Summary
Hier presenteren we een protocol voor het extraheren van gif uit Trichogramma dendrolimi met behulp van een kunstmatige gastheer gemaakt met polyethyleenfilm en aminozuuroplossing.
Abstract
Sluipwespen zijn een diverse groep vliesvleugelige insecten die van onschatbare waarde zijn voor de biologische bestrijding van plagen. Om succesvol parasitisme te garanderen, injecteren sluipwespen gif in hun gastheren om de immuniteit van hun gastheren te onderdrukken, de ontwikkeling, het metabolisme en zelfs het gedrag van gastheren te moduleren. Met meer dan 600.000 geschatte soorten overtreft de diversiteit van sluipwespen die van andere giftige dieren, zoals slangen, kegelslakken en spinnen. Sluipwespengif is een onderbelichte bron van bioactieve moleculen met potentiële toepassingen in ongediertebestrijding en geneeskunde. Het verzamelen van sluipwespif is echter een uitdaging vanwege het onvermogen om directe of elektrische stimulatie te gebruiken en de moeilijkheid bij dissectie vanwege hun kleine formaat. Trichogramma is een geslacht van kleine (~0,5 mm) ei-sluipwespen die veel worden gebruikt voor de biologische bestrijding van lepidoptera-plagen in zowel de landbouw als de bossen. Hier rapporteren we een methode voor het extraheren van gif uit T. dendrolimi met behulp van kunstmatige gastheren. Deze kunstmatige gastheren worden gemaakt met polyethyleenfilm en aminozuuroplossingen en vervolgens geënt met Trichogramma-wespen voor parasitisme. Het gif werd vervolgens verzameld en geconcentreerd. Deze methode maakt de extractie van grote hoeveelheden Trichogramma-gif mogelijk, terwijl besmetting van andere weefsels veroorzaakt door dissectie wordt vermeden, een veelvoorkomend probleem in dissectieprotocollen voor gifreservoirs. Deze innovatieve aanpak vergemakkelijkt de studie van Trichogramma-gif en maakt de weg vrij voor nieuw onderzoek en mogelijke toepassingen.
Introduction
Sluipwespen zijn parasitaire vliesvleugelige insecten die belangrijke bronnen zijn voor biologische bestrijding1. Er is een grote verscheidenheid aan sluipwespen, met naar schatting meer dan 600.000 soorten2. De diversiteit van sluipwespen is veel groter dan die van andere giftige geleedpotigen, zoals slangen, kegelslakken, spinnen, schorpioenen en bijen. Gif is een belangrijke parasitaire factor bij sluipwespen. Voor succesvol parasitisme wordt gif in de gastheer geïnjecteerd, waardoor het gedrag, de immuniteit, de ontwikkeling en het metabolisme van de gastheer worden gemoduleerd. Bovendien vertoont het gif van sluipwespen een opmerkelijke diversiteit in zijn moleculaire structuren, doelen en functies, wat een weerspiegeling is van complexe co-evolutie met hun gastheren. Parasitair gif is dus een waardevolle en ondergewaardeerde hulpbron van actieve moleculen voor insectendodende of medische doeleinden4. In tegenstelling tot het gif van slangen, kegelslakken, spinnen, schorpioenen en bijen, kan sluipwespengif niet worden verzameld door directe stimulatie of elektrische stimulatie5. De huidige methode om sluipwespengif te extraheren is het ontleden van het gifreservoir. Sluipwespen zijn echter vaak klein en de dissectie van sluipwespen vereist hoge technische vaardigheden. Daarom, als we een manier kunnen vinden om het gif van sluipwespen efficiënt en gemakkelijk te verzamelen, zal het een grote hulp zijn om het gif van sluipwespen te onderzoeken.