Summary
MouseWalker(MW)ツールボックスを使用して自由に歩くマウスの自発運動パターンを定量的に記述するための実験パイプラインが提供されており、初期のビデオ録画や追跡から定量化後の分析まで、さまざまな結果が得られています。マウスの脊髄挫傷損傷モデルを用いて、MWシステムの有用性を実証した。
Abstract
ウォーキングやランニングなどの複雑で高度に調整された運動プログラムの実行は、脊髄回路および脊髄上回路のリズミカルな活性化に依存しています。胸部脊髄損傷後、上流回路との通信が損なわれます。これは、順番に、限られた回復の可能性で、調整の喪失につながります。したがって、薬物または治療法の投与後の回復の程度をよりよく評価するためには、脊髄損傷の動物モデルにおける歩行、四肢協調、およびその他の自発運動行動の細かい側面を定量化するための、より詳細で正確な新しいツールが必要です。げっ歯類の自由歩行行動を定量的に評価するために、いくつかのアッセイが長年にわたって開発されてきました。ただし、通常、ステップ歩行戦略、フットプリントパターン、および調整に関連する直接的な測定値が不足しています。これらの欠点に対処するために、フラストレーション全反射(fTIR)通路と追跡および定量化ソフトウェアを組み合わせたMouseWalkerの更新バージョンが提供されています。このオープンソースシステムは、いくつかのグラフィカル出力と運動学的パラメータを抽出するように適合されており、一連の定量化後ツールを使用して、提供された出力データを分析できます。この原稿はまた、この方法がすでに確立された行動テストと組み合わせて、脊髄損傷後の自発運動障害を定量的に記述する方法を示しています。
Introduction
四肢の効果的な調整は、四足動物に固有のものではありません。人間の前肢と後肢の協調は、水泳や歩行中の速度の変化など、いくつかのタスクを実行するために依然として重要です1。さまざまな四肢運動学2と運動プログラム1,3,4、および固有受容感覚フィードバック回路5は、ヒトと他の哺乳類の間で保存されており、脊髄損傷(SCI)などの運動障害の治療オプションを分析する際に考慮する必要があります6,7,8。
歩くためには、前肢と後肢からのいくつかの脊椎接続が適切に配線され、リズミカルに活性化される必要があり、これには脳からの入力と体性感覚系からのフィードバックが必要です2,9,10。これらの接続は、それぞれ前肢と後肢の頸部と腰部のレベルに位置する中央パターンジェネレーター(CPG)で最高潮に達します1,9,10。多くの場合、SCI後、ニューロンの接続性の破壊と抑制性グリア瘢痕12の形成は、自発運動機能の回復を制限し、結果は、損傷の重症度に応じて、完全な麻痺から四肢のグループの機能の制限までさまざまです。SCI後の自発運動機能を正確に定量化するツールは、回復を監視し、治療やその他の臨床介入の効果を評価するために重要です6。
SCIのマウス挫傷モデルの標準的なメトリックアッセイは、バッソマウススケール(BMS)13,14であり、オープンフィールドアリーナでの体幹の安定性、尾の位置、足底のステッピング、および前肢と後肢の協調を考慮したノンパラメトリックスコアです。BMSはほとんどの場合非常に信頼性が高いですが、自然な変動性を説明し、バイアスを減らすために、動物の動きのすべての角度を観察するには、少なくとも2人の経験豊富な評価者が必要です。
SCI後の運動性能を定量的に評価するために、他のアッセイも開発されています。これらには、回転シリンダー15に費やされた時間を測定するロタロッドテストが含まれます。手すりの欠落と正のはしごの数を測定する水平はしごは16,17。ビーム歩行テストは、動物が狭いビーム18を横切るときにかかる時間と失敗の数を測定します。運動障害の組み合わせを反映しているにもかかわらず、これらのテストのいずれも、前肢と後肢の協調に関する直接的な自発運動情報を生成しません。
歩行行動を具体的かつより徹底的に分析するために、ステップサイクルと歩行戦略を再構築するための他のアッセイが開発されています。一例は、動物のインクを塗った足が白い紙19のシートの上にパターンを描くフットプリントテストです。実行は簡単ですが、ストライド長などの運動学的パラメータを抽出するのは面倒で不正確です。さらに、ステップサイクルの持続時間や脚時調整などの動的パラメータの欠如は、そのアプリケーションを制限します。実際、これらの動的パラメータは、透明な表面を歩くげっ歯類のフレームごとのビデオを分析することによってのみ取得できます。SCI研究では、研究者は、ステップサイクルの再構築や各脚関節の角度変動の測定など、トレッドミルを使用して側面から歩行行動を分析しました4,20,21。このアプローチは非常に有益ですが6、特定の手足のセットに焦点を当てたままであり、調整などの追加の歩行機能が欠けています。
これらのギャップを埋めるために、Hamersたちは、フラストレーション全反射(fTIR)22を用いた光学式タッチセンサーに基づく定量的試験を開発した。この方式では、光は内部反射 によって ガラス中を伝搬し、足を押すと散乱し、最終的に高速度カメラで撮影されます。より最近では、MouseWalkerと呼ばれるこの方法のオープンソースバージョンが利用可能になり、このアプローチは、fTIR通路と追跡および定量化ソフトウェアパッケージとを組み合わせたものである23。この方法を使用して、ユーザは、歩調、空間、および歩行パターン、足跡の位置、および前肢−後肢協調、ならびに足跡パターン(インク付き足場アッセイ6を模倣する)または体軸に対する立脚位相などの視覚的出力を含む、定量的パラメータの大規模なセットを抽出することができる。重要なのは、そのオープンソースの性質により、MATLABスクリプトパッケージを更新することで新しいパラメーターを抽出できることです。
ここでは、以前に公開されたMouseWalker23 システムのアセンブリが更新されます。設定方法の説明と、最高のビデオ品質、トラッキング条件、およびパラメータ取得を実現するために必要なすべての手順が記載されています。マウスウォーカー(MW)出力データセットの分析を強化するために、追加の定量化後ツールも共有されています。最後に、このツールの有用性は、脊髄損傷(SCI)のコンテキストで、一般的な自発運動能力、特にステップサイクルと前肢と後肢の協調の定量化可能な値を取得することによって実証されます。
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Protocol
すべての取り扱い、外科的、および術後のケア手順は、ライセンス0421/000/000/2022に基づく欧州共同体ガイドライン(指令2010/63 / EU)およびポルトガルの動物管理に関する法律(DL 113/2013)に従って、Instituto de Medicina分子内部委員会(ORBEA)およびポルトガル動物倫理委員会(DGAV)によって承認されました。本研究では、9週齢の雌C57Bl/6Jマウスを用いた。動物の数を最小限に抑え、研究に使用された動物の苦しみを減らすためにあらゆる努力が払われました。MATLAB スクリプトと MW ソフトウェアのスタンドアロン バージョンはオープンソースであり、GitHub で入手できます
リポジトリ (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker)。MWソフトウェアはMATLAB R2012bで開発されましたが、MATLAB R2022bで動作するように適合されています。 図1 は、MWの分析ワークフローを示しています。
1. マウスウォーカー(MW)装置のセットアップ
- 前述のようにMW装置を組み立てるか23、または実験計画の特定のニーズに適応させる(セットアップの詳細については、 材料表 および 補足図1 を参照)。
注意: 歩行アリーナは、ラットなどのより大きな動物を収容するために広くすることができます。 -
動物が歩くプレキシガラスが清潔で傷がないことを確認します。滑らかなクリーニングクロスを使用し、プレキシガラスを損傷する可能性のある高濃度のアンモニアやエタノールなどの有機溶剤の使用を最小限に抑えます(3%過酸化水素、7%エタノール、またはプレキシガラスに適合した適切な消毒剤をお勧めします)。必要に応じて、プレキシガラスを交換してください。
- 高速レンズと大口径(つまり、より小さなFストップ値)を備えた高速カメラをセットアップして、fTIR信号の記録に役立つため、大量の光を取り込むことができます( 材料表を参照)。
注意: レンズは、特に画像の端で光学的な歪みを発生させてはなりません。光学的歪みは、既知のパターン(縞模様や正方形など)を記録し、ImageJ / FIJI24 でブロックのサイズを測定することでテストできます(ラインツールを使用して、[ 分析>測定]をクリックします)。たとえば、サイズが 1 cm の正方形は、画像の中心と端の両方で同じピクセル寸法である必要があります。変動は 5% 未満である必要があります。 - 背景ライトボックスからマルチカラーのLEDライトストリップを照らします。
- 歩道ライトボックスから白色LEDライトストリップを点灯させます。
注意: 色付きのLEDを使用して、フットプリント/ボディ/背景の区別を容易にすることもできます25 。 - 部屋の照明を消した状態で、背景のライトボックスと歩道の光の強さを確認します。必要に応じて、ポテンショメータまたは半不透明なプラスチックを使用して強度を調整します。これらは、ピクセル強度が動物の体<背景<足跡の順に増加するように最適化する必要があります。
- 動物の体/背景/足跡のピクセル強度を確認するには、ImageJ/FIJI24で画像シーケンスを開き、[ 分析>測定]をクリックします。フットプリント信号は、フットプリントの境界(つま先とフットパッド)が定義されるのを防ぐため、過飽和にしないでください(補足図2)。
- ビデオ録画ソフトウェアで歩道の画像コントラストを調整します。コントラストは、LEDストリップの照明を暗くしたり増やしたり、カメラのレンズの絞りを調整するという2つの方法で調整できます。
- レンズを同じ高さで、45°の反射ミラーの中央に、通路に対して垂直(90°)になるように正しく配置します。これにより、左右の歩道に沿って常に比例した画像が生成されます。
注意: 複数の録画セッションでカメラの位置(距離、高さ、向き)を変更しないでください。必要に応じて、三脚を配置する床に印を付けます。これにより、画像の特徴が維持されます。 - プレキシガラスの表面にレンズの焦点を合わせます。これは、プレキシガラスの表面に触れる損傷のない物体を使用してテストできます。
注意: Fストップレンズの値を低くすると、被写界深度が小さくなり、焦点を合わせるのが難しくなります。 - 記録されたビデオのピクセル強度が変更される可能性があるため、アッセイ中にすべての設定が変更されていないことを確認してください。
2.ビデオ取得
- テストの前に、マウスが部屋と装置に精通していることを確認してください。慣れのために少なくとも1日保存してください(0日目)。過度のトレーニングを避けるために、他の行動テストとは異なる日(できれば翌日)にMWテストを実行してください。
- ビデオ録画ソフトウェアで、少なくとも50cmの歩道が見えることを確認してください。
- 記録設定を調整して、歩道領域を切り捨てます。これにより、ビデオサイズが縮小され、ビデオ取得が最適化されます。
- 各セッションの前に、通常の定規の写真または短いビデオを撮ります。センチメートルあたりのピクセル数は、後でビデオを調整するために「設定ウィンドウ」で使用されます。
- ビデオ取得を開始し、怪我をしないように尾の付け根をつかんで動物を歩道の端に置きます。動物がプラットフォームの端まで前進することを確認します。スムーズな歩行移行を確保するために、少なくとも100フレーム/秒でビデオ録画を実行します。
- 必要に応じて、歩道の壁を軽くたたくか、指をパチンと鳴らしたり、拍手したりして、動物が動くように動機付けます。ただし、結果に影響を与える可能性があるため、物理的なナッジは避けてください。
- ビデオをTIFF(LZW圧縮付き)、JPEG、またはPNG形式の画像シーケンスとして直接保存します。カメラが生のMOVファイルとして記録する場合は、ImageJ /FIJI 24 でファイルを開き、[ファイル]>[画像シーケンス >として保存 ]をクリックして(またはLosslessCut25などの他のソフトウェアを使用して)、ビデオを画像シーケンスに変換します。
注意: ほとんどの動物は、歩道に入れられた直後に歩き始めます。したがって、動物を配置する前にビデオ取得を開始することをお勧めします。
3. MWトラッキングソフトウェア用のビデオの準備
- 個々のマウスの十分な完全な実行を撮影します。条件ごとに撮影する動物の数と完全な実行の数は、各実験計画に従って決定する必要があります。完全な実行とは、マウスが長時間停止することなく歩道の完全な50 cmを歩くことです(この実験では、3つの完全な実行が選択されました)。
注意: 画像取得ソフトウェアによっては、ビデオを最小のROIにトリミングする必要がある場合があります。これにより、追跡と出力生成の速度が向上します。 - ImageJ/FIJI24 で、[画像> スタック ] > [ツール] > [サブスタックを作成] をクリックして、マウスが画面上にあるフレームを選択します。MWでの追跡では、すべてのフレームでヘッドとテールが見える必要があります。ただし、1 つのビデオ録画から複数のサブスタックを作成し、後で各実行を表すことは可能です。
- 各サブスタックを別々のフォルダに別々に保存するには 、[ファイル] > [イメージ シーケンスとして保存>] をクリックします。MWソフトウェアは、後で実行の分析を開始するたびに、各ディレクトリにサブフォルダを自動的に作成します。
4. トラッキング
- MATLABを開き、MWスクリプトを含むフォルダを作業ディレクトリに追加し、メインコマンドラインで「MouseWalker.m」を実行します。
注:MATLABでMWソフトウェアを使用すると、MATLABのメインコンソールでエラーメッセージを追跡し、目的の出力データを選択できます(メインスクリプトファイル「MouseEvaluate.m」を開き、出力を1または0に変更します:Excelファイル、足跡プロット、スタンストレース、歩行パターン)。 - ビデオフォルダを「入力ディレクトリ」としてロードします。出力フォルダを選択することもできます。ただし、MWソフトウェアは「入力ディレクトリ」内に「結果」という新しいフォルダを自動的に作成するため、これは要件ではありません。
- 矢印「<<」、「<」、「>>」、「>」を使用して、ビデオフレームがすべてMWソフトウェア内に正しくロードされているかどうかを確認します。
