Summary
Un pipeline expérimental pour décrire quantitativement le modèle locomoteur de souris marchant librement à l’aide de la boîte à outils MouseWalker (MW) est fourni, allant des enregistrements vidéo initiaux et du suivi à l’analyse post-quantification. Un modèle de lésion de la moelle épinière chez la souris est utilisé pour démontrer l’utilité du système MW.
Abstract
L’exécution de programmes moteurs complexes et hautement coordonnés, tels que la marche et la course, dépend de l’activation rythmique des circuits rachidiens et supra-rachidiens. Après une lésion de la moelle épinière thoracique, la communication avec les circuits en amont est altérée. Ceci, à son tour, conduit à une perte de coordination, avec un potentiel de récupération limité. Par conséquent, pour mieux évaluer le degré de récupération après l’administration de médicaments ou de thérapies, il est nécessaire de disposer de nouveaux outils plus détaillés et plus précis pour quantifier la démarche, la coordination des membres et d’autres aspects fins du comportement locomoteur dans les modèles animaux de lésions de la moelle épinière. Plusieurs tests ont été développés au fil des ans pour évaluer quantitativement le comportement de marche libre chez les rongeurs; Cependant, ils manquent généralement de mesures directes liées aux stratégies de marche, aux modèles d’empreinte et à la coordination. Pour remédier à ces lacunes, une version mise à jour du MouseWalker, qui combine une passerelle de réflexion interne totale frustrée (fTIR) avec un logiciel de suivi et de quantification, est fournie. Ce système open-source a été adapté pour extraire plusieurs sorties graphiques et paramètres cinématiques, et un ensemble d’outils de post-quantification peut être pour analyser les données de sortie fournies. Ce manuscrit démontre également comment cette méthode, alliée à des tests comportementaux déjà établis, décrit quantitativement les déficits locomoteurs suite à une lésion de la moelle épinière.
Introduction
La coordination efficace de quatre membres n’est pas unique aux animaux quadrupèdes. La coordination des membres antérieurs et des membres postérieurs chez l’homme reste importante pour accomplir plusieurs tâches, telles que la natation et les modifications de la vitesse en marchant1. Divers circuits de rétroaction cinématiquedes membres 2 et moteurs 1,3,4, ainsi que les circuits de rétroaction proprioceptive5, sont conservés entre les humains et les autres mammifères et devraient être pris en compte lors de l’analyse des options thérapeutiques pour les troubles moteurs, tels que les lésions de la moelle épinière (LME)6,7,8.
Pour marcher, plusieurs connexions vertébrales des membres antérieurs et postérieurs doivent être correctement câblées et activées rythmiquement, ce qui nécessite des entrées du cerveau et une rétroaction du système somatosensoriel 2,9,10. Ces connexions culminent dans les générateurs centraux (CPG), qui sont situés au niveau cervical et lombaire pour les membres antérieurs et postérieurs, respectivement 1,9,10. Souvent, après une lésion médullaire, la perturbation de la connectivité neuronale et la formation d’une cicatrice gliale inhibitrice12 limitent la récupération de la fonction locomotrice, avec des résultats variant de la paralysie totale à la fonction restreinte d’un groupe de membres en fonction de la gravité de la blessure. Les outils permettant de quantifier précisément la fonction locomotrice après une lésion médullaire sont essentiels pour surveiller la récupération et évaluer les effets des traitements ou d’autres interventions cliniques6.
Le test métrique standard pour les modèles de contusion de souris de SCI est l’échelle de souris Basso (BMS)13,14, un score non paramétrique qui tient compte de la stabilité du tronc, de la position de la queue, du pas plantaire et de la coordination des membres antérieurs et postérieurs dans une arène en plein champ. Même si le BMS est extrêmement fiable dans la plupart des cas, il nécessite au moins deux évaluateurs expérimentés pour observer tous les angles de mouvement des animaux afin de tenir compte de la variabilité naturelle et de réduire le biais.
D’autres tests ont également été développés pour évaluer quantitativement les performances motrices après une lésion médullaire. Il s’agit notamment de l’essai rotarod, qui mesure le temps passé sur un cylindre rotatif15; l’échelle horizontale, qui mesure le nombre de garde-corps manqués et de poignées d’échelle positives16,17; et le test de marche à la poutre, qui mesure le temps qu’un animal prend et le nombre de défaillances qu’il fait lorsqu’il traverse une poutre étroite18. Bien qu’ils reflètent une combinaison de déficits moteurs, aucun de ces tests ne produit d’informations locomotrices directes sur la coordination des membres antérieurs et postérieurs.
Pour analyser spécifiquement et plus en profondeur le comportement de marche, d’autres tests ont été développés pour reconstruire les cycles de pas et les stratégies de démarche. Un exemple est le test d’empreinte, où les pattes encrées d’un animal dessinent un motif sur une feuille de papier blanc19. Bien que simple dans son exécution, l’extraction de paramètres cinématiques tels que la longueur de foulée est lourde et imprécise. De plus, l’absence de paramètres dynamiques, tels que la durée du cycle de pas ou la coordination jambe-temps, limite ses applications; En effet, ces paramètres dynamiques ne peuvent être acquis qu’en analysant des vidéos image par image de rongeurs marchant sur une surface transparente. Pour les études sur les LM, les chercheurs ont analysé le comportement de marche à partir d’une vue latérale à l’aide d’un tapis roulant, y compris la reconstruction du cycle des pas et la mesure des variations angulaires de chaque articulation de la jambe 4,20,21. Même si cette approche peut être extrêmement informative6, elle reste axée sur un ensemble spécifique de membres et manque de caractéristiques de démarche supplémentaires, telles que la coordination.
Pour combler ces lacunes, Hamers et ses collègues ont mis au point un test quantitatif basé sur un capteur tactile optique utilisant la réflexion interne totale frustrée (fTIR)22. Dans cette méthode, la lumière se propage à travers le verre par réflexion interne, se disperse lors de la pression de la patte et, finalement, est capturée par une caméra à haute vitesse. Plus récemment, une version open source de cette méthode, appelée MouseWalker, a été mise à disposition, et cette approche combine une passerelle fTIR avec un progiciel de suivi et de quantification23. En utilisant cette méthode, l’utilisateur peut extraire un grand ensemble de paramètres quantitatifs, y compris les modèles de pas, d’espace et de démarche, le positionnement de l’empreinte et la coordination des membres antérieurs et postérieurs, ainsi que des sorties visuelles, telles que les motifs d’empreinte (imitant le test de la patte encrée6) ou les phases de position par rapport à l’axe du corps. Il est important de noter qu’en raison de sa nature open-source, de nouveaux paramètres peuvent être extraits en mettant à jour le package de script MATLAB.
Ici, l’assemblage précédemment publié du système MouseWalker23 est mis à jour. Une description de la façon de le configurer est fournie, avec toutes les étapes nécessaires pour obtenir la meilleure qualité vidéo, les meilleures conditions de suivi et l’acquisition des paramètres. Des outils de post-quantification supplémentaires sont également partagés pour améliorer l’analyse de l’ensemble de données de sortie MouseWalker (MW). Enfin, l’utilité de cet outil est démontrée par l’obtention de valeurs quantifiables pour la performance locomotrice générale, en particulier les cycles de pas et la coordination des membres antérieurs et postérieurs, dans un contexte de lésion médullaire (LME).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures de manipulation, de soins chirurgicaux et postopératoires ont été approuvées par le Comité Moléculaire interne de l’Instituto de Medicina (ORBEA) et le Comité portugais d’éthique animale (DGAV) conformément aux directives de la Communauté européenne (Directive 2010/63/UE) et à la loi portugaise sur les soins aux animaux (DL 113/2013) sous la licence 0421/000/000/2022. Des souris C57Bl/6J femelles âgées de 9 semaines ont été utilisées pour la présente étude. Tous les efforts ont été déployés pour minimiser le nombre d’animaux et diminuer la souffrance des animaux utilisés dans l’étude. Le script MATLAB et la version autonome du logiciel MW sont open-source et sont disponibles sur le GitHub
référentiel (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Bien que le logiciel MW ait été développé dans MATLAB R2012b, il a été adapté pour fonctionner dans MATLAB R2022b. La figure 1 illustre le flux de travail d’analyse du MW.
1. Mise en place de l’appareil MouseWalker (MW)
- Assembler l’appareil MW comme décrit précédemment23, ou l’adapter aux besoins spécifiques de la conception expérimentale (voir le tableau des matériaux et la figure supplémentaire 1 pour plus de détails sur la configuration).
REMARQUE: L’arène de marche peut être élargie pour accueillir de plus gros animaux, tels que des rats. -
Vérifiez que le plexiglas où les animaux marchent est propre et exempt de rayures. Utilisez un chiffon de nettoyage lisse et minimisez l’utilisation de solvants organiques tels que l’ammoniac ou l’éthanol à des concentrations élevées, qui peuvent endommager le plexiglas (3% de peroxyde d’hydrogène, 7% d’éthanol ou tout désinfectant compatible et approprié pour plexiglas est recommandé). Si nécessaire, remplacez le plexiglas.
- Installez la caméra haute vitesse avec un objectif rapide et une grande ouverture (c’est-à-dire des valeurs d’arrêt F plus petites) pour capturer une grande quantité de lumière, car cela aide à enregistrer les signaux fTIR (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: L’objectif ne doit pas générer de distorsions optiques, en particulier sur les bords de l’image. Les distorsions optiques peuvent être testées en enregistrant un motif connu (par exemple, des bandes ou des carrés), puis en mesurant la taille des blocs sur ImageJ/FIJI24 (utilisez l’outil ligne, puis cliquez sur Analyser > mesurer). Par exemple, un carré de 1 cm doit avoir les mêmes dimensions en pixels au centre de l’image et sur les bords. Les variations doivent être inférieures à 5 %. - Allumez la bande lumineuse LED multicolore à partir de la boîte lumineuse d’arrière-plan.
- Allumez la bande lumineuse LED blanche de la boîte à lumières de la passerelle.
REMARQUE: Une LED colorée peut également être utilisée25 pour faciliter la distinction de l’empreinte / corps / arrière-plan. - Une fois les lumières de la pièce éteintes, vérifiez l’intensité lumineuse de la boîte lumineuse d’arrière-plan et de la passerelle. Ajustez l’intensité, si nécessaire, à l’aide d’un potentiomètre ou d’un plastique semi-opaque. Ceux-ci doivent être optimisés pour que l’intensité des pixels augmente dans l’ordre suivant: le corps de l’animal < arrière-plan < les empreintes.
- Pour vérifier l’intensité en pixels du corps/arrière-plan/empreintes de l’animal, ouvrez la séquence d’images sur ImageJ/FIJI24 et cliquez sur Analyser > mesurer. Le signal d’empreinte ne doit pas être sursaturé, car cela empêcherait de définir les limites de l’empreinte (c.-à-d. les orteils et les repose-pieds) (figure supplémentaire 2).
- Ajustez le contraste d’image de la passerelle sur le logiciel d’enregistrement vidéo. Le contraste peut être ajusté de deux manières: en atténuant ou en augmentant l’éclairage sur la bande LED ou en ajustant l’ouverture de l’objectif de la caméra.
- Positionnez correctement la lentille pour qu’elle soit à la même hauteur et au centre du miroir réfléchissant à 45° et perpendiculaire (90°) à la passerelle. Cela générera une image constamment proportionnelle le long de la passerelle gauche-droite.
REMARQUE: Évitez de modifier la position de la caméra (distance, hauteur et orientation) au cours des multiples sessions d’enregistrement. Si nécessaire, marquez le sol où le trépied doit être placé. Cela permettra de conserver les fonctionnalités de l’image. - Focalisez la lentille sur la surface du plexiglas. Cela peut être testé en utilisant un objet non dommageable touchant la surface du plexiglas.
REMARQUE: Avec des valeurs d’objectif F-stop inférieures, la profondeur de champ devient plus petite, ce qui rend la mise au point plus difficile. - Assurez-vous que tous les paramètres restent inchangés pendant le test, car ils peuvent modifier l’intensité en pixels des vidéos enregistrées.
2. Acquisition vidéo
- Assurez-vous que les souris connaissent bien la pièce et l’appareil avant le test. Économisez au moins 1 jour pour l’accoutumance (jour 0). Pour éviter un entraînement excessif, effectuez le test MW un jour différent des autres tests comportementaux (de préférence le lendemain).
- Dans le logiciel d’enregistrement vidéo, assurez-vous qu’au moins 50 cm de la passerelle sont visibles.
- Ajustez les paramètres d’enregistrement pour tronquer la région de la passerelle. Cela réduira la taille de la vidéo et optimisera l’acquisition vidéo.
- Prenez une photo ou une courte vidéo d’une règle régulière avant chaque session. Le nombre de pixels par centimètre sera ensuite utilisé dans la « fenêtre des paramètres » pour calibrer les vidéos.
- Commencez l’acquisition vidéo et placez l’animal sur le bord de la passerelle en saisissant la base de la queue pour éviter les blessures. Assurez-vous que les animaux avancent jusqu’au bord extrême de la plate-forme. Effectuez les enregistrements vidéo avec au moins 100 images / s pour assurer des transitions de démarche en douceur.
- Si nécessaire, motivez les animaux à bouger en tapotant doucement le mur de la passerelle ou en claquant des doigts. Cependant, évitez les coups de pouce physiques, car cela pourrait affecter les résultats.
- Enregistrez les vidéos directement sous forme de séquences d’images au format TIFF (avec compression LZW), JPEG ou PNG. Dans le cas où la caméra enregistre en tant que fichier MOV brut, convertissez les vidéos en séquences d’images en ouvrant le fichier dans ImageJ / FIJI24 et en cliquant sur Fichier > Enregistrer en tant que séquence d’images > (ou en utilisant un autre logiciel, tel que LosslessCut25).
NOTE: La plupart des animaux commencent à marcher immédiatement après avoir été mis dans la passerelle; Par conséquent, il est recommandé de commencer l’acquisition vidéo avant de placer l’animal.
3. Préparation des vidéos pour le logiciel de suivi MW
- Filmez suffisamment de séries complètes de chaque souris. Le nombre d’animaux à filmer par condition et le nombre de séries complètes doivent être déterminés en fonction de chaque plan expérimental. Une course complète se produit lorsque la souris parcourt les 50 cm de la passerelle sans arrêts prolongés (dans cette expérience, trois essais complets ont été sélectionnés).
REMARQUE: Selon le logiciel d’acquisition d’images, les vidéos peuvent avoir besoin d’être recadrées au plus petit retour sur investissement. Cela augmentera la vitesse de suivi et de génération de sorties. - Dans ImageJ/FIJI24, sélectionnez les images dans lesquelles la souris est à l’écran en cliquant sur Image > Stack > Tools > Créer une sous-pile. Le suivi sur le MW nécessite que la tête et la queue soient visibles dans tous les cadres. Il est toutefois possible de créer plusieurs sous-piles à partir d’un seul enregistrement vidéo, qui représentera plus tard chaque exécution.
- Enregistrez chaque sous-pile séparément dans différents dossiers en cliquant sur Fichier > Enregistrer en tant que séquence d’images >. Le logiciel MW crée ensuite automatiquement un sous-dossier dans chaque répertoire chaque fois que l’on commence à analyser une exécution.
4. Suivi
- Ouvrez MATLAB, ajoutez le dossier contenant le script MW au répertoire de travail et exécutez « MouseWalker.m » sur la ligne de commande principale.
REMARQUE: L’utilisation du logiciel MW sous MATLAB permet d’afficher les messages d’erreur de suivi sur la console principale de MATLAB et de sélectionner les données de sortie souhaitées (en ouvrant le fichier de script principal « MouseEvaluate.m » et en changeant les sorties en 1 ou 0: le fichier Excel, les tracés de pas, les traces de position et les modèles de démarche). - Chargez le dossier vidéo en tant que « Répertoire d’entrée ». On peut également choisir le dossier de sortie; cependant, ce n’est pas une exigence car le logiciel MW crée automatiquement un nouveau dossier appelé « Résultats » dans le « Répertoire d’entrée ».
- À l’aide des flèches « << », « < », « >> » et « > », vérifiez si les images vidéo sont toutes chargées correctement dans le logiciel MW.
- Allez dans la « fenêtre Paramètres » où se trouvent tous les paramètres d’étalonnage et de seuil. Ces paramètres peuvent changer en fonction de l’intensité en pixels de l’arrière-plan et des empreintes, ainsi que de la taille minimale du corps et des empreintes, entre autres facteurs (voir l’exemple dans la figure supplémentaire 2). Testez l’effet de la modification de certains paramètres en cliquant sur le bouton Aperçu .
- Utilisez les différents styles de tracé, y compris « corps + pieds + queue », « corps uniquement », « pieds seulement » et « queue uniquement », pour aider à distinguer les parties du corps après avoir ajusté les paramètres de seuil.
- Profitez des outils du panneau de droite pour prendre des mesures de luminosité ou de taille (en utilisant respectivement les boutons « luminosité » et « règle »). Tous les paramètres peuvent être enregistrés par défaut tant que la distance de la caméra reste la même.
- Après avoir ajusté les paramètres de seuil, vérifiez que la vidéo est prête pour le suivi automatisé. Accédez à la première image et cliquez sur Auto pour démarrer le suivi. Cette étape peut être suivie en temps réel, et cela prend quelques minutes, en fonction de la taille de la vidéo et des performances de l’ordinateur.
- Si le suivi automatique étiquette incorrectement les caractéristiques du corps, annulez le suivi automatique, entrez de nouveaux paramètres et redémarrez le processus.
- Une fois le suivi terminé, vérifiez si une correction manuelle est nécessaire. Pour corriger, utilisez le panneau du milieu pour sélectionner ou désélectionner, et indiquez l’emplacement des empreintes de pattes, de la tête, du nez, du corps (divisé en deux segments) et de la queue (divisée en quatre segments) à l’avant droit (RF), à l’arrière droit (RH), à l’avant gauche (LF) et à la postérieure gauche (divisée en quatre segments). Enregistrez les modifications en appuyant sur le bouton Enregistrer .
REMARQUE: Tous les boutons et la plupart des commandes ont un raccourci clavier (consultez le manuel associé pour plus de détails23). Pour faciliter le défilement vidéo et l’exécution des raccourcis clavier, un contrôleur matériel avec des boutons programmables et une roue de navette comme le Contour ShuttlePro V2 peuvent être utilisés. - Cliquez sur Évaluer pour générer les fichiers de sortie à partir de la vidéo suivie. Selon la sortie souhaitée sélectionnée (voir étape 4.1), cette étape peut prendre quelques minutes.
- Vérifiez que tous les graphiques de données de sortie sont enregistrés dans le dossier « Résultats ». Vérifiez l’exactitude du suivi en examinant certaines des sorties graphiques, telles que les « traces de position », où l’on peut vérifier si toutes les positions des pattes sont cohérentes.
- Si une erreur est identifiée, corrigez manuellement le suivi (si possible; sinon, éliminez le dossier « Résultats » et effectuez à nouveau le suivi automatique avec de nouveaux paramètres), puis cliquez à nouveau sur la commande Évaluer .
- Vérifiez que toutes les mesures quantitatives générées par le logiciel MW sont enregistrées sur une feuille de calcul Excel et résumées sur « 1. Info_Sheet ». Assurez-vous que les options Excel pour les délimitations de formule correspondent au script. Le séparateur décimal doit être « , », et les séparateurs de milliers doivent être « ; ».
- Utilisez le script « MouseMultiEvaluate.m » pour rassembler les mesures de toutes les exécutions dans un nouveau fichier pour analyse.
- Pour commencer, générez un fichier .txt contenant les chemins de dossier pour toutes les vidéos (par exemple, « Videofiles.txt »). Assurez-vous que chaque ligne correspond à une seule vidéo.
- Ensuite, écrivez « MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt') » dans la ligne de commande. Un fichier Excel nommé « ResultSummary.xls » sera généré dans le répertoire de travail (voir un exemple dans le référentiel GitHub).
NOTE: La figure 2 représente les sorties graphiques obtenues par le logiciel MW à partir des vidéos d’un animal enregistré.
5. Flux de travail d’analyse des données cinématiques
- Modifiez la feuille Excel générée à l’étape 4.10, qui contient les données à traiter à l’aide des scripts Python fournis, selon les conditions préalables suivantes.
- Dans le premier en-tête de colonne, spécifiez la condition expérimentale. Nommez chaque ligne qui suit le nom du groupe/de la condition (les individus des mêmes groupes doivent avoir le même nom). Le premier groupe doit être le témoin ou la ligne de base (ceci n’est obligatoire que pour le traçage de la carte thermique, étape 5.6).
- Dans la deuxième colonne, spécifiez l’ID de l’animal. Ceci est obligatoire, bien que ces informations ne soient pas utilisées pour la génération de parcelles.
- Dans la troisième colonne et suivantes, choisissez les paramètres du moteur qui seront utilisés pour l’analyse. Assurez-vous que la première ligne est le nom du paramètre (ces noms apparaîtront ultérieurement dans les tracés).
- Ouvrez Anaconda Navigator et exécutez Spyder pour ouvrir les scripts Python fournis.
REMARQUE: Tous les scripts ont été développés avec Python 3.9.13, ont été exécutés avec Spyder 5.2.2 dans Anaconda Navigator 2.1.4, et sont disponibles dans la Table of Materials et le dépôt GitHub (où des matériaux supplémentaires sont inclus, tels qu’un exemple vidéo, un fichier d’exemple Excel et un document FAQ). Il est possible d’exécuter les scripts en dehors de l’Anaconda Navigator ; Cependant, cette interface utilisateur graphique est plus conviviale. - Utilisez le « Rawdata_PlotGenerator.py » pour générer les graphiques de données brutes. Cela permettra de visualiser chaque paramètre en fonction de la vitesse.
- Ouvrez « Rawdata_PlotGenerator.py » dans Spyder, et exécutez le code en cliquant sur le bouton Lecture .
- Sélectionnez le fichier Excel à analyser et le nom de la feuille dans la fenêtre automatique. Si le nom de la feuille n’a pas été modifié, écrivez « Sheet1 ».
- Les graphiques de données brutes apparaîtront dans la console de tracé (panneau supérieur droit). Pour enregistrer les tracés, cliquez sur le bouton Enregistrer l’image ou Enregistrer toutes les images dans la console du tracé.
- Utilisez le script « Residuals_DataAnalysis » pour calculer les résidus pour l’analyse des données. Ce script générera un fichier CSV avec les calculs des résidus pour tous les paramètres du moteur.
REMARQUE : Bon nombre des paramètres de marche mesurés extraits par le MW varient selon la vitesse (p. ex., vitesse de rotation, longueur de pas, durée de position, rectitude de position et indices de marche). Par conséquent, il est recommandé d’effectuer un modèle de régression le mieux ajusté de chaque paramètre individuel en fonction de la vitesse pour l’expérience de référence, puis de déterminer les valeurs résiduelles pour chaque groupe expérimental par rapport à ce modèle de régression. Les données sont ensuite exprimées sous forme de différence par rapport à la ligne26 normalisée résiduelle.- Ouvrez « Residuals_DataAnalysis.py » dans Spyder, et exécutez le code en cliquant sur le bouton Lecture .
- Sélectionnez le fichier Excel à analyser et le nom de la feuille dans la fenêtre automatique. Si le nom de la feuille n’a pas été modifié, écrivez « Sheet1 ».
- Enregistrez le fichier CSV dans le même dossier que les données. Il est obligatoire que le contrôle (ou ligne de base) soit le premier groupe du fichier Excel.
- Utilisez le script « PCA_PlotGenerator.py » pour effectuer une analyse en composantes principales (ACP).
REMARQUE : Cette méthode de réduction de dimensionnalité non supervisée est utilisée pour générer une représentation plus succincte 27,28,29 des données (Figure 3A, B). Le script PCA comprend les étapes suivantes. Les données sont d’abord prétraitées par centrage et mise à l’échelle, après quoi l’algorithme PCA calcule la matrice de covariance pour déterminer les corrélations entre les variables et calculer les vecteurs propres et les valeurs propres de la matrice de covariance pour identifier les composantes principales. Les deux ou trois premières composantes principales sont choisies pour la représentation des données dans des tracés 2D ou 3D, respectivement. Chaque point des graphiques correspond à un animal et représente une variable abstraite différente. Des points codés par couleur sont utilisés pour distinguer les groupes spécifiques. En tant que tels, les groupes de points reflètent des modèles de marche similaires partagés par les individus correspondants.- Ouvrez « PCA_PlotGenerator.py » dans Spyder, et exécutez le code en cliquant sur le bouton Lecture .
- Sélectionnez le fichier Excel à analyser et le nom de la feuille dans la fenêtre automatique. Si le nom de la feuille n’a pas été modifié, écrivez « Sheet1 ».
- Assurez-vous que les tracés PCA 2D et 3D apparaissent dans la console de tracé (panneau supérieur droit). Chaque couleur représente un groupe différent et la légende apparaît à côté de l’intrigue. Pour enregistrer le tracé, cliquez sur Enregistrer l’image dans la console du tracé.
- Utilisez « Heatmap_PlotGenerator.py » pour générer une carte thermique. Assurez-vous que le générateur de carte thermique crée un tableau montrant les différences statistiques entre le groupe de référence (ou groupe témoin) et les autres groupes pour chaque paramètre moteur27 (Figure 4). Chaque colonne représente un groupe et chaque ligne se rapporte à un paramètre moteur spécifique.
REMARQUE : L’analyse statistique a été effectuée avec une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey (pour les distributions normales) ou une ANOVA de Kruskal-Wallis suivie du test post hoc de Dunn (pour les distributions non normales). Les valeurs aberrantes ont été exclues de l’analyse. Les valeurs de p sont représentées par un code couleur, avec des nuances de rouge et de bleu indiquant une augmentation ou une diminution par rapport au contrôle (ou à la ligne de base), respectivement. La nuance de couleur représente la signification statistique, les couleurs plus foncées montrant une signification plus élevée et les couleurs plus claires montrant une signification inférieure. correspond à P < 0,001; ** correspond à P < 0,01; et * correspond à P < 0,05. Le blanc indique qu’il n’y a pas de variation.- Ouvrez « Heatmap_PlotGenerator.py » dans Spyder, et exécutez le code en cliquant sur le bouton Lecture .
- Sélectionnez le fichier Excel à analyser et le nom de la feuille dans la fenêtre automatique. Si le nom de la feuille n’a pas été modifié, écrivez « Sheet1 ».
- Sélectionnez le type de données dans la deuxième fenêtre automatique : données brutes ou données résiduelles. Si aucune option n’est sélectionnée, les données résiduelles sont les données par défaut.
- La carte thermique apparaîtra dans la console du tracé (panneau supérieur droit). Pour enregistrer le tracé, cliquez sur Enregistrer l’image dans la console du tracé.
Remarque : Il est obligatoire que le contrôle (ou ligne de base) est le premier groupe dans le fichier Excel.
- Utilisez « Boxplots_PlotGenerator.py » pour générer les boxplots. Cet outil permettra de générer des boxplots qui représentent la distribution des valeurs pour tous les paramètres moteurs de chaque groupe (Figure 5, Figure 6 et Figure 7).
REMARQUE : Chaque case contient la médiane comme ligne médiane, et les bords inférieur et supérieur des cases représentent les quartiles de 25 % et de 75 %, respectivement. Les moustaches représentent la plage de l’ensemble complet des données, à l’exclusion des valeurs aberrantes. Les valeurs aberrantes sont définies comme toute valeur qui est 1,5 fois la plage interquartile inférieure ou supérieure aux quartiles de 25 % et de 75 %, respectivement.- Ouvrez « Boxplots_PlotGenerator.py » dans Spyder et exécutez le code en cliquant sur le bouton Lecture .
- Sélectionnez le fichier Excel à analyser et le nom de la feuille dans la fenêtre automatique. Si le nom de la feuille n’a pas été modifié, écrivez « Sheet1 ».
- Sélectionnez le type de données dans la deuxième fenêtre automatique : données brutes ou données résiduelles. Si aucune option n’est sélectionnée, les données résiduelles sont les données par défaut.
- Les boxplots apparaîtront dans la console de tracé (panneau supérieur droit). Pour enregistrer les tracés, cliquez sur le bouton Enregistrer l’image ou Enregistrer toutes les images dans la console du tracé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le système BMS standard décrit les déficits moteurs bruts après SCI14. En raison de sa nature subjective, d’autres tests quantitatifs sont généralement effectués parallèlement au BMS pour produire une évaluation plus détaillée et plus fine de la locomotion. Cependant, ces tests ne montrent pas d’informations spécifiques sur les cycles de pas, les modèles de pas et la coordination des membres antérieurs et postérieurs, ce qui est extrêmement important pour comprendre comment les circuits rachidiens maintiennent leur fonction et s’adaptent à une lésion médullaire incomplète. Cette section montre comment la boîte à outils MW peut aider à surveiller la récupération de la fonction locomotrice après une lésion médullaire et ajouter des informations pertinentes sur le comportement de marche.
L’échantillon de l’étude a été divisé en deux groupes de souris C57Bl/6J femelles âgées de 9 semaines : un groupe expérimental de lésions médullaires (n = 11), dans lequel les animaux ont subi une laminectomie suivie d’une lésion de contusion modérée à grave au niveau de la colonne vertébrale T9/T10 à l’aide d’un impacteur à horizon infini (voir le tableau des matériaux); et un groupe témoin blessé par simulacre (n = 10), dans lequel seule la laminectomie a été réalisée au même niveau de colonne (figure 1, étape 1). Le comportement locomoteur des LM et des animaux blessés simulés a été surveillé pendant 30 jours. Le test MW a été effectué le jour de l’accoutumance avant la chirurgie (ligne de base) et 15 jours, 22 jours et 30 jours après la blessure (dpi) (Figure 1, étape 2). À des fins de comparaison, les souris ont été soumises au test BMS en parallèle avant la chirurgie et à 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi et 30 dpi (figure supplémentaire 3). Après avoir suivi toutes les vidéos obtenues avec le MW, deux types de fichiers de sortie ont ensuite été générés : des sorties graphiques, montrant des représentations visuelles de plusieurs paramètres après chaque exécution, et des sorties cinématiques, résumant tous les paramètres moteurs mesurables (Figure 1, étape 3 et étape 4).
Par conséquent, à l’aide d’un ensemble de scripts Python (voir Table of Materials et le lien vers le référentiel GitHub), les graphiques de données brutes ont été obtenus (Figure 1, étape 5). Comme la plupart des paramètres sont influencés par la vitesse de l’animal, un modèle de régression du groupe de référence avant la blessure a été effectué avec les valeurs résiduelles mesurées pour chaque condition (Figure 1, étape 6). Pour vérifier les profils cinématiques et les différences significatives entre le groupe témoin (simulé) et le groupe expérimental (SCI), tous les paramètres cinématiques (total de 79) ont été soumis à une analyse en composantes principales (ACP) de trois ordres, et une carte thermique a été générée avec une collection de paramètres moteurs qui décrivaient le mieux l’ensemble de données (total de 33) (Figure 1, étape 7a, b). Enfin, les paramètres moteurs spécifiques qui ont été affectés après l’ICS ont été comparés à la ligne de base avant la blessure (Figure 1, Étape 7c).
Figure 1 : Représentation schématique du flux de travail d’analyse du MW. (1) Les animaux sont sélectionnés pour une laminectomie (groupe témoin fictif) ou une laminectomie suivie d’une lésion de la moelle épinière (groupe expérimental). (2) Les animaux sont ensuite soumis à un test comportemental la veille de la blessure et les jours 15, 22 et 30 après la blessure. (3) Le MW génère deux types de données de sortie: (a) des visualisations graphiques de plusieurs paramètres, tels que les traces de position, les allures et les pas de pas, et (b) un résumé cinématique de tous les paramètres moteurs mesurables. (4) Toutes les données de contrôle et expérimentales sont rassemblées dans un seul fichier à l’aide du script « MouseMultiEvaluate.m » sur MATLAB. (5) Le script « RawData_PlotGenerator » pour Python génère une représentation visuelle de la façon dont tous les paramètres mesurables du moteur varient en fonction de la vitesse. Si les paramètres ne sont pas corrélés avec la vitesse, on pourrait passer à (7); cependant, comme la plupart des paramètres après SCI dépendent fortement de la vitesse, un modèle doit être généré (6) en utilisant le script « Residual_DataAnalysis » pour Python. Après avoir généré les valeurs résiduelles pour chaque paramètre moteur, l’analyse des données est effectuée (7): a) une analyse en composantes principales (ACP) est effectuée à l’aide d’une sélection de paramètres avec un script « PCA_PlotGenerator »; b) une carte thermique est créée à l’aide d’un script « Heatmap_PlotGenerator » pour montrer les différences statistiquement significatives entre les conditions pour différents paramètres; et c) plusieurs paramètres individuels qui sont modifiés après l’évaluation des lésions médullaires à l’aide du script « BoxPlot_PlotGenerator ». Tous les scripts sont disponibles dans Table of Materials et lien du référentiel GitHub. Les scripts sont affichés en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
À partir des données graphiques de sortie recueillies auprès du MW, il a été possible de confirmer le changement brusque bien connu dans l’affichage visuel des empreintes après SCI. Dans le test « Encre numérique » généré par le MW, un manque de soutien des pattes postérieures a été détecté (figure 2A), ainsi qu’une diminution de la zone d’empreinte pour les pattes postérieures gauche et droite (figure 2B), qui a été maintenue à partir de 15 ppp (données non présentées). De plus, à l’intérieur de chaque cycle de pas, le MW calcule les paramètres liés à la phase de position (c.-à-d. le temps entre le toucher des roues et avant le décollage) et la phase de balancement (c.-à-d. le moment où le membre est décollé du sol). En tant que tel, le MW peut générer des « traces de position » visuelles, qui prennent en considération la position du centre et de l’axe du corps par rapport à chaque jambe et leur centre d’empreinte pendant les phases de position23. Les traces de position globale obtenues pour chaque animal présentaient plusieurs caractéristiques uniques (figure 2C). Ces données ont montré qu’après les lésions médullaires, les pattes postérieures présentaient des traces de position plus courtes et un positionnement plus aléatoire des pattes au toucher et au décollage à partir de 15 dpi (figure 2C).
Figure 2 : Sorties graphiques représentatives obtenues par le logiciel MW à partir des vidéos de suivi. (A) Impressions « à l’encre numérique » pour un animal LM montrant chaque patte avec une couleur différente : rouge (avant droit), jaune (avant gauche), vert (postérieur droit) et bleu (postérieur gauche) à plusieurs points temporels. (B) Empreintes de pas pour l’avant gauche (LF), le postérieur gauche (LH), l’avant droit (RF) et le postérieur droit (HR) d’un animal SCI à 15 dpi. (C) « Traces de position » pour un animal LM à plusieurs points temporels. L’AEP et le PEP pour l’une des jambes sont illustrés dans le premier panneau. Le « regroupement d’empreintes » pour l’AEP et le PEP correspond à l’écart-type des coordonnées moyennes AEP ou PEP dans chaque vidéo. Abréviations : dpi = jours après la blessure; cm = centimètre; px = pixel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Ensuite, les sorties cinématiques ont été analysées après avoir été calculées par le MW (Figure 3 et Figure 4). Pour obtenir une description plus concise de l’ensemble de données et tester si les paramètres moteurs cinématiques obtenus à partir du MW étaient suffisants pour décrire les déficits locomoteurs trouvés chez les animaux LM au fil du temps, un PCA27 a été effectué. Il est à noter que 40 % de la variance des données pouvait s’expliquer dans la première composante (PC1 : 40,1 %), qui séparait le groupe d’animaux ayant une LM du reste, avec une valeur de p inférieure à 0,001 basée sur un test d’ANOVA unidirectionnel (figure 3A, B) à tous les points temporels (15 dpi, 22 ppp et 30 dpi). Il y avait aussi une faible contribution des autres composantes (PC2 : 11 % et PC3 : 8,6 %). Le poids attribué à chaque contribution des paramètres moteurs pour chaque composant est illustré à la figure supplémentaire 4. De plus, la variance dans l’ensemble de données n’était pas suffisante pour refléter les différences au fil du temps (c.-à-d. entre 15 dpi, 22 ppp et 30 dpi), ce qui reproduit le plateau de récupération locomotricedécrit précédemment 14. Dans l’ensemble, ces résultats indiquent que les paramètres cinématiques obtenus à partir du MW décrivent fortement les déficits moteurs observés après SCI à tous les points temporels.
Figure 3 : Analyse en composantes principales de tous les paramètres cinématiques moteurs (79) obtenus par le logiciel MW après analyse des données résiduelles. (A) Une visualisation 3D de l’analyse PCA à trois composants. (B) Une visualisation 2D avec des cercles représentant 50% des données collectées. Dans PC1, qui expliquait plus de 40% de la variance, le groupe SCI à 15 dpi, 22 dpi et 30 dpi était significativement différent du groupe simulé et de la ligne de base (avant blessure), avec une valeur p < 0,001, déterminée par une ANOVA unidirectionnelle. Chaque petit point ou triangle représente la moyenne de trois vidéos pour chaque animal, tandis que les plus grands points ou triangles représentent le point moyen (n = 10-11 par condition, n = 21 pour le groupe de base). La contribution de chaque composante est indiquée dans chaque axe. Abréviations : dpi = jours après la blessure; LM = lésion de la moelle épinière; PC = composant principal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Ensuite, une collection de paramètres moteurs a été sélectionnée en fonction de la précision avec laquelle elle décrivait l’ensemble de données (33 au total), et une carte thermique a été générée (Figure 4). En effet, la plupart des paramètres locomoteurs ont montré un changement radical après une lésion médullaire à tous les points temporels (15 dpi, 22 dpi et 30 dpi), tandis que les témoins blessés simulés n’ont montré des changements significatifs qu’à 30 dpi. Ces changements dans le groupe simulé pourraient s’expliquer par une diminution globale de la vitesse de balancement, peut-être due à l’accoutumance au test, qui sera discutée plus loin.
Il a été remarqué que les animaux LM marchaient plus lentement que les témoins blessés par simulacre (données non présentées). Cependant, indépendamment de la vitesse, à 15 dpi et 30 dpi, les animaux SCI affichaient une durée de balancement plus élevée, une durée de position plus faible et un indice de facteur de service inférieur, qui se rapporte à la durée de la position / période de pas23. Ces résultats indiquent que les modifications du positionnement des pattes décrites ci-dessus sont caractéristiques des lésions médullaires, comme on le voit dans d’autres modèles animaux30,31,32, et ne sont pas liées aux modifications de la cadence (figure 4).
Il convient également de mentionner que la synchronie gauche et droite n’a pas été affectée, car un changement significatif dans les indices de « phase » pour les membres antérieurs et postérieurs n’a pas été observé10,23 (Figure 4), indiquant un couplage intact entre les membres gauche et droit.
De plus, les souris SCI présentaient un indice de « rectitude de position » plus faible (déplacement/longueur de trajet) dans les membres antérieurs et postérieurs (Figure 4). Ce paramètre mesure la mesure la linéaire des traces par rapport à la condition idéale, qui serait une droite (allant de 0 à 1, indiquant une trace linéaire)27. Par conséquent, ces résultats indiquent une forte incapacité à marcher droit dans ce groupe.
Pour chaque phase de position, le MW dessine une reconstruction des oscillations du corps, en commençant par le toucher de la patte - la position extrême antérieure, ou AEP - et se terminant avant le décollage - la position extrême postérieure, ou PEP (voir l’exemple de la figure 2C). Le « regroupement d’empreintes » de l’AEP et du PEP mesure l’écart-type des coordonnées moyennes de l’AEP ou de la PEP dans chaque vidéo. Les animaux LM ont montré une augmentation du regroupement de l’empreinte de pattes postérieures pour l’AEP à tous les points temporels, et un effet significatif n’a été observé que pour le groupe blessé simulé à 15 dpi (Figure 4). Cela montre que les animaux de la LME ne pouvaient pas positionner correctement leurs membres postérieurs au toucher des roues après la balançoire. De plus, on a observé une diminution du « regroupement de l’empreinte » des pattes avant pour la PPE, ainsi qu’une diminution du regroupement de l’empreinte de la patte arrière pour la PPE, à 30 ppp (figure 4). Ces résultats sont conformes à ce qui est observé dans les « traces de position » dessinées et suggèrent que la position des pattes avant devient plus restreinte après une blessure.
Enfin, et conformément aux modifications du positionnement des pattes, il y a eu des altérations dans les stratégies de marche et la « pression » provoquée par les pattes, mesurée par la luminosité moyenne sur la zone (figure 4), qui sera discutée plus en détail.
Figure 4 : Diagramme de carte thermique montrant une collection des paramètres locomoteurs significativement modifiés comparant les animaux LM et les animaux blessés par simulacre par rapport à la veille de la chirurgie, tels qu’obtenus par le MW après analyse des données résiduelles. n = 10-11 par condition; Le groupe de base comprend tous les animaux la veille de la chirurgie, n = 21. Les données sont exprimées par la valeur de p après analyse statistique avec une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey (pour les distributions normales) ou du test post hoc de Dunn (pour les distributions non normales). Les valeurs P sont représentées par un code couleur, avec des nuances de rouge et de bleu indiquant une diminution ou une augmentation par rapport à la ligne de base, respectivement. La nuance de couleur représente la signification statistique, les couleurs plus foncées indiquant une signification plus élevée et les couleurs plus claires indiquant une signification inférieure; P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05. Le blanc indique qu’il n’y a pas de variation. Abréviations : dpi = jours après la blessure; LM = lésion de la moelle épinière; s = seconde; ms = milliseconde; moyenne = moyenne; F = avant; H = biche; AEP = position extrême antérieure; PEP = position extrême postérieure; LF = gauche devant; LH = postérieur gauche; RF = droit avant; HR = postérieur droit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Par la suite, nous avons cherché à comprendre quels paramètres individuels seraient les meilleurs pour décrire les déficits locomoteurs des animaux LM à différents stades de la blessure (c.-à-d. 15 dpi, 22 dpi et 30 dpi). Nous avons commencé par examiner les paramètres du cycle des étapes qui montraient des différences entre les membres antérieurs et postérieurs à mesure que les membres postérieurs progressaient de la paralysie totale à la fonction partielle (Figure 5). Bien que la vitesse de rotation moyenne ait augmenté de façon significative pour les membres antérieurs par rapport à la ligne de base (avant la blessure), la vitesse de rotation des membres postérieurs n’a pas changé de façon significative (bien qu’elle ait eu tendance à être inférieure à la ligne de base) (figure 5A, B). Parallèlement, la longueur moyenne des pas des membres antérieurs a diminué, sans changement significatif pour les membres postérieurs (Figure 5C,D). Sans surprise, les souris blessées ont montré une diminution de la durée de balancement des membres antérieurs et une augmentation inverse de la durée de leurs oscillations des membres postérieurs à partir de 15 dpi (Figure 5E,F). Pris ensemble, ces résultats indiquent que les membres antérieurs ont adopté un rythme plus rapide, avec deux cycles des membres antérieurs pour chaque cycle des membres postérieurs. Ce rapport de cycle 2:1 a été décrit précédemment après hémisection SCI chez le rat 1,33 et illustre un aspect clé de la coordination défectueuse des membres antérieurs-postérieurs, qui n’est pas récupérée après 30 dpi chez la souris.
Figure 5 : Paramètres du cycle d’étape pour les pattes antérieures et postérieures à plusieurs points temporels 1 jour avant la blessure et à 15 dpi, 22 ppp et 30 ppp chez les animaux LM (n = 11). (A,B) La vitesse moyenne de rotation des pattes antérieures et postérieures par rapport à la ligne de base. (C, D) La longueur moyenne des pattes antérieures et postérieures par rapport à la ligne de base. (E,F) Durée moyenne de balancement des pattes antérieures et postérieures par rapport à la ligne de base. Dans les diagrammes en boîtes, la médiane est représentée par la ligne médiane, et les bords inférieur et supérieur des cases représentent respectivement les quartiles 25 % et 75 %; Les moustaches représentent la plage de l’ensemble complet de données. Les valeurs aberrantes sont représentées par des points simples. L’analyse statistique a été effectuée avec une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey (pour les distributions normales) ou du test post hoc de Dunn (pour les distributions non normales). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001. Abréviations : dpi = jours après la blessure; LM = lésion de la moelle épinière; cm = centimètre; s = seconde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Le logiciel MW est également capable de calculer les modèles de pas des souris en mesurant la fraction de cadres attribuée à une combinaison de jambes spécifique, ce qui fonctionne comme un proxy pour la présence de stratégies de démarche spécifiques. À des vitesses plus lentes, les souris non blessées ont tendance à adopter une « démarche de marche », dans laquelle la plupart des cadres ont un balancement à une jambe (quelle que soit la position de la patte). À des vitesses intermédiaires, les plus courantes sur la piste, les souris passent à une démarche de trot, dans laquelle la configuration la plus représentative est le balancement diagonal des jambes. Enfin, à des vitesses plus élevées, les souris utilisent une « démarche de galop », avec trois pattes se balançant en même temps23,34. D’autres configurations moins courantes incluent la démarche de stimulation, principalement représentée par le balancement latéral des jambes (jambes gauche ou droite) et la « démarche liée/sautillante », avec les deux membres postérieurs ou antérieurs se balançant simultanément10. Cependant, il faut garder à l’esprit que, dans le contexte d’une SCI, certaines de ces configurations, telles que la balançoire à trois jambes, peuvent refléter un positionnement défectueux de la patte postérieure et, par conséquent, ne correspondent pas précisément à une stratégie de démarche spécifique - dans ce cas, le galop. Par conséquent, l’analyse a été simplifiée en comparant uniquement les configurations des jambes.
Après avoir effectué l’analyse résiduelle, on a remarqué qu’il y avait une diminution de la prévalence des oscillations diagonales accompagnée d’une diminution des oscillations simples à tous les points temporels (figure 6A, B). Plus intéressant encore, il y a eu une augmentation de la prévalence des oscillations latérales (figure 6C). La démarche de stimulation n’est pas typique d’une souris C57BL/6J normale ; cependant, il a déjà été signalé qu’il se produisait après une hémisection de la LME chez le rat1. Ce schéma en phase n’était pas assez répandu pour modifier l’indice de phase des membres antérieurs ou postérieurs (comme le montre la figure 3), mais illustre une rétroaction vertébrale défectueuse des membres postérieurs aux membres antérieurs. De plus, il y avait une augmentation naturelle de la prévalence des oscillations des membres antérieurs et postérieurs (figure 6D), peut-être en raison d’un pas plantaire incorrect des membres postérieurs, et une augmentation des balançoires à trois pattes (figure 6E).
Figure 6 : Les indices moyens pour différentes configurations de balançoire. (A) diagonale, (B) simple, (C) latérale, (D) avant/postérieure et (E) balançoire à trois pattes à plusieurs points temporels chez les animaux LM (n = 11) sont indiquées. Dans les diagrammes en boîtes, la médiane est représentée par la ligne médiane, et les bords inférieur et supérieur des cases représentent respectivement les quartiles 25 % et 75 %; Les moustaches représentent la plage de l’ensemble complet de données. Les valeurs aberrantes sont représentées par des points simples. L’analyse statistique a été effectuée avec une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey (pour les distributions normales) ou du test post hoc de Dunn (pour les distributions non normales). **P < 0,01; P < 0,001. Abréviations : dpi = jours après la blessure; LM = lésion de la moelle épinière; S.O. = sans objet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Enfin, une autre lecture qui peut être extraite du MW est la « pression » comme mesure de la luminosité / surface. Avec des vitesses plus élevées, la zone de contact avec le sol diminue et la pression augmente, de sorte qu’une régression linéaire des données de référence a été effectuée et les valeurs résiduelles pour chaque condition ont été mesurées. Il a été remarqué que la pression sur les pattes antérieures augmentait considérablement à tous les points temporels, mais que la force de cet effet avait tendance à diminuer avec le temps, car le changement pour la patte avant gauche perdait déjà une signification statistique à 30 dpi (figure 7A,C). Cet effet spécifique sur le côté gauche pourrait s’expliquer par une blessure latéralisée, qui aurait pu affecter préférentiellement le côté droit de la moelle épinière dans cette étude. Néanmoins, la pression exercée par les pattes postérieures a diminué chez les souris blessées, comme prévu, à tous les points temporels, sans tendance à l’augmentation (Figure 7B,D).
Figure 7 : Pression exercée par les pattes postérieures et antérieures à plusieurs points temporels chez les animaux atteints d’ication médullaire (n = 11). Pression provoquée par (A) la patte avant gauche, (B) la patte postérieure gauche, (C) la patte avant droite et (D) la patte postérieure droite, montrées comme des différences relatives par rapport à la ligne de base (la veille de la blessure). Dans les diagrammes en boîtes, la médiane est représentée par la ligne médiane, et les bords inférieur et supérieur des cases représentent respectivement les quartiles de 25 % et de 75 %; Les moustaches représentent la plage de l’ensemble complet de données. Les valeurs aberrantes sont représentées par des points simples. L’analyse statistique a été effectuée avec une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey (pour les distributions normales) ou du test post hoc de Dunn (pour les distributions non normales). **P < 0,01; P < 0,001. Abréviations : dpi = jours après la blessure; LM = lésion de la moelle épinière; cm = centimètre; px = pixel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Dans l’ensemble, cette étude illustre la puissance du système MW pour décrire quantitativement les déficiences motrices causées par les lésions médullaires qui peuvent parfois être ignorées en raison d’autres limitations de test. En outre, il souligne la récupération fonctionnelle sans aucun doute limitée au fil du temps dans le modèle murin de contusion de la LME.
Figure supplémentaire 1 : Les composants matériels MW. A) Cette configuration se répartit comme suit: I − passerelle TIR; II - Base et postes d’appui TIR; III - mur de la passerelle; IV - miroir à 45°; et V - rétroéclairage de fond. (B) Images rapprochées du canal Base-U- et des lignes latérales de la passerelle. C) Conception du mur de la passerelle. (D) Image en gros plan de la configuration du miroir à 45°. Abréviation : cm = centimètre. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2: Une seule image d’une vidéo fTIR dans laquelle l’intensité des pixels et les zones de région sont indiquées. Les intensités de pixels pour le corps, l’arrière-plan et les empreintes utilisées pour l’analyse vidéo dans cette étude sont présentées entre parenthèses et indiquées en rouge, toutes optimisées pour la clarté de l’image. L’intensité lumineuse doit être ajustée pour obtenir une discrimination appropriée entre les différentes régions. Les zones relatives du corps et les empreintes de pas sont indiquées par des lignes jaunes pointillées. Les zones et l’intensité des pixels ont été acquises dans ImageJ/FIJI. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : (A) score total BMS et (B) sous-score des souris analysées dans cette étude (n = 10-11). Toutes les données ont été exprimées sous forme de moyenne ± SEM. L’analyse statistique a été effectuée avec une ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles suivie du test post hoc de Bonferroni; P < 0,001. Abréviation : BMS = échelle de souris Basso. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 4: Poids assigné de chaque contribution des paramètres moteurs pour chaque composant. Poids attribué à chaque paramètre du moteur (79 au total) après analyse résiduelle pour (A) PC1, (B) PC2 et (C) PC3 dans le PCA. La ligne de coupure a été tracée à 0,04 ms et −0,04. Abréviations : ms = milliseconde; moyenne = moyenne; ET = écart-type; F = avant; H = biche; AEP = position extrême antérieure; PEP = position extrême postérieure; LF = gauche devant; LH = postérieur gauche; RF = droit avant; HR = postérieur droit; Pression = pression. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici, le potentiel de la méthode MouseWalker est démontré en analysant le comportement locomoteur après une lésion médullaire. Il fournit de nouvelles informations sur des modifications spécifiques des modèles de pas, d’empreinte et de démarche qui seraient autrement manquées par d’autres tests standard. En plus de fournir une version mise à jour du package MW, les outils d’analyse de données sont également décrits à l’aide des scripts Python fournis (voir étape 5).
Comme le MW génère un grand ensemble de données et une collection de paramètres cinématiques qui reflètent un processus locomoteur hautement dimensionnel, un ACP a été utilisé; en effet, l’ACP a été largement utilisée dans d’autres ensembles de données cinématiques similaires à celui-ci 27,35,36 (Figure 3). Cette technique de réduction de dimensionnalité est une méthode simple et robuste avec des hypothèses minimales qui permet d’identifier quantitativement les profils cinématiques et de les distinguer rapidement des conditions de contrôle ou de base. De plus, des cartes thermiques ont été générées pour identifier rapidement les paramètres statistiquement différents de la ligne de référence (figure 4), qui pourraient ensuite être analysés individuellement (figure 5, figure 6 et figure 7).
Par la suite, il a été montré comment des paramètres spécifiques qui peuvent être extraits du MW illustrent les déficits locomoteurs robustes observés chez les animaux SCI, tels que la coordination. La coordination est la capacité d’utiliser chaque membre de manière organisée pour effectuer une tâche. Souvent, la coordination est mesurée indirectement par le nombre d’erreurs/événements positifs sur une échelle 16,17 ou le temps passé sur le rotarod15. Distinctement, le MW calcule à la fois la variabilité du positionnement des pattes pendant le cycle de pas (motif d’empreinte) et l’indice de « rectitude de position »27. Il a été démontré que les deux paramètres étaient significativement affectés par la blessure (figure 4).
De plus, le MW permet à l’utilisateur d’extraire des paramètres liés à la dynamique temporelle. Une perturbation significative de la durée de balancement/position chez les animaux LM a été observée (Figure 4), et il a été constaté que les souris SCI compensaient la perte de soutien sur leurs membres postérieurs en accélérant leur cycle de pas des membres antérieurs, réduisant ainsi la longueur du pas des membres antérieurs et le temps moyen de balancement (Figure 5). Cet effet pourrait être lié au déplacement du centre de gravité, qui oblige les pattes antérieures à supporter plus de poids corporel1. De même, elle pourrait être attribuée à la perte des longues voies propriospinales ascendantes, responsables de l’interaction synergique entre les CPG des membres antérieurs et des membres postérieurs 1,9,32, conduisant finalement à une dissociation du rythme des membres antérieurs et des membres postérieurs.
Les caractéristiques des allures de pas peuvent illustrer l’organisation modulaire des réseaux locomoteurs 1,34. Bien que les modèles de pas ne soient pas une approximation directe des stratégies de marche adoptées dans ce cas23, certaines observations importantes peuvent tout de même être tirées. Des altérations importantes ont été observées dans les schémas de pas des souris SCI (Figure 6). Les animaux blessés ont commencé à adopter des balançoires latérales (allures ressemblant à des allures), et il y avait aussi une diminution des balançoires diagonales. Ces adaptations semblent être associées à une tentative de coordination des membres antérieurs et postérieurs, démontrant à nouveau la dissociation entre les voies vertébrales en dessous et au-dessus de la lésion, qui ne récupère pas 1,9,32.