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) is een geslacht van sluipwespen uit de familie sluipwespen (~0,5 mm). Deze wespen behoren tot de meest gebruikte biologische bestrijdingsmiddelen, met name gericht op eieren van verschillende lepidoptera-plagen in zowel de landbouw als de bossen. T. dendrolimi, een van de meest gebruikte Trichogramma-soorten in China, is bijvoorbeeld op grote schaal toegepast om een verscheidenheid aan land- en bosbouwplagen te bestrijden, zoals Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis en Chilo suppressalis. Eerdere studies toonden aan dat Trichogramma-wespen hun eieren in kunstmatige gastheren konden injecteren7. Kunstmatige gastheren kunnen worden gemaakt met materialen zoals was8, agar9, Parafilm10 en plastic film11. De oplossing in kunstmatige gastheren die voldoende ovipositie voor Trichogramma induceert, kan eenvoudig zijn, zoals aminozuren of anorganische zouten12. Op basis van de eigenschap dat T. dendrolimi kunstmatige gastheren kan parasiteren, biedt deze studie een nieuwe methode om gif uit sluipwespen te extraheren met behulp van kunstmatige gastheren. Deze aanpak is gericht op het aanpakken van de tekortkomingen van lage opbrengst, lage zuiverheid en gevoeligheid voor verontreiniging in de huidige extractietechnieken. Door deze methode te gebruiken, kan een grote hoeveelheid zeer zuiver gif uit T. dendrolimi worden geëxtraheerd, wat voldoet aan de behoeften van wetenschappelijk onderzoek en screening van bioactieve moleculen voor insectendodende of medische doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insectenkweek
- Voer Corcyra cephalonica op maïsmeel bij een temperatuur van 26 ± 1°C en een relatieve luchtvochtigheid van 40% ± 10%.
- Kweek de T. dendrolimi-stam uit de Jilin-insect binnenshuis met de eieren van Corcyra cephalonica als gastheer. Voer wespenvolwassenen 10% sucrosewater in Drosophila-buizen bij een temperatuur van 26 ± 1 °C, relatieve vochtigheid van 70% ± 10%, licht (L): donker (D) periode van 14 uur: 10 uur.
2. Bereiding van eierkaarten van polyethyleen plastic folie
- Neem een polyethyleen plastic folie met een lengte van 16 cm, een breedte van 12 cm en een dikte van 20 μm. Druk 30 halfronde uitsteeksels met een diameter van 2-3 mm en een hoogte van ongeveer 3 mm uit met behulp van een glazen slijpstaaf volgens de standaard PCR-plaatlay-out van 96 gaten.
NOTITIE: Het proces van het uitpersen van 30 halfronde uitsteeksels met behulp van een glazen slijpstaaf moet worden gedaan met inachtneming van de druk, omdat een te harde pers het plastic zal doorboren en de geëxtraheerde giftige slijpstaaf zal verontreinigen. - Desinfecteer de geperste polyethyleen plastic folie door beide zijden gedurende 1 uur bloot te stellen aan ultraviolet (UV) licht.
- Voeg een kleine hoeveelheid 10% polyvinylalcohol toe aan het halfronde oppervlak.
3. Trichogramma dendrolimi parasitisme
- Plaats na CO2 -anesthesie T. dendrolimi vrouwelijke wespen in een verzameldoos en het aantal wespen was ~ 3000.
- Plaats de bolle kant van de filmeierkaart in de richting van de opvangbak en zet de randen vast met een elastiekje.
- Voeg 4 μl aminozuuroplossing (6 g/l leucine, 4 g/l fenylalanine, 4,25 g/l histidine) toe aan elk halfcirkelvormig uitsteeksel. Bedek het met een platte polyethyleen plastic folie van 16 cm lang en 12 cm breed. Gebruik een elastiekje om de opvangbak goed af te dekken met twee vellen plastic.
- Laat T. dendrolimi wespen 4-8 uur vrij parasiteren en geef 10% sucrosewater door bevochtigd katoen.
4. T . dendrolimi gif verzamelen
- Verkrijg de geparasiteerde aminozuuroplossing uit het binnenste uitsteeksel van de kunstmatige eikaart en breng deze over naar de dop van buisjes van 1,5 ml.
- Bedek de buisdop met een nylon net van 10 μm met een diameter van 25 mm, maak het nylon net en de centrifugebuis stevig vast. Zet de centrifugebuis rechtop voor een korte centrifugatie met behulp van een minicentrifuge (1360 x g) gedurende 10 s en vang de gefilterde oplossing (~100 μL T. dendrolimi-gif ) op.
- Meet de concentratie van het opgevangen T. dendrolimi-gif met behulp van een Bicinchoninic acid (BCA)-testkit (Tabel met materialen).
- Bewaar het gif bij -80 °C voor verdere analyses.
5. SDS-PAGE-analyses
- Voeg 30 μL T. dendrolimi gif toe aan 10 μL 4x natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) monsterlaadbuffer (Materiaaltabel) en verwarm gedurende 10 minuten op 95 °C.
- Voer SDS-PAGE gel uit op 130 V gedurende 120 min.
- Kleurs en ontkleuring van de SDS-PAGE-gel met behulp van het eiwitkleuringsapparaat (Materiaaltabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eiwitconcentratie van representatieve gifmonsters werd gemeten met behulp van de eiwittestkit, met de resultaten weergegeven in tabel 1. De resultaten toonden aan dat de concentratie van gifeiwit die met deze methode werd verzameld, varieerde van 0,35 μg/μL tot 0,46 μg/μL, terwijl de negatieve controle van de aminozuuroplossing slechts een eiwitconcentratie had van 0,03 μg/μL tot 0,05 μg/μL. De concentratie gifeiwit die met deze methode wordt verzameld, is veel hoger dan die van negatieve controle, wat aantoont dat deze methode het gif van sluipwespen goed kan verzamelen. Bovendien is er geen specifieke correlatie tussen parasitismetijd en concentratie, omdat verschillende partijen sluipwespen een verschillende vitaliteit kunnen hebben.
Bovendien werd het gif van T. dendrolimi geanalyseerd door SDS-PAGE, waarbij een gifeiwitbereik werd onthuld dat zich uitstrekte van minder dan 10 kDa tot meer dan 130 kDa in figuur 1. Toen de negatieve controle van aminozuren echter werd geanalyseerd door SDS-PAGE, bleek dat er geen eiwit in zat (aanvullende figuur 1), wat ook bewees dat het eiwit dat met deze methode werd verzameld inderdaad het gifeiwit van sluipwespen was.
Figuur 1: SDS-PAGE analyse van T. dendrolimi gif eiwit. Banen 1-2: de geladen hoeveelheden gifeiwit waren respectievelijk 8 μg en 10 μg. M: Markering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Monster | De tijd van het parasitisme (h) | Concentratie (μg/μL) | |
| Gif | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| Beheersen | 1 | NP | 0.04 |
| 2 | NP | 0.03 | |
| 3 | NP | 0.05 | |
| 4 | NP | 0.03 | |
| 5 | NP | 0.03 | |
Tabel 1: De concentratie-informatie van het gif en de controle. De eiwitconcentratie van representatieve gif- en controlemonsters werd gemeten met behulp van de BCA-eiwittestkit. Controle: de niet-geparasiteerde controles. NP: geen parasitisme
Aanvullende figuur 1: SDS-PAGE-analyse van controle en gif. Controle: de niet-geparasiteerde controle. Gif: de geladen hoeveelheden gifeiwit waren 10 μg. M: Marker. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een methode om gif uit T. dendrolimi te extraheren met behulp van kunstmatige gastheren. De belangrijkste punten in het experiment met het verzamelen van gif zijn als volgt. (1) Tijdens de bereiding moet T. dendrolimi snel worden verdoofd met een passende concentratie CO2 . Als de CO2 - concentratie te laag is, is deze onvoldoende om de Trichogramma snel te verdoven. Omgekeerd, als de concentratie te hoog is, kan Trichogramma afsterven, waardoor hun vermogen om de kunstmatige gastheer te parasiteren afneemt. (2) De steriliteit van de aminozuuroplossing moet worden gewaarborgd, aangezien verontreiniging van de aminozuuroplossing een negatieve invloed kan hebben op de efficiëntie van het parasitisme. (3) Het parasiteren van kunstmatige eierkaarten moet worden uitgevoerd in donkere omstandigheden om parasitisme te bevorderen. (4) Aanbevolen wordt om ofwel rechtstreeks stroomafwaarts experimenten uit te voeren ofwel de monsters in te vriezen om de activiteit van het gif te waarborgen en afbraak te voorkomen.