- すべてのキャリブレーションとしきい値のパラメーターが配置されている[設定]ウィンドウに移動します。これらの設定は、背景とフットプリントのピクセル強度、ボディとフットプリントの最小サイズなどの要因に応じて変更できます( 補足図2の例を参照)。プレビュー ボタンをクリックして、 いくつかのパラメータを変更した場合の効果をテストします。
- 「胴体+足+尾」、「胴体のみ」、「足のみ」、「尾のみ」など、さまざまなプロット スタイルを使用して、閾値パラメータを調整した後に体の部分を区別するのに役立ちます。
- 右側のパネルのツールを利用して、明るさまたはサイズを測定します(それぞれ「明るさ」ボタンと「定規」ボタンを使用)。カメラの距離が同じである限り、すべての設定を「デフォルト」として保存できます。
- しきい値パラメータを調整した後、ビデオが自動追跡の準備ができていることを確認します。最初のフレームに移動し、[ 自動 ]をクリックして追跡を開始します。この手順はリアルタイムで実行でき、ビデオのサイズとコンピューターのパフォーマンスによっては数分かかります。
- 自動追跡で身体の特徴に誤ってラベルが付けられている場合は、自動追跡をキャンセルし、新しい設定を入力して、プロセスを再開します。
- 追跡が完了したら、手動修正が必要かどうかを確認します。修正するには、中央のパネルを使用して選択または選択を解除し、右前 (RF)、右後方 (RH)、左前 (LF)、左後足跡 (LH) の位置、頭、鼻、体 (2 つのセグメントに分割)、および尾の位置 (4 つのセグメントに分割) を指定します。 [保存 ] ボタンを押して変更を保存します。
注意: すべてのボタンとほとんどのコマンドにはキーショートカットがあります(詳細については、関連するマニュアルを確認してください23)。ビデオのスクロールとキーボードショートカットの実行を容易にするために、プログラム可能なボタンとContour ShuttlePro V2のようなシャトルホイールを備えたハードウェアコントローラーを使用できます。 - [ 評価] をクリックして、追跡されたビデオから出力ファイルを生成します。選択した目的の出力(手順4.1を参照)によっては、この手順に数分かかる場合があります。
- すべてのグラフィカル出力データプロットが"Results"フォルダに保存されていることを確認します。すべての足の位置が一貫しているかどうかを確認できる「スタンストレース」などのグラフィカル出力のいくつかを調べて、追跡の精度を確認します。
- エラーが特定された場合は、追跡を手動で修正し (可能であれば、"Results" フォルダーを削除し、新しい設定で自動追跡を再度実行します)、 もう一度 [評価 ] コマンドをクリックします。
- MWソフトウェアによって生成されたすべての定量測定値がExcelスプレッドシートに保存され、「1.Info_Sheet」。数式区切りの Excel オプションがスクリプトと一致していることを確認します。小数点記号は "," で、桁区切り記号は ";" である必要があります。
- "MouseMultiEvaluate.m" スクリプトを使用して、すべての実行の測定値を分析用の新しいファイルにまとめます。
- まず、すべてのビデオのフォルダパスを含む.txtファイルを生成します(例:「ビデオファイル.txt」)。各行が 1 つのビデオに対応していることを確認します。
- 次に、コマンドラインに「MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')」と入力します。"ResultSummary.xls" という名前の Excel ファイルが作業ディレクトリに生成されます (GitHub リポジトリの例を参照してください)。
注意: 図2 は、記録された1匹の動物のビデオからMWソフトウェアによって取得されたグラフィック出力を表しています。
5. キネマティックデータ解析ワークフロー
- 手順 4.10 で生成された Excel シート (提供されている Python スクリプトを使用して処理するためのデータを含む) を、次の前提条件に従って編集します。
- 最初の列ヘッダーで、実験条件を指定します。グループ/条件名に続く各行に名前を付けます(同じグループの個人は同じ名前である必要があります)。最初のグループはコントロールまたはベースラインである必要があります(これはヒートマッププロットのステップ5.6でのみ必須です)。
- 2 番目の列で、動物 ID を指定します。この情報はプロットの生成には使用されませんが、これは必須です。
- 3 列目以降で、解析に使用するモーター パラメータを選択します。最初の行がパラメータの名前であることを確認します(これらの名前は後でプロットに表示されます)。
- アナコンダナビゲーターを開き、スパイダーを実行して提供されたPythonスクリプトを開きます。
注: すべてのスクリプトは Python 3.9.13 で開発され、Anaconda Navigator 2.1.4 の Spyder 5.2.2 で実行され、 Table of Materials と GitHub リポジトリ (ビデオの例、Excel のサンプル ファイル、FAQ ドキュメントなどの追加の資料が含まれています) で入手できます。Anaconda ナビゲーターの外部でスクリプトを実行することが可能です。ただし、このグラフィカルユーザーインターフェイスはよりユーザーフレンドリーです。 - 「Rawdata_PlotGenerator.py」を使用して、生データプロットを生成します。これにより、各パラメータを速度の関数として視覚化できます。
- Spyderで「Rawdata_PlotGenerator.py」を開き、[ 再生 ]ボタンをクリックしてコードを実行します。
- 自動ウィンドウで分析するExcelファイルとシート名を選択します。シート名が変更されていない場合は、「Sheet1」と記述します。
- 生データプロットがプロットコンソール(右上のパネル)に表示されます。プロットを保存するには、プロットコンソールの[画像を保存]または[すべての画像を保存]ボタンをクリックします。
- スクリプト「Residuals_DataAnalysis」を使用して、データ分析の残差を計算します。このスクリプトは、すべてのモーターパラメータの残差の計算を含むCSVファイルを生成します。
注:MWによって抽出された測定された歩行パラメータの多くは、速度によって異なります(たとえば、スイング速度、ステップ長、スタンス持続時間、スタンス真直度、歩行指数)。したがって、ベースライン実験の速度に対する個々のパラメータのベストフィット回帰モデルを実行し、この回帰モデルに関連して各実験グループの残差値を決定することをお勧めします。次に、データは残差正規化線26との差として表されます。- Spyderで「Residuals_DataAnalysis.py」を開き、[ 再生 ]ボタンをクリックしてコードを実行します。
- 自動ウィンドウで分析するExcelファイルとシート名を選択します。シート名が変更されていない場合は、「Sheet1」と記述します。
- CSV ファイルをデータと同じフォルダーに保存します。コントロール (またはベースライン) が Excel ファイルの最初のグループである必要があります。
- "PCA_PlotGenerator.py" スクリプトを使用して、主成分分析 (PCA) を実行します。
注:この教師なし次元削減法は、データのより簡潔な表現27、28、29を生成するために使用されます(図3A、B)。PCA スクリプトには、以下のステップが含まれます。データは最初にセンタリングとスケーリングによって前処理され、その後、PCAアルゴリズムが共分散行列を計算して変数間の相関を決定し、共分散行列の固有ベクトルと固有値を計算して主成分を特定します。最初の2つまたは3つの主成分は、それぞれ2Dまたは3Dプロットでデータを表現するために選択されます。プロット内の各ドットは動物に対応し、異なる抽象変数を表します。色分けされたドットは、特定のグループを区別するために使用されます。そのため、ドットのクラスターは、対応する個人が共有する同様の歩行パターンを反映しています。- Spyderで「PCA_PlotGenerator.py」を開き、[ 再生 ]ボタンをクリックしてコードを実行します。
- 自動ウィンドウで分析するExcelファイルとシート名を選択します。シート名が変更されていない場合は、「Sheet1」と記述します。
- PCA 2Dおよび3Dプロットがプロットコンソール(右上パネル)に表示されていることを確認します。各色は異なるグループを表し、凡例はプロットの横に表示されます。プロットを保存するには、プロットコンソールで 画像を保存 をクリックします。
- 「Heatmap_PlotGenerator.py」を使用してヒートマップを生成します。ヒートマップジェネレーターが、各モーターパラメーター27 のベースライングループ(またはコントロールグループ)と他のグループの間の統計的差異を示す表を作成することを確認します(図4)。各列は1つのグループを表し、各線は特定のモーターパラメータに関連しています。
注:統計分析は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定(正規分布の場合)またはクラスカル-ウォリス分散分析とそれに続くダンの事後検定(非正規分布の場合)を使用して実施されました。外れ値は分析から除外した。 p値はカラーコードで表され、赤と青の色合いはそれぞれコントロール(またはベースライン)に対する増加または減少を示します。色合いは統計的有意性を表し、暗い色は有意性が高く、明るい色は有意性が低いことを示します。 P < 0.001に対応します。**は P < 0.01に対応します。*は P < 0.05に対応する。白は変動がないことを示します。- Spyderで「Heatmap_PlotGenerator.py」を開き、[ 再生 ]ボタンをクリックしてコードを実行します。
- 自動ウィンドウで分析するExcelファイルとシート名を選択します。シート名が変更されていない場合は、「Sheet1」と記述します。
- 2番目の自動ウィンドウでデータのタイプ(生データまたは残差データ)を選択します。オプションが選択されていない場合、残差データがデフォルトになります。
- ヒートマップがプロットコンソール(右上のパネル)に表示されます。プロットを保存するには、プロットコンソールで 画像を保存 をクリックします。
注 : コントロール (またはベースライン) は、Excel ファイルの最初のグループである必要があります。
- 「Boxplots_PlotGenerator.py」を使用して箱ひげ図を生成します。このツールを使用すると、各グループのすべてのモーターパラメータの値の分布を表す箱ひげ図を生成できます(図5、図 6、 および図7)。
注: 各ボックスには中央値が中央線として含まれ、ボックスの下端と上端はそれぞれ 25% と 75% の四分位数を表します。ひげは、外れ値を除いた完全なデータセットの範囲を表します。外れ値は、それぞれ 25% および 75% の四分位数より下または上の四分位範囲の 1.5 倍の値として定義されます。- Spyderで「Boxplots_PlotGenerator.py」を開き、[ 再生 ]ボタンをクリックしてコードを実行します。
- 自動ウィンドウで分析するExcelファイルとシート名を選択します。シート名が変更されていない場合は、「Sheet1」と記述します。
- 2番目の自動ウィンドウでデータのタイプ(生データまたは残差データ)を選択します。オプションが選択されていない場合、残差データがデフォルトになります。
- 箱ひげ図がプロットコンソール(右上のパネル)に表示されます。プロットを保存するには、プロットコンソールの[画像を保存]または[すべての画像を保存]ボタンをクリックします。
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Representative Results
標準BMSシステムは、SCI14以降の総運動赤字を説明しています。その主観的な性質のために、他の定量的アッセイは一般にBMSと一緒に実行され、移動のより詳細で詳細な評価を生成します。しかし、これらのテストでは、脊髄回路がどのように機能を維持し、不完全なSCIに適応するかを理解する上で非常に重要な、ステップサイクル、ステッピングパターン、および前肢と後肢の協調に関する特定の情報を示すことができません。このセクションでは、MWツールボックスがSCI後の自発運動機能の回復を監視し、歩行行動に関する関連情報を追加するのにどのように役立つかを示します。
研究サンプルは、9週齢の雌C57Bl / 6Jマウスの2つのグループに分けられました:SCI実験グループ(n = 11)、動物は椎弓切除術を受け、その後、無限の地平線インパクターを使用してT9 / T10脊柱のレベルで中等度から重度の挫傷損傷を受けました( 材料の表を参照)。偽損傷対照群(n = 10)では、椎弓切除術のみが同じ列レベルで実施されました(図1、ステップ1)。SCIおよび偽傷害動物の自発運動行動を30日間監視した。MWテストは、手術前の慣れ日(ベースライン)と損傷後15日、22日、および30日(dpi)に実施されました(図1、ステップ2)。比較のために、マウスは手術前に並行して、1 dpi、3 dpi、7 dpi、14 dpi、21 dpi、および30 dpiでBMSテストを受けました(補足図3)。MWで得られたすべてのビデオを追跡した後、各実行後にいくつかのパラメータを視覚的に表現するグラフィック出力と、測定可能なすべてのモータパラメータを要約したキネマティック出力の2種類の出力ファイルが生成されました(図1、ステップ3およびステップ4)。
その結果、一連のPythonスクリプト( 材料表 とGitHubリポジトリのリンクを参照)を使用して、生データのプロットが得られました(図1のステップ5)。ほとんどのパラメータは動物の速度に影響されるため、損傷前のベースライン群の回帰モデルを、各条件の測定された残存値とともに実行しました(図1、ステップ6)。運動学的プロファイルと対照群(偽)と実験群(SCI)の有意差を確認するために、すべての運動学的パラメータ(合計79)を3次主成分分析(PCA)にかけ、データセット(合計33)を最もよく説明するモーターパラメータのコレクションを使用してヒートマップを生成しました(図1、ステップ7a、b)。最後に、SCI後に影響を受けた特定の運動パラメータを損傷前のベースラインと比較しました(図1、ステップ7c)。
図1:MWの分析ワークフローの概略図。 (1)動物は椎弓切除術(偽対照群)または椎弓切除術に続いて脊髄損傷(実験群)のために選択されます。(2)次に、動物は、損傷の前日と損傷後15、22、および30日目に行動アッセイを受けます。(3)MWは、(a)スタンストレース、歩行、ステッピングパターンなどのいくつかのパラメータのグラフィカルな視覚化、および(b)測定可能なすべてのモーターパラメータの運動学的要約の2種類の出力データを生成します。(4)すべての制御データと実験データは、MATLABの「MouseMultiEvaluate.m」スクリプトを使用して1つのファイルに集約されます。(5)Python用の「RawData_PlotGenerator」スクリプトは、測定可能なすべてのモーターパラメータが速度に応じてどのように変化するかを視覚的に表現します。パラメータが速度と相関しない場合は、(7)にスキップできます。ただし、SCI後のほとんどのパラメータは速度に強く依存するため、Python用の「Residual_DataAnalysis」スクリプトを使用してモデルを生成する必要があります(6)。各モーターパラメータの残差値を生成した後、データ分析が実行されます(7):(a)主成分分析(PCA)は、「PCA_PlotGenerator」スクリプトでパラメータの選択を使用して実行されます。(b)ヒートマップは「Heatmap_PlotGenerator」スクリプトを使用して作成され、異なるパラメータの条件間の統計的に有意な差を示します。c)SCIの後に変更されるいくつかの個々のパラメータは、「BoxPlot_PlotGenerator」スクリプトで評価されます。すべてのスクリプトは、材料目次とGitHubリポジトリのリンクで入手できます。スクリプトは赤で表示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
MWから収集されたグラフィカルな出力データから、SCI後のフットプリントの視覚的表示におけるよく知られた突然の変化を確認することができました。MWによって生成された「デジタルインク」アッセイでは、後肢の支持の欠如が検出され(図2A)、左右の後肢の両方のフットプリント面積の減少(図2B)とともに、15dpi以降に維持されました(データ示さず)。さらに、各ステップサイクル内で、MWは、スタンスフェーズ(すなわち、足の着地からリフトオフまでの時間)およびスイングフェーズ(すなわち、手足が地面から離れている時間)に関連するパラメータを計算する。そのように、MWは、立脚フェーズ23中の各脚およびそれらの足跡中心に対する身体の中心および軸の位置を考慮に入れた視覚的な「スタンストレース」を生成することができる。各動物について得られた全体的な スタンストレース は、いくつかのユニークな特徴を示しました(図2C)。このデータは、SCI後、後足のスタンストレースが短く、15dpi以降のタッチダウンとリフトオフの両方でランダムな足の位置が多いことを示しました(図2C)。
図2:追跡ビデオからMWソフトウェアによって取得された代表的なグラフィック出力 。 (A)「デジタルインク」は、1匹のSCI動物に対して、いくつかの時点で赤(右前)、黄色(左前)、緑(右後)、青(左後)の異なる色で各足を示す印刷物です。(B)15dpiでの1匹のSCI動物の左前部(LF)、左後部(LH)、右前部(RF)、および右後肢(RH)の足跡。(C)複数の時点での1匹のSCI動物の「スタンストレース」。脚の 1 つの AEP と PEP が最初のパネルに示されています。AEPとPEPの両方の「フットプリントクラスタリング」は、各ビデオの平均AEPまたはPEP座標の標準偏差に対応します。略語:dpi =傷害後の日数。cm =センチメートル;px = ピクセル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
次に、MWによって計算された後、キネマティック出力を分析しました(図3および図4)。データセットのより簡潔な描写を取得し、MWから得られた運動学的運動パラメータが、経時的にSCI動物に見られる自発運動障害を描写するのに十分であるかどうかをテストするために、PCA27が実施された。注目すべきことに、データの分散の40%は、すべての時点(15 dpi、22 dpi、および30 dpi)で一元配置分散分析(図3A、B)に基づいて、SCIを持つ動物のグループを他の動物から分離し、p値が0.001未満である最初のコンポーネント(PC1:40.1%)で説明できました。また、他の成分(PC2:11%、PC3:8.6%)の寄与も低かった。各コンポーネントに対する各モーターパラメータ寄与度に割り当てられた重みを補足図4に示します。さらに、データセットの分散は、時間の経過に伴う違い(つまり、15 dpi、22 dpi、および30 dpiの間)を反映するのに十分ではなく、前述の自発運動回復のプラトーを再現します14。全体として、これらの結果は、MWから得られた運動学的パラメータが、すべての時点でSCI後に観察された運動障害を強く説明していることを示しています。
図3:残差データ解析後にMWソフトウェアによって得られたすべての運動学的モータパラメータ(79)の主成分分析 。 (A)3成分PCA分析の3Dビジュアライゼーション。(B) 収集されたデータの 50% を表す円を含む 2D ビジュアライゼーション。分散の40%以上を説明したPC1では、15 dpi、22 dpi、および30 dpiのSCIグループは、一元配置分散分析によって決定された p値が0.001<、偽グループおよびベースライン(損傷前)と有意に異なっていました。個々の小さな点または三角形は、各動物の3つのビデオの平均を表し、大きな点または三角形は平均点を表します(条件ごとにn = 10〜11、ベースライングループの場合はn = 21)。各コンポーネントの寄与は、各軸に示されています。略語:dpi =傷害後の日数。SCI = 脊髄損傷;PC = 主成分。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
次に、データセットの記述の強さに基づいてモーターパラメータのコレクションが選択され(合計33)、ヒートマップが生成されました(図4)。実際、ほとんどの自発運動パラメータは、すべての時点でSCI後に劇的な変化を示しました(15 dpi、22 dpi、および30 dpi)、偽の損傷を受けた対照は30 dpiで有意な変化しか示しませんでした。偽群におけるこれらの変化は、おそらく後で議論されるテストの慣れによる、スイング速度の全体的な減少によって説明することができます。
SCI動物は、偽傷の対照よりもゆっくりと歩くことが注目されました(データは示されていません)。しかし、速度とは無関係に、15 dpiと30 dpiの両方で、SCI動物は、スタンス持続時間/ステッピング期間に関連する、より高いスイング時間、より低いスタンス持続時間、およびより低いデューティファクター指数を示しました23。これらの結果は、上記の脚の位置の変化は、他の動物モデル30、31、32に見られるようにSCIの特徴であり、ペースの変化とは関係がないことを示しています(図4)。
また、前肢と後肢の「位相」指数の有意な変化は観察されなかったため、左右の同期は影響を受けなかったことにも言及する必要があります10,23(図4)、左右の手足の間の無傷の結合を示しています。
さらに、SCIマウスは、前肢と後肢の両方で低い「立脚真直度」指数(変位/経路長)を示しました(図4)。このパラメータは、直線(0から1の範囲で線形トレースを示す)である理想的な条件に対してトレースがどれだけ直線的であるかを測定します27。したがって、これらの結果は、このグループでまっすぐ歩くことができないことを示しています。
各スタンスフェーズについて、MWは、足の着地(前端位置またはAEP)から始まり、リフトオフの前に終わる(後部極端位置、またはPEP)身体の振動の再構築を描画します( 図2Cの例を参照)。AEPとPEPの両方の「フットプリントクラスタリング」は、各ビデオの平均AEPまたはPEP座標の標準偏差を測定します。SCI動物は、すべての時点でAEPの後足 足跡クラスタリング の増加を示し、15dpiの偽損傷グループでのみ有意な効果が観察されました(図4)。これは、SCI動物がスイング後の着地時に後肢を正しく配置できなかったことを示しています。さらに、PEPの前足の「足跡クラスタリング」の減少と、PEPの後足の足跡のクラスタリングの減少が30dpiで見られました(図4)。これらの結果は、描かれた「スタンストレース」で観察されたものと一致しており、損傷後に前足の位置がより制限されることを示唆しています。
最後に、足の位置の変化に応じて、歩行戦略と足によって誘発される「圧力」に変化があり、その領域全体の平均輝度によって測定されます(図4)。
図4:残差データ解析後のMWによって得られた、手術前日と比較してSCI動物と偽損傷動物を比較する有意に変化した自発運動パラメータのコレクションを示すヒートマッププロット。 条件あたりn = 10-11;ベースライン群は、手術前日、n=21のすべての動物を含む。データは、一元配置分散分析による統計分析後の p値とそれに続くテューキーの事後検定(正規分布の場合)またはダンの事後検定(非正規分布の場合)で表されます。 P値はカラーコードで表され、赤と青の色合いはそれぞれベースラインに対する減少または増加を示します。色合いは統計的有意性を表し、暗い色は有意性が高いことを示し、明るい色は有意性が低いことを示します。P < 0.001;**P < 0.01;*P < 0.05白は変動がないことを示します。略語:dpi =傷害後の日数。SCI = 脊髄損傷;s =秒;ms =ミリ秒;平均 = 平均;F =フォア;H =後方;AEP =前方の極端な位置。PEP = 後端位置;LF = 左フォア;LH =左後肢;RF =右前;RH =右後後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
続いて、損傷のさまざまな段階(すなわち、15 dpi、22 dpi、および30 dpi)におけるSCI動物の自発運動障害を説明するのに最適な個々のパラメータを理解しようとしました。まず、後肢が完全な麻痺から部分的な機能に進行するにつれて、前肢と後肢の違いを示すステップサイクルパラメータを調べることから始めました(図5)。前肢の平均振球速度はベースライン(受傷前)に対して有意に増加したが、後肢振球速度は有意に変化しなかった(ベースラインより低くなる傾向はあったが)(図5A、B)。並行して、前肢の平均ステップ長は減少し、後肢に有意な変化はありませんでした(図5C、D)。当然のことながら、負傷したマウスは、前肢のスイング持続時間が減少し、15 dpi以降で後肢のスイングの持続時間が逆に増加しました(図5E、F)。まとめると、これらの結果は、前肢がより速いリズムを採用し、後肢サイクルごとに2つの前肢サイクルを採用したことを示しています。この2:1サイクル比は、ラット1,33におけるSCI半切開後に以前に説明されており、マウスで30dpi後に回復しない欠陥のある前肢-後肢協調の重要な側面を示しています。
図5:損傷の1日前のいくつかの時点での前足と後足のステップサイクルパラメータ、およびSCI動物では15 dpi、22 dpi、および30 dpi(n = 11)。 (A、B)ベースラインに対する前足と後足の平均スイング速度。(C,D)ベースラインに対する前足と後足の平均ステップ長。(E,F)ベースラインに対する前足と後足の平均スイング時間。箱ひげ図では、中央値は中央の線で表され、ボックスの下端と上端はそれぞれ25%と75%の四分位数を表します。ひげは、完全なデータセットの範囲を表します。外れ値は単一のドットで表されます。統計分析は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定(正規分布の場合)またはダンの事後検定(非正規分布の場合)で実施されました。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001.略語:dpi =傷害後の日数。SCI = 脊髄損傷;cm =センチメートル;s = 秒。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
MWソフトウェアは、特定の脚の組み合わせに割り当てられたフレームの割合を測定することによってマウスのステッピングパターンを計算することもでき、これは特定の歩行戦略の存在のプロキシとして機能します。低速では、無傷のマウスは、ほとんどのフレームが(足の位置に関係なく)片足のスイングを持つ「歩行歩行」を採用する傾向があります。滑走路で最も一般的な中速では、マウスはトロット歩行に変化し、最も代表的な構成は斜めの脚のスイングです。最後に、高速では、マウスは「ギャロップ歩行」を使用し、3本の脚が同時に揺れます23,34。他のあまり一般的ではない構成には、主に横脚のスイング(左脚または右脚の両方)で表されるペーシング歩行、および後肢または前肢の両方が同時にスイングする「バウンド/ホッピング歩行」が含まれます10。ただし、SCIのコンテキストでは、3脚スイングなどのこれらの構成の一部は、後肢の足の位置の欠陥を反映する可能性があるため、特定の歩行戦略(この場合はギャロップ)と正確に一致しないことに注意してください。そのため、脚部の構成のみを比較することで解析を簡略化しました。
残差分析を行った後、すべての時点で単一のスイングの減少を伴う斜めスイングの有病率の低下が見られました(図6A、B)。さらに興味深いことに、横方向のスイングの有病率が増加しました(図6C)。 ペーシングのような歩行 は、通常のC57BL / 6Jマウスでは一般的ではありません。しかし、ラット1のSCI半切開後に発生することはすでに報告されています。この同相パターンは、前肢または後肢 の位相指数 を変化させるほど一般的ではありませんでしたが( 図3を参照)、後肢から前肢への脊椎フィードバックの欠陥を示しています。さらに、おそらく後肢足底ステッピングが正しくないため、前肢/後肢スイングの有病率が自然に増加し(図6D)、3脚スイングが増加しました(図6E)。
図6:さまざまなステッピングスイング構成の平均インデックス 。 (A)斜め、(B)シングル、(C)ラテラル、(D)前/後、および(E)SCI動物(n = 11)のいくつかの時点での3脚スイングが示されています。箱ひげ図では、中央値は中央の線で表され、ボックスの下端と上端はそれぞれ25%と75%の四分位数を表します。ひげは、完全なデータセットの範囲を表します。外れ値は単一のドットで表されます。統計分析は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定(正規分布の場合)またはダンの事後検定(非正規分布の場合)で実行されました。**P < 0.01;P < 0.001略語:dpi =傷害後の日数。SCI = 脊髄損傷;NA = 適用されません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
最後に、MWから抽出できる別の読み出しは、明るさ/面積の尺度としての「圧力」です。速度が速いほど、地面との接触面積が減少し、圧力が増加するため、ベースラインデータの線形回帰を実行し、各条件の残差値を測定しました。前足への 圧力 はすべての時点で有意に増加したことが注目されましたが、左前足の変化はすでに30dpiで統計的有意性を失っていたため、この効果の強さは時間とともに減少する傾向がありました(図7A、C)。左側へのこの特定の影響は、この研究では脊髄の右側に優先的に影響を及ぼした可能性のある側方化損傷によって説明できます。それにもかかわらず、後足によって加えられる 圧力 は、予想通り、すべての時点で損傷したマウスで減少し、増加する傾向はありませんでした(図7B、D)。
図7:SCI動物におけるいくつかの時点で後足および前足によって誘発される圧力(n = 11)。 (A)左前足、(B)左後足、(C)右前足、(D)右後足によって惹起される圧力を、ベースライン(受傷前日)との相対差として示す。箱ひげ図では、中央値は中央の線として表され、ボックスの下端と上端はそれぞれ25%と75%の四分位数を表します。ひげは、完全なデータセットの範囲を表します。外れ値は単一のドットで表されます。統計分析は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定(正規分布の場合)またはダンの事後検定(非正規分布の場合)で実行されました。**P < 0.01;P < 0.001略語:dpi =傷害後の日数。SCI = 脊髄損傷;cm =センチメートル;px = ピクセル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
まとめると、この研究は、他のテストの制限のために無視されることがあるSCIによって引き起こされる運動障害を定量的に記述するためのMWシステムのパワーを示しています。さらに、それは、SCIの挫傷マウスモデルにおける時間の経過に伴う機能回復が間違いなく限られていることを強調しています。
補足図1:MWハードウェアコンポーネント。 (A)この設定は次のように分割されます:I - fTIR歩道。II - fTIRサポートベースとポスト。III-歩道の壁;IV - 45°ミラー;およびV-背景バックライト。(B)ベースUチャネルと歩道のサイドラインのクローズアップ画像。(C)歩道壁の設計。(D)45°ミラーセットアップのクローズアップ画像。略語:cm =センチメートル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:ピクセル強度と領域領域が示されているfTIRビデオの単一フレーム。 この調査でビデオ分析に使用されたボディ、背景、およびフットプリントのピクセル強度は、括弧で囲まれて赤で示され、すべて画像の鮮明さのために最適化されています。異なる領域間で適切な識別を得るために、光強度を調整する必要があります。本体と足跡の相対的な領域は、黄色の破線で示されます。面積とピクセル強度の両方をImageJ/FIJIで取得しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:(A)BMS合計スコアおよび(B)本試験で分析したマウスのサブスコア(n=10-11)。 すべてのデータはSEM±平均値として表した。 統計分析は、二元配置反復測定ANOVAとそれに続くボンフェローニの事後検定で実行されました。P < 0.001略語:BMS =バッソマウススケール。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:各コンポーネントに対する各モーターパラメータ寄与度の割り当て重量。 PCAの(A)PC1、(B)PC2、および(C)PC3の残差解析後の各モーターパラメータの割り当て重量(合計79)。カットオフラインは0.04ミリ秒と-0.04で描画されました。略語:ms =ミリ秒;平均 = 平均;SD = 標準偏差F =フォア;H =後方;AEP =前方の極端な位置。PEP = 後端位置;LF = 左フォア;LH =左後肢;RF =右前;RH =右後肢;押す=圧力。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、SCI後の自発運動行動を解析することにより、マウスウォーカー法の可能性を実証します。これは、他の標準的なテストでは見逃されるステップ、フットプリント、および歩行パターンの特定の変化に関する新しい洞察を提供します。MW パッケージの更新バージョンを提供するだけでなく、提供されている Python スクリプトを使用してデータ分析ツールについても説明します (手順 5 を参照)。
MWは大規模なデータセットと高次元の自発運動プロセスを反映する運動学的パラメータのコレクションを生成するため、PCAが採用されました。実際、PCAは、これに似た他のキネマティックデータセットで広く使用されています27,35,36(図3)。この次元削減手法は、最小限の仮定でシンプルで堅牢な方法であり、キネマティックプロファイルを定量的に識別し、それらを制御条件またはベースライン条件と迅速に区別することができます。さらに、ベースラインと統計的に異なるパラメータを迅速に特定するためにヒートマップが生成され(図4)、後で個別に分析できるようになりました(図5、図6、および図7)。
続いて、MWから抽出できる特定のパラメータが、協調などのSCI動物に見られる堅牢な自発運動障害をどのように示しているかを示しました。調整とは、各手足を組織的に使用してタスクを実行する能力です。多くの場合、調整は、はしご16,17でのミス/ポジティブイベントの数またはロータロッド15に費やされた時間によって間接的に測定されます。明らかに、MWは、ステップサイクル中の足の位置の変動性(フットプリントパターン)と「スタンス真直度」インデックス27の両方を計算します。両方のパラメータが傷害によって有意に影響されることが示された(図4)。
さらに、MWにより、ユーザーは時間力学に関連するパラメータを抽出することができます。SCI動物では、スイング/スタンス持続時間の有意な混乱が見られ(図4)、SCIマウスは前肢のステップサイクルを加速することで後肢のサポートの喪失を補い、前肢のステップ長と平均スイング時間を短縮することがわかりました(図5)。この効果は、前足がより多くの体重に耐えることを強いる重心の移動に関連している可能性があります1。同様に、これは、前肢と後肢のCPG間の相乗的相互作用の原因となる長い上行固有脊髄経路の喪失に起因する可能性があります1,9,32、最終的には前肢と後肢のリズムの解離につながります。
ステッピング歩行の特徴は、自発運動ネットワーク1、34のモジュラー構成を説明することができる。ステップパターンは、この場合に採用された歩行戦略の直接の代理ではありませんが23、いくつかの重要な観察結果を引き出すことができます。SCIマウスのステッピングパターンに重要な変化が見られました(図6)。負傷した動物は横方向のスイング(ペーシングのような歩行)を採用し始め、斜めのスイングも減少しました。これらの適応は、前肢と後肢を調整する試みに関連しているようであり、再び損傷の下と上の脊髄トラック間の解離を示していますが、これは回復しません1,9,32。
SCI後の限られた回復は、平均圧力によって測定された後肢の筋力の低下によっても確認されました(図7)。その結果、前肢はより多くの体重を支えることを余儀なくされ、それは圧力を増加させる。ここでは筋ダイナミクスに関連する多くのパラメータ(すなわち、屈筋と伸筋の協調7,21)は分析されていませんが、この定量的な測定は、四肢の支持量を直接読み取ることができます。
