Summary
Her presenterer vi en protokoll for å trekke ut gift fra Trichogramma dendrolimi ved hjelp av en kunstig vert laget med polyetylenfilm og aminosyreoppløsning.
Abstract
Parasitoid veps er en mangfoldig gruppe hymenopteran insekter som tjener som uvurderlige ressurser for skadedyrsbekjempelse. For å sikre vellykket parasitisme injiserer parasitoide veps gift i vertene sine for å undertrykke vertenes immunitet, modulere vertenes utvikling, metabolisme og til og med oppførsel. Med over 600 000 estimerte arter, overgår mangfoldet av parasitoide veps det for andre giftige dyr, som slanger, kjeglesnegler og edderkopper. Parasitoid vepsegift er en underutforsket kilde til bioaktive molekyler med potensielle anvendelser innen skadedyrsbekjempelse og medisin. Imidlertid er innsamling av parasitoid gift utfordrende på grunn av manglende evne til å bruke direkte eller elektrisk stimulering og vanskeligheten med disseksjon på grunn av deres lille størrelse. Trichogramma er en slekt av små (~ 0,5 mm) egg parasitoid veps som er mye brukt for biologisk kontroll av lepidopteran i både jordbruk og skog. Her rapporterer vi en metode for å trekke ut gift fra T. dendrolimi ved hjelp av kunstige verter. Disse kunstige vertene er laget med polyetylenfilm og aminosyreløsninger og deretter inokulert med Trichogramma veps for parasitisme. Giften ble deretter samlet og konsentrert. Denne metoden muliggjør ekstraksjon av store mengder Trichogramma-gift samtidig som man unngår forurensning fra andre vev forårsaket av disseksjon, et vanlig problem i giftreservoardisseksjonsprotokoller. Denne innovative tilnærmingen letter studiet av Trichogramma-gift , og baner vei for ny forskning og potensielle applikasjoner.
Introduction
Parasitoide veps er parasittiske hymenopteraninsekter som er viktige ressurser for biologisk kontroll1. Det finnes et bredt utvalg av parasitoide veps, med over 600 000 estimerte arter2. Mangfoldet av parasitoide veps overstiger langt det for andre giftige leddyr, som slanger, kjeglesnegler, edderkopper, skorpioner og bier. Gift er en viktig parasittisk faktor i parasitoide veps. For vellykket parasitisme injiseres gift i verten, modulerer vertens oppførsel, immunitet, utvikling og metabolisