una mappa di calore (Figura 4). In effetti, la maggior parte dei parametri locomotori ha mostrato un drastico cambiamento dopo SCI in tutti i punti temporali (15 dpi, 22 dpi e 30 dpi), mentre i controlli finti hanno mostrato solo cambiamenti significativi a 30 dpi. Questi cambiamenti nel gruppo fittizio potrebbero essere spiegati da una diminuzione complessiva della velocità di oscillazione, probabilmente dovuta all'abitudine al test, che verrà discussa più avanti.
Era evidente che gli animali SCI camminavano più lentamente dei controlli finti feriti (dati non mostrati). Tuttavia, indipendentemente dalla velocità, sia a 15 dpi che a 30 dpi, gli animali SCI hanno mostrato una durata di oscillazione più elevata, una durata della posizione inferiore e un indice del fattore di servizio inferiore, che si riferisce alla durata della posizione/periodo di passo23. Questi risultati indicano che le alterazioni nel posizionamento delle gambe sopra descritte sono caratteristiche della SCI, come si vede in altri modelli animali30,31,32, e non sono correlate alle alterazioni del ritmo (Figura 4).
Va anche detto che la sincronia sinistra e destra non è stata influenzata, in quanto non è stata osservata una variazione significativa negli indici di "fase" per gli arti anteriori e posteriori10,23 (Figura 4), indicando un accoppiamento intatto tra gli arti sinistro e destro.
Inoltre, i topi SCI hanno mostrato un indice di "rettilineità della posizione" inferiore (spostamento / lunghezza del percorso) sia negli arti anteriori che negli arti posteriori (Figura 4). Questo parametro misura quanto siano lineari le tracce in relazione alla condizione ideale, che sarebbe una linea retta (che va da 0 a 1, indicando una traccia lineare)27. Pertanto, questi risultati indicano una forte incapacità di camminare dritto in questo gruppo.
Per ogni fase di posizione, il MW disegna una ricostruzione delle oscillazioni del corpo, iniziando dal touchdown della zampa - la posizione estrema anteriore, o AEP - e terminando prima del decollo - la posizione estrema posteriore, o PEP (vedi l'esempio in Figura 2C). Il "clustering dell'impronta" sia dell'AEP che del PEP misura la deviazione standard delle coordinate medie AEP o PEP in ciascun video. Gli animali SCI hanno mostrato un aumento del raggruppamento dell'impronta posteriore per l'AEP in tutti i punti temporali e un effetto significativo è stato osservato solo per il gruppo finto-ferito a 15 dpi (Figura 4). Ciò dimostra che gli animali SCI non potevano posizionare correttamente gli arti posteriori al momento dell'atterraggio dopo lo swing. Inoltre, è stata osservata una diminuzione del "clustering dell'impronta" della zampa anteriore per il PEP, insieme a una diminuzione del clustering dell'impronta della zampa posteriore per il PEP, a 30 dpi (Figura 4). Questi risultati sono in accordo con quanto osservato nelle "tracce di posizione" disegnate e suggeriscono che la posizione delle zampe anteriori diventa più limitata dopo l'infortunio.
Infine, e in accordo con le alterazioni nel posizionamento delle zampe, ci sono state alterazioni nelle strategie di andatura e nella "pressione" suscitata dalle zampe, misurata dalla luminosità media sull'area (Figura 4), che sarà ulteriormente discussa.
Figura 4: Grafico della mappa di calore che mostra una raccolta dei parametri locomotori significativamente alterati confrontando gli animali SCI e gli animali finti feriti rispetto al giorno precedente l'intervento, come ottenuto dal MW dopo l'analisi dei dati residui. n = 10-11 per condizione; Il gruppo basale comprende tutti gli animali il giorno prima dell'intervento, n = 21. I dati sono espressi dal valore p dopo analisi statistica con un ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Tukey (per le distribuzioni normali) o dal test post hoc di Dunn (per le distribuzioni non normali). I valori P sono rappresentati da un codice colore, con sfumature rosse e blu che indicano rispettivamente una diminuzione o un aumento rispetto alla linea di base. La tonalità di colore rappresenta la significatività statistica, con colori più scuri che indicano una significatività più elevata e colori più chiari che indicano una significatività inferiore; P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05. Il bianco non indica alcuna variazione. Abbreviazioni: dpi = giorni post-infortunio; SCI = lesione del midollo spinale; s = secondo; ms = millisecondo; media = media; F = anteriore; H = posteriore; AEP = posizione estrema anteriore; PEP = posizione estrema posteriore; LF = anteriore sinistra; LH = posteriore sinistro; RF = anteriore destra; RH = posteriore destro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Successivamente, abbiamo cercato di capire quali singoli parametri sarebbero i migliori per descrivere i deficit locomotori degli animali SCI nelle diverse fasi della lesione (cioè 15 dpi, 22 dpi e 30 dpi). Abbiamo iniziato esaminando i parametri del ciclo di passi che mostravano differenze tra gli arti anteriori e posteriori mentre gli arti posteriori progredivano dalla paralisi totale alla funzione parziale (Figura 5). Mentre la velocità media di oscillazione è aumentata significativamente per gli arti anteriori rispetto al basale (prima dell'infortunio), la velocità di oscillazione degli arti posteriori non è cambiata in modo significativo (sebbene vi fosse una tendenza ad essere inferiore alla linea di base) (Figura 5A,B). In parallelo, la lunghezza media del passo degli arti anteriori è diminuita, senza cambiamenti significativi per gli arti posteriori (Figura 5C, D). Non sorprende che i topi feriti abbiano mostrato una diminuzione della durata dell'oscillazione degli arti anteriori e un aumento inverso della durata delle oscillazioni degli arti posteriori a 15 dpi in poi (Figura 5E, F). Presi insieme, questi risultati indicano che gli arti anteriori hanno adottato un ritmo più veloce, con due cicli degli arti anteriori per ciascun ciclo degli arti posteriori. Questo rapporto del ciclo 2:1 è stato descritto in precedenza dopo l'emisezione SCI nei ratti 1,33 e illustra un aspetto chiave della coordinazione difettosa degli arti anteriori-posteriori, che non viene recuperata dopo 30 dpi nei topi.
Figura 5: Parametri del ciclo di passi per le zampe anteriori e posteriori in diversi punti temporali 1 giorno prima della lesione e a 15 dpi, 22 dpi e 30 dpi negli animali SCI (n = 11). (A,B) La velocità media di oscillazione delle zampe anteriori e posteriori rispetto alla linea di base. (C,D) La lunghezza media del passo delle zampe anteriori e posteriori rispetto alla linea di base. (E,F) La durata media dell'oscillazione per le zampe anteriori e posteriori rispetto alla linea di base. Nei boxplot, la mediana è rappresentata dalla linea mediana e i bordi inferiore e superiore delle caselle rappresentano rispettivamente i quartili del 25% e del 75%; I baffi rappresentano l'intervallo dell'intero set di dati. I valori anomali sono rappresentati da singoli punti. L'analisi statistica è stata condotta con un ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Tukey (per le distribuzioni normali) o dal test post hoc di Dunn (per le distribuzioni non normali). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001. Abbreviazioni: dpi = giorni post-infortunio; SCI = lesione del midollo spinale; cm = centimetro; s = secondo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Il software MW è anche in grado di calcolare i modelli di passo dei topi misurando la frazione di fotogrammi assegnati a una specifica combinazione di gambe, e questo funziona come proxy per la presenza di specifiche strategie di andatura. A velocità più basse, i topi illesi tendono ad adottare una "andatura ambulante", in cui la maggior parte dei fotogrammi ha un'oscillazione a gamba singola (indipendentemente dalla posizione della zampa). A velocità intermedie, più comuni sulla pista, i topi passano a un'andatura al trotto, in cui la configurazione più rappresentativa è l'oscillazione diagonale delle gambe. Infine, a velocità più elevate, i topi usano una "andatura al galoppo", con tre zampe che oscillano contemporaneamente23,34. Altre configurazioni meno comuni includono l'andatura di passo, per lo più rappresentata dall'oscillazione laterale della gamba (entrambe le gambe sinistra o destra), e l'"andatura legata / saltellante", con entrambi gli arti posteriori o anteriori che oscillano simultaneamente10. Tuttavia, si dovrebbe tenere presente che, nel contesto di una SCI, alcune di queste configurazioni, come l'oscillazione a tre gambe, possono riflettere un posizionamento difettoso della zampa posteriore e, quindi, non corrispondono esattamente a una specifica strategia di andatura - in questo caso, il galoppo. Pertanto, l'analisi è stata semplificata confrontando solo le configurazioni delle gambe.
Dopo aver eseguito l'analisi residua, è stato notato che c'era una diminuzione della prevalenza di oscillazioni diagonali accompagnata da una diminuzione delle oscillazioni singole in tutti i punti temporali (Figura 6A, B). Ancora più interessante, c'è stato un aumento della prevalenza di oscillazioni laterali (Figura 6C). L'andatura simile al ritmo non è tipica per un normale mouse C57BL/6J; tuttavia, è già stato riportato che si verifica dopo l'emisezione SCI nei ratti1. Questo modello in fase non era abbastanza prevalente da modificare l'indice di fase dell'arto anteriore o dell'arto posteriore (come mostrato nella Figura 3), ma illustra il feedback spinale difettoso dagli arti posteriori agli arti anteriori. Inoltre, c'è stato un aumento naturale della prevalenza delle oscillazioni degli arti anteriori / posteriori (Figura 6D), probabilmente a causa di un errato passo plantare degli arti posteriori e un aumento delle oscillazioni a tre gambe (Figura 6E).
Figura 6: Gli indici medi per le diverse configurazioni di oscillazione a gradini. (A) Diagonale, (B) singolo, (C) laterale, (D) anteriore/posteriore e (E) oscillazione a tre zampe in diversi punti temporali negli animali SCI (n = 11). Nei boxplot, la mediana è rappresentata dalla linea mediana e i bordi inferiore e superiore delle caselle rappresentano rispettivamente i quartili del 25% e del 75%; I baffi rappresentano l'intervallo dell'intero set di dati. I valori anomali sono rappresentati da singoli punti. L'analisi statistica è stata eseguita con un ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Tukey (per le distribuzioni normali) o dal test post hoc di Dunn (per le distribuzioni non normali). **P < 0,01; P < 0,001. Abbreviazioni: dpi = giorni post-infortunio; SCI = lesione del midollo spinale; NA = non applicabile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Infine, un'altra lettura che può essere estratta dal MW è la "pressione" come misura di luminosità / area. Con velocità più elevate, l'area di contatto con il terreno diminuisce e la pressione aumenta, quindi è stata eseguita una regressione lineare dei dati di base e sono stati misurati i valori residui per ciascuna condizione. È stato notato che la pressione sulle zampe anteriori aumentava significativamente in tutti i punti temporali, ma la forza di questo effetto tendeva a diminuire nel tempo, poiché la variazione per la zampa anteriore sinistra aveva già perso significatività statistica a 30 dpi (Figura 7A,C). Questo effetto specifico sul lato sinistro potrebbe essere spiegato da una lesione lateralizzata, che avrebbe potuto interessare preferenzialmente il lato destro del midollo spinale in questo studio. Tuttavia, la pressione esercitata dalle zampe posteriori è diminuita nei topi feriti, come previsto, in tutti i punti temporali, senza alcuna tendenza ad un aumento (Figura 7B, D).
Figura 7: Pressione esercitata dalle zampe posteriori e anteriori in diversi punti temporali negli animali SCI (n = 11). Pressione esercitata dalla zampa anteriore sinistra (A), dalla zampa posteriore sinistra, dalla zampa anteriore destra e dalla zampa posteriore destra (D) mostrata come differenze relative rispetto al basale (il giorno prima dell'infortunio). Nei boxplot, la mediana è rappresentata come la linea mediana e i bordi inferiore e superiore delle caselle rappresentano rispettivamente il 25% e il 75% dei quartili; I baffi rappresentano l'intervallo dell'intero set di dati. I valori anomali sono rappresentati da singoli punti. L'analisi statistica è stata eseguita con un ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Tukey (per le distribuzioni normali) o dal test post hoc di Dunn (per le distribuzioni non normali). **P < 0,01; P < 0,001. Abbreviazioni: dpi = giorni post-infortunio; SCI = lesione del midollo spinale; cm = centimetro; px = pixel. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Nel complesso, questo studio illustra la potenza del sistema MW per descrivere quantitativamente le menomazioni motorie causate da SCI che a volte possono essere ignorate a causa di altre limitazioni di test. Inoltre, sottolinea il recupero funzionale indubbiamente limitato nel tempo nel modello murino di contusione di SCI.
Figura supplementare 1: I componenti hardware MW. (A) Questa configurazione è suddivisa come segue: I - passerella fTIR; II - base e posti di appoggio fTIR; III - parete della passerella; IV - 45° specchio; e V - retroilluminazione di sfondo. (B) Immagini ravvicinate del canale Base-U e delle linee laterali della passerella. (C) Progettazione della parete della passerella. (D) Immagine ravvicinata della configurazione dello specchio a 45°. Abbreviazione: cm = centimetro. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Un singolo fotogramma di un video fTIR in cui sono indicate l'intensità dei pixel e le aree regionali. Le intensità dei pixel per il corpo, lo sfondo e le impronte utilizzate per l'analisi video in questo studio sono presentate tra parentesi e indicate in rosso, tutte ottimizzate per la chiarezza dell'immagine. L'intensità luminosa dovrebbe essere regolata per ottenere un'adeguata discriminazione tra le diverse regioni. Le aree relative del corpo e le impronte sono indicate da linee gialle tratteggiate. Sia le aree che l'intensità dei pixel sono state acquisite in ImageJ/FIJI. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: (A) punteggio totale BMS e (B) sottopunteggio dei topi analizzati in questo studio (n = 10-11). Tutti i dati sono stati espressi come media ± SEM. L'analisi statistica è stata eseguita con una doppia misura ripetuta ANOVA seguita dal test post hoc di Bonferroni; P < 0,001. Abbreviazione: BMS = Basso mouse scale. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 4: Il peso assegnato a ciascun contributo dei parametri del motore per ciascun componente. Il peso assegnato a ciascun parametro motore (79 in totale) dopo l'analisi residua per (A) PC1, (B) PC2 e (C) PC3 nel PCA. La linea di taglio è stata tracciata a 0,04 ms e -0,04. Abbreviazioni: ms = millisecondo; media = media; SD = deviazione standard; F = anteriore; H = posteriore; AEP = posizione estrema anteriore; PEP = posizione estrema posteriore; LF = anteriore sinistra; LH = posteriore sinistro; RF = anteriore destra; RH = posteriore destro; Premere = pressione. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Qui, il potenziale del metodo MouseWalker è dimostrato analizzando il comportamento locomotore dopo SCI. Fornisce nuove informazioni su specifiche alterazioni nei modelli di passo, impronta e andatura che altrimenti sarebbero sfuggite ad altri test standard. Oltre a fornire una versione aggiornata del pacchetto MW, gli strumenti di analisi dei dati sono descritti anche utilizzando gli script Python forniti (vedere il passaggio 5).
Poiché il MW genera un ampio set di dati e una raccolta di parametri cinematici che riflettono un processo locomotore altamente dimensionale, è stato impiegato un PCA; infatti, la PCA è stata ampiamente utilizzata in altri set di dati cinematici simili a questo 27,35,36 (Figura 3). Questa tecnica di riduzione della dimensionalità è un metodo semplice e robusto con assunzioni minime che consente di identificare quantitativamente i profili cinematici e distinguerli rapidamente dalle condizioni di controllo o di base. Inoltre, sono state generate mappe di calore per identificare tempestivamente i parametri statisticamente diversi dalla linea di base (Figura 4), che potrebbero essere successivamente analizzati individualmente (Figura 5, Figura 6 e Figura 7).
Successivamente, è stato dimostrato come parametri specifici che possono essere estratti dal MW illustrano i robusti deficit locomotori osservati negli animali SCI, come la coordinazione. La coordinazione è la capacità di utilizzare ogni arto in modo organizzato per eseguire un compito. Spesso, la coordinazione è misurata indirettamente dal numero di errori / eventi positivi su una scala 16,17 o dal tempo trascorso sul rotarod15. Distintamente, il MW calcola sia la variabilità nel posizionamento della zampa durante il ciclo di passi (modello di impronta) sia l'indice di "rettilineità della posizione"27. È stato dimostrato che entrambi i parametri sono stati significativamente influenzati dalla lesione (Figura 4).
Inoltre, il MW consente all'utente di estrarre parametri relativi alla dinamica temporale. È stata osservata una significativa interruzione della durata dell'oscillazione/posizione negli animali SCI (Figura 4) ed è stato riscontrato che i topi SCI compensavano la perdita di supporto sugli arti posteriori accelerando il ciclo del passo degli arti anteriori, riducendo così la lunghezza del passo dell'arto anteriore e il tempo medio di oscillazione (Figura 5). Questo effetto potrebbe riguardare lo spostamento del centro di gravità, che costringe le zampe anteriori a sopportare più peso corporeo1. Allo stesso modo, potrebbe essere attribuito alla perdita delle lunghe vie propriospinali ascendenti, che sono responsabili dell'interazione sinergica tra l'arto anteriore e l'arto posteriore CPG 1,9,32, portando infine alla dissociazione del ritmo degli arti anteriori-posteriori.
Le caratteristiche delle andature a passo possono illustrare l'organizzazione modulare delle reti locomotorie 1,34. Sebbene i modelli di passo non siano un proxy diretto per le strategie di andatura adottate in questo caso23, è ancora possibile trarre alcune importanti osservazioni. Importanti alterazioni sono state osservate nei modelli di passo dei topi SCI (Figura 6). Gli animali feriti hanno iniziato ad adottare oscillazioni laterali (andature simili al ritmo), e c'è stata anche una diminuzione delle oscillazioni diagonali. Questi adattamenti sembrano essere associati ad un tentativo di coordinare gli arti anteriori e posteriori, dimostrando ancora una volta la dissociazione tra le tracce spinali sotto e sopra la lesione, che non recupera 1,9,32.
Il recupero limitato dopo SCI è stato verificato anche da una diminuzione del vigore muscolare negli arti posteriori, misurata dalla pressione media (Figura 7). Di conseguenza, gli arti anteriori sono costretti a sostenere più peso corporeo, il che aumenta la pressione. Mentre molti parametri relativi alla dinamica muscolare non sono stati analizzati qui (cioè la coordinazione muscolare flessore ed estensore 7,21), questa misurazione quantitativa può fornire una lettura diretta della quantità di supporto degli arti.
Questa analisi MW può anche essere abbinata al test BMS standard, che misura la rotazione degli arti, il posizionamento delle zampe, la posizione della coda e gli errori di passo. Generalmente, i topi SCI raggiungono un punteggio massimo di 4-5, con un sottopunteggio massimo di 3, il che significa che possono eseguire passaggi occasionali o frequenti ma per lo più ruotare al sollevamento della zampa e / o al touchdown14 (Figura supplementare 2). Diventa chiaro perché i valori AEP per le zampe posteriori sono stati significativamente alterati nel gruppo SCI, poiché il posizionamento non parallelo degli arti durante la fase di oscillazione può influenzare le coordinate della zampa. Inoltre, nel BMS, il tronco è solitamente classificato come grave a causa della presenza di istanze o eventi che impediscono il passo, come butt down e hopping14. Sebbene non sia stato possibile quantificare il comportamento del butt down o le istanze che hanno impedito il passo, è stato rilevato un passo limitato della zampa posteriore nel MW, con una maggiore durata dello swing (Figura 5F), un aumento di tre gambe (Figura 6E) e una pressione inferiore (Figura 7B-D). Inoltre, è stato osservato un aumento significativo delle oscillazioni anteriori/posteriori (Figura 6D). Ci potrebbero essere due spiegazioni complementari per questa manifestazione comportamentale. In primo luogo, è stata misurata l'andatura simile al salto, che potrebbe essere già stata osservata nel test BMS. Tuttavia, questo comportamento potrebbe anche essere correlato alla mancanza di un corretto passo plantare in entrambi gli arti posteriori, con conseguente trascinamento del piede o posizionamento dorsale. Nel complesso, queste osservazioni supportano l'affermazione che la stabilità del tronco è gravemente danneggiata dopo la SCI. Infine, uno dei requisiti per ottenere un punteggio superiore a 5 nel test BMS è il coordinamento14, e per questo, almeno tre passaggi accessibili devono essere osservati dai valutatori durante il test. Di questi, due dei tre o più passaggi accessibili devono essere classificati come coordinati (cioè arti anteriori e posteriori che si alternano). Dai dati MW, è possibile estrarre misurazioni oggettive, l'indice di rettilineità della posizione e il clustering dell'impronta, che quantificano direttamente la coordinazione indipendentemente dalla velocità dell'animale o dal passaggio accessibile (Figura 4). Inoltre, l'alternanza tra gli arti può essere quantificata oggettivamente misurando le strategie di passo (Figura 6). Questi parametri illustrano chiaramente che i topi SCI non possono camminare in linea retta e smarrire gli arti posteriori.
Mentre la cassetta degli attrezzi MW è una strategia utile per studiare i difetti locomotori dopo SCI, si dovrebbero considerare alcuni dei suoi limiti. In primo luogo, è fondamentale rimanere coerenti con i parametri di acquisizione (ad esempio, posizione della telecamera, messa a fuoco, intensità della luce) in modo che le caratteristiche dell'immagine tra i punti temporali siano mantenute. In secondo luogo, è stato notato che la ripetizione ha portato all'assuefazione, che a sua volta ha portato a una diminuzione della velocità. Ciò ha anche contribuito ad aumentare i comportamenti di allevamento / toelettatura e le fermate a metà corsa. Per gli animali feriti, c'era anche la tendenza ad appoggiarsi alle pareti della passerella e un numero maggiore di fermate a metà corsa. Poiché questi comportamenti non fanno parte della valutazione locomotoria, non devono essere considerati. Preferibilmente, i ricercatori dovrebbero scegliere video in cui gli animali camminano continuamente con la testa rivolta dritta. Per contrastare l'influenza di questi comportamenti sui risultati di questo studio, i topi sono stati registrati continuamente per almeno quattro o cinque corse e autorizzati a correre in entrambe le direzioni lungo la passerella. Successivamente, le tre migliori esecuzioni registrate sono state selezionate e regolate nella stessa direzione su ImageJ/FIJI24 (rotazione di 180°). Pertanto, ogni animale è stato rappresentato da una media di tre corse raggruppate insieme per punto temporale. Un numero maggiore di animali per condizione potrebbe anche ridurre la variabilità attesa. Inoltre, va notato che questo test locomotore è raccomandato solo dopo aver raggiunto il passo plantare, poiché il sistema di tracciamento è stato progettato per una valutazione locomotoria ottimizzata. In questo studio, è stato notato che prima di 15 dpi, il test MW non era vantaggioso per la valutazione locomotoria a causa dell'aumento della resistenza del piede e del posizionamento plantare errato, che potrebbe influire sul tracciamento (dati non mostrati). Infine, alcuni parametri (come il clustering dell'impronta) sono molto sensibili alle estrapolazioni effettuate dal modello di regressione generato. Pertanto, il codice è stato modificato di conseguenza (vedere la documentazione nello script nel collegamento GitHub).
Nel complesso, è stato dimostrato che il MW potrebbe discriminare fortemente gli animali SCI dai controlli finti feriti, e MW potrebbe anche essere associato a test consolidati come metodo prezioso per studiare i difetti locomotori dopo SCI. Inoltre, è stato dimostrato che gli output quantitativi potrebbero essere facilmente generati dal set di dati MW utilizzando gli script Python forniti. Questi strumenti forniscono un'efficiente pipeline sperimentale per generare un insieme ricco e diversificato di output quantitativi e grafici che completano i file di output MW originali e possono essere modificati per soddisfare gli obiettivi del ricercatore in termini di tipo di analisi e rappresentazione grafica.
Questa cassetta degli attrezzi è un metodo prezioso per studiare altre malattie motorie o disfunzioni motorie, non solo quelle legate alle lesioni del midollo spinale. Skarlatou et al.10 hanno già dimostrato che una mutazione specifica in Afadin, un'importante proteina di scaffold durante lo sviluppo, ha causato un fenotipo aberrante nel midollo spinale generando due canali centrali. Questo difetto ha comportato la perdita dell'alternanza degli arti destro-sinistro e una maggiore prevalenza della sincronizzazione degli arti, tipica di un'andatura saltellante. Stauch et al.10 hanno anche illustrato che questo tipo di sistema può essere adattato in base alle esigenze dell'utente. In questo caso, è stato applicato per studiare specifici deficit comportamentali in un modello di malattia di Parkinson di ratto. Pertanto, questa cassetta degli attrezzi ha una vasta gamma di applicazioni in diversi modelli in cui sono previsti disturbi motori e può essere combinata con protocolli di comportamento già stabiliti sul campo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Laura Tucker e Natasa Loncarevic per i loro commenti sul manoscritto e il sostegno dato dalla Roditoria dell'Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Gli autori vogliono riconoscere il sostegno finanziario di Prémios Santa Casa Neurociências - Premio Melo e Castro per la ricerca sulle lesioni del midollo spinale (MC-36/2020) a L.S. e C.S.M. Questo lavoro è stato sostenuto da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 e UIDP/04462/2020) e LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) a C.S.M. L.S. è stato supportato da un contratto CEEC Individual Principal Investigator (2021.02253.CEECIND). A.F.I. è stato sostenuto da una borsa di dottorato della FCT (2020.08168.BD). A.M.M. è stato supportato da una borsa di dottorato di FCT (PD / BD / 128445 / 2017). I.M. è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato di FCT (SFRH / BPD / 118051 / 2016). D.N.S. è stato supportato da una borsa di dottorato di FCT (SFRH / BD / 138636 / 2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
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