Het wordt aanbevolen om parasitering te beoordelen door afgezette eieren te visualiseren. Als de afgezette eitjes niet onder de microscoop worden waargenomen, is er mogelijk geen gif geëxtraheerd. De beperking van de techniek is dat er een groot aantal sluipwespen voor nodig is. Voor een enkele gifextractie zijn ongeveer 3.000 sluipwespen nodig, wat de werklast verhoogt.
De vorige methode om sluipwespengif te extraheren was het ontleden van het gifreservoir. Sluipwespen zijn echter klein; Trichogramma is bijvoorbeeld minder dan 1 mm lang. Niet alleen zijn de technische vereisten voor het ontleden van gifreservoirs hoog, maar ook contaminatie van andere weefsels tijdens dissectie komt vaak voor. De nieuwe methode met behulp van kunstmatige gastheren kan de efficiëntie van gifextractie verbeteren en besmetting van andere weefsels veroorzaakt door dissectie voorkomen.
Deze methode kan ook worden uitgebreid naar andere sluipwespen. Zo kunnen oöcyten van polyethyleenplastic film met een mengsel van zoutionen en aminozuren worden gebruikt om T. neustadt-gif te verkrijgen, en kunstmatige waseieren met KCl-MgSO4-oplossing kunnen worden gebruikt om T. pretiosum-gif te verkrijgen. Naast Trichogramma is gemeld dat Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 en Habrobracon hebetor10 kunstmatige gastheren kunnen parasiteren. Door gebruik te maken van de eigenschappen van deze sluipwespen om kunstmatige gastheren te parasiteren, kunnen vergelijkbare methoden voor het extraheren van gif worden ontwikkeld.
Sluipwespengif is een onderbelichte bron van biologische moleculen met potentiële ongediertebestrijding en medische toepassingen. Onlangs zijn de mogelijke toepassingen van parasitair gif in de farmacologie en de landbouw erkend14,15. Farmacologisch gezien hebben veel componenten in parasitoïde gif brede potentiële toepassingsmogelijkheden bij het optimaliseren van immunotherapie, het behandelen van trombotische aandoeningen en het vinden van sjablonen voor nieuwe antibiotica. In de landbouw kunnen sommige componenten in parasitair gif worden gebruikt als biologische bestrijdingsmiddelen om de ontwikkeling, voortplanting en immuniteit van ongedierte te reguleren om het doel van effectieve bestrijding van ongedierte te bereiken15. Het gebrek aan efficiënte methoden voor het extraheren van gif beperkt echter vaak het onderzoek naar het gif van sluipwespen, met name kleine sluipwespen zoals Trichogramma. Dit artikel biedt een efficiënte methode om het gif van Trichogramma te extraheren, wat een methode biedt voor de vervolgstudie van Trichogramma-gif, zoals de identificatie van eiwitsamenstelling en giffunctie. Daarnaast kan deze methode ook worden gebruikt als referentie voor ander onderzoek naar sluipwespengif en biedt het ondersteuning bij het bevorderen van de screening van bioactieve moleculen uit sluipwespengif voor insecticide of medische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen en geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
We erkennen financiële steun van de Natural Science Foundation van de provincie Hainan (subsidie nr. 323QN262), de National Natural Science Foundation of China (subsidie nr. 31701843 en 32172483), het Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund (subsidienr. CX(22)3012 en CX(21)3008), de "Shuangchuang Doctor" Foundation van de provincie Jiangsu (subsidie nr. 202030472) en het startfonds van de Nanjing Agricultural University (subsidie nr. 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568 (1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