La récupération limitée après une lésion médullaire a également été vérifiée par une diminution de la vigueur musculaire dans les membres postérieurs, mesurée par la pression moyenne (Figure 7). Par conséquent, les membres antérieurs sont obligés de supporter plus de poids corporel, ce qui augmente la pression. Bien que de nombreux paramètres liés à la dynamique musculaire n’aient pas été analysés ici (c.-à-d. coordination des muscles fléchisseurs et extenseurs 7,21), cette mesure quantitative peut fournir une lecture directe de la quantité de soutien des membres.
Cette analyse MW peut également être associée au test BMS standard, qui mesure la rotation des membres, le placement des pattes, la position de la queue et les erreurs de pas. En général, les souris SCI atteignent un score maximum de 4-5, avec un sous-score maximum de 3, ce qui signifie qu’elles peuvent effectuer des pas occasionnels à fréquents, mais surtout tourner au décollage de la patte et / ou au toucher des roues14 (Figure supplémentaire 2). Il devient clair pourquoi les valeurs AEP pour les pattes postérieures ont été significativement modifiées dans le groupe SCI, car le positionnement non parallèle des membres pendant la phase de balancement peut affecter les coordonnées de la patte. De plus, dans le BMS, le tronc est généralement classé comme grave en raison de la présence d’instances ou d’événements qui empêchent de marcher, tels que les fesses vers le bas et les sauts14. Bien qu’il n’ait pas été possible de quantifier le comportement de la fesse vers le bas ou les cas qui empêchaient le pas de marche, un pas restreint de patte arrière dans le MW a été détecté, avec une durée de balancement plus élevée (Figure 5F), une augmentation de trois balancements de jambes (Figure 6E) et une pression plus faible (Figure 7B-D). De plus, une augmentation significative des oscillations avant/postérieures a été observée (figure 6D). Il pourrait y avoir deux explications complémentaires à cette manifestation comportementale. Tout d’abord, la démarche sautillante a été mesurée, ce qui a déjà pu être observé dans le test BMS. Cependant, ce comportement pourrait également être lié à un manque de pas plantaire correct dans les deux membres postérieurs, entraînant une traînée du pied ou un placement dorsal. Dans l’ensemble, ces observations appuient l’affirmation selon laquelle la stabilité du tronc est gravement endommagée après une lésion médullaire. Enfin, l’une des exigences pour obtenir un score supérieur à 5 au test BMS est la coordination14, et pour cela, au moins trois passes accessibles doivent être observées par les évaluateurs pendant le test. Parmi ceux-ci, deux des trois passes accessibles ou plus doivent être classées comme coordonnées (c.-à-d. membres antérieurs et membres postérieurs alternés). À partir des données MW, on peut extraire des mesures objectives, l’indice de rectitude de position et le regroupement des empreintes, qui quantifient directement la coordination indépendamment de la vitesse de l’animal ou du passage accessible (Figure 4). De plus, l’alternance entre les membres peut être quantifiée objectivement en mesurant les stratégies de pas (Figure 6). Ces paramètres illustrent clairement que les souris SCI ne peuvent toujours pas marcher en ligne droite et égarer leurs membres postérieurs.
Bien que la boîte à outils MW soit une stratégie utile pour étudier les défauts locomoteurs après une lésion médullaire, il convient de tenir compte de certaines de ses limites. Tout d’abord, il est essentiel de rester cohérent avec les paramètres d’acquisition (c.-à-d. la position de la caméra, la mise au point, l’intensité lumineuse) afin que les caractéristiques de l’image entre les points temporels soient maintenues. Deuxièmement, il a été remarqué que la répétition entraînait une accoutumance, ce qui, à son tour, entraînait une diminution de la vitesse. Cela a également contribué à une augmentation des comportements d’élevage et de toilettage et à des arrêts à mi-parcours. Pour les animaux blessés, il y avait aussi une tendance à s’appuyer sur les murs de la passerelle et un nombre accru d’arrêts à mi-parcours. Comme ces comportements ne font pas partie de l’évaluation locomotrice, ils ne doivent pas être pris en compte. De préférence, les chercheurs devraient choisir des vidéos dans lesquelles les animaux marchent continuellement avec la tête droite. Pour contrer l’influence de ces comportements sur les résultats de cette étude, des souris ont été enregistrées en continu pendant au moins quatre ou cinq passages et autorisées à courir dans les deux sens le long de la passerelle. Par la suite, les trois meilleurs essais enregistrés ont été sélectionnés et ajustés dans la même direction sur ImageJ/FIJI24 (rotation de 180°). Ainsi, chaque animal était représenté par une moyenne de trois montaisons regroupées par point temporel. Un plus grand nombre d’animaux par condition pourrait également réduire la variabilité attendue. De plus, il convient de noter que cet essai locomoteur n’est recommandé qu’après le pas plantaire, car le système de suivi a été conçu pour une évaluation locomotrice affinée. Dans cette étude, il a été noté qu’avant 15 dpi, le test MW n’était pas avantageux pour l’évaluation locomotrice en raison de l’augmentation de la traînée du pied et du placement plantaire incorrect, ce qui pourrait affecter le suivi (données non présentées). Enfin, certains paramètres (comme le clustering d’empreintes) sont très sensibles aux extrapolations faites par le modèle de régression généré. Par conséquent, le code a été ajusté en conséquence (voir la documentation dans le script dans le lien GitHub).
Dans l’ensemble, il a été démontré que le MW pouvait fortement distinguer les animaux LM des témoins simulés, et MW pouvait également être associé à des tests établis comme méthode utile pour étudier les défauts locomoteurs après une lésion médullaire. En outre, il a été démontré que les résultats quantitatifs pouvaient être facilement générés à partir de l’ensemble de données MW à l’aide des scripts Python fournis. Ces outils fournissent un pipeline expérimental efficace pour générer un ensemble riche et diversifié de sorties quantitatives et graphiques qui complètent les fichiers de sortie MW originaux et peuvent être modifiés pour répondre aux objectifs du chercheur en termes de type d’analyse et de représentation graphique.
Cette boîte à outils est une méthode précieuse pour étudier d’autres maladies motrices ou dysfonctionnements moteurs, pas seulement ceux liés aux lésions de la moelle épinière. Skarlatou et al.10 ont déjà démontré qu’une mutation spécifique de l’Afadin, une protéine d’échafaudage importante au cours du développement, provoquait un phénotype aberrant dans la moelle épinière en générant deux canaux centraux. Ce défaut a entraîné la perte de l’alternance du membre droit-gauche et une prévalence plus élevée de synchronisation des membres, typique d’une démarche sautillante. Stauch et coll.10 ont également démontré que ce type de système peut être adapté en fonction des besoins de l’utilisateur. Dans ce cas, il a été appliqué pour étudier des déficits comportementaux spécifiques dans un modèle de maladie de Parkinson chez le rat. Ainsi, cette boîte à outils a un large éventail d’applications dans différents modèles dans lesquels des perturbations motrices sont attendues et peuvent être combinées avec des protocoles de comportement déjà établis sur le terrain.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Laura Tucker et Natasa Loncarevic pour leurs commentaires sur le manuscrit et le soutien apporté par le Rodent Facility de l’Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Les auteurs tiennent à souligner le soutien financier de Prémios Santa Casa Neurociências - Prix Melo e Castro pour la recherche sur les lésions de la moelle épinière (MC-36/2020) à L.S. et C.S.M. Ce travail a été soutenu par Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 et UIDP/04462/2020), et LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) au C.S.M. L.S. a été soutenu par un contrat de chercheur principal individuel CEEC (2021.02253.CEECIND). A.F.I. a été soutenu par une bourse doctorale de FCT (2020.08168.BD). A.M.M. a bénéficié d’une bourse doctorale de la FCT (/BD/128445/2017). I.M. a bénéficié d’une bourse postdoctorale de la FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. a été soutenu par une bourse doctorale de la FCT (SFRH/BD/138636/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A.
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H.
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