このMW分析は、手足の回転、足の配置、尾の位置、およびステッピングミスを測定する標準のBMSテストと組み合わせることもできます。一般に、SCIマウスは4〜5の最大スコアを達成し、最大サブスコアは3であり、これは、時折から頻繁なステップを実行できるが、ほとんどが足のリフトオフおよび/またはタッチダウン14で回転することを意味する(補足図2)。スイング段階での四肢の非平行な位置が足の座標に影響を与える可能性があるため、後肢のAEP値がSCIグループで大幅に変化した理由が明らかになります。さらに、BMSでは、トランクは通常、バットダウンやホッピング14など、ステッピングを妨げるインスタンスまたはイベントが存在するため、重度として分類されます。 バットダウン行動やステッピングを妨げる事例を定量化することはできませんでしたが、MWでの制限された後足ステッピングが検出され、スイング時間が長くなり(図5F)、3つのレッグスイングが増加し(図6E)、圧力が低下しました(図7B-D)。さらに、前後のスイングの有意な増加が観察されました(図6D)。この行動症状には2つの補完的な説明があります。まず、BMSテストですでに観察されているホッピングのような歩行を測定しました。ただし、この動作は、両方の後肢に正しい足底の踏み込みがなく、足の抗力や背側の配置につながる可能性もあります。全体として、これらの観察結果は、SCI後に体幹の安定性がひどく損なわれるという主張を支持しています。最後に、BMSテストで5を超えるスコアを獲得するための要件の1つは調整14であり、このためには、テスト中に評価者が少なくとも3つのアクセス可能なパスを観察する必要があります。そのうち、3つ以上のアクセス可能なパスのうち2つは、調整されたもの(つまり、前肢と後肢が交互)として分類される必要があります。MWデータから、客観的な測定値、スタンス真直度指数、およびフットプリントクラスタリングを抽出することができ、動物の速度やアクセス可能なパスとは無関係に協調を直接定量化します(図4)。さらに、手足間の交代は、ステッピング戦略を測定することによって客観的に定量化することができます(図6)。これらのパラメータは、SCIマウスが一貫して直線で歩くことができず、後肢を置き忘れることを明確に示しています。
MWツールボックスは、SCI後の自発運動障害を研究するための有用な戦略ですが、その限界のいくつかを考慮する必要があります。まず、時点間の画像特徴が維持されるように、取得パラメータ(すなわち、カメラ位置、焦点、光強度)との一貫性を保つことが重要です。第二に、繰り返しが慣れにつながり、それが今度は速度の低下につながることに気づきました。これはまた、飼育/グルーミング行動の増加に貢献し、途中で停止しました。負傷した動物の場合、歩道の壁に寄りかかる傾向もあり、走行途中で停止する回数が増えました。これらの行動は自発運動評価の一部ではないため、考慮してはなりません。優先的に、研究者は動物が頭をまっすぐに向けて継続的に歩くビデオを選択する必要があります。この研究の結果に対するこれらの行動の影響を打ち消すために、マウスを少なくとも4回または5回連続して記録し、歩道に沿ってどちらの方向にも走らせました。その後、記録された3つの最高のランが選択され、ImageJ/ FIJI 24 (180°回転)で同じ方向に調整されました。したがって、各動物は、時点ごとに一緒にプールされた3つの実行の平均によって表されました。条件ごとの動物数が多いほど、予想される変動性が低下する可能性もあります。さらに、この自発運動試験は、追跡システムが微調整された自発運動評価のために設計されているため、足底ステッピングが達成された後にのみ推奨されることに注意する必要があります。この研究では、15 dpi以前は、足の抗力の増加と足底の配置が正しくないため、MWテストは自発運動評価に有利ではなく、追跡に影響を与える可能性があることが指摘されました(データは示されていません)。最後に、一部のパラメーター ( フットプリント クラスタリングなど) は、生成された回帰モデルによって行われる外挿に非常に敏感です。したがって、コードはそれに応じて調整されました(GitHubリンクのスクリプトのドキュメントを参照してください)。
全体として、MWはSCI動物を偽損傷した対照から強く区別できることが示され、MWはSCI後の自発運動障害を研究するための貴重な方法として確立されたテストと提携することもできます。さらに、提供されたPythonスクリプトを使用して、MWデータセットから定量的な出力を簡単に生成できることが示されました。これらのツールは、元のMW出力ファイルを補完し、分析の種類とグラフィック表現の観点から研究者の目標を達成するために変更できる、豊富で多様な定量的およびグラフィカルな出力のセットを生成するための効率的な実験パイプラインを提供します。
このツールボックスは、脊髄損傷に関連するものだけでなく、他の運動関連疾患または運動機能障害を研究するための貴重な方法です。Skarlatouら10 は、発生中の重要な足場タンパク質であるアファジンの特定の変異が、2つの中心管を生成することによって脊髄に異常な表現型を引き起こすことをすでに実証しました。この欠陥は、左右の四肢交代の喪失と、 ホッピング歩行に典型的な四肢の同期のより高い有病率をもたらしました。Stauchら10 はまた、このタイプのシステムがユーザーのニーズに応じて適応できることを示しました。この場合、ラットパーキンソン病モデルにおける特定の行動障害の研究に適用されました。したがって、このツールボックスは、運動障害が予想されるさまざまなモデルで幅広いアプリケーションを備えており、現場ですでに確立されている動作プロトコルと組み合わせることができます。
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Disclosures
著者は、競合する経済的利益がないことを宣言しています。
Acknowledgments
著者らは、ローラ・タッカーとナタサ・ロンカレビッチの原稿に対するコメントと、メディチーナ分子ジョアン・ロボ・アントゥネス研究所のげっ歯類施設による支援に感謝します。著者らは、プレミオスサンタカーサニューロシエンシアス-脊髄損傷研究のための賞メロエカストロ(MC-36 / 2020)からL.S.およびC.S.M.への財政的支援に感謝したいと思います。本研究は、Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020)、iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 および UIDP/04462/2020)、および LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) から C.S.M. L.S. への支援は、CEEC個人主任研究者契約(2021.02253.CEECIND)の支援を受けた。A.F.I.は、FCT(2020.08168.BD)の博士課程のフェローシップによってサポートされました。AMMは、FCTの博士フェローシップ(PD / BD / 128445 / 2017)によってサポートされました。IMは、FCTのポスドクフェローシップ(SFRH/BPD/118051/2016)の支援を受けました。D.N.S.は、FCTの博士研究員(SFRH/BD/138636/2018)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
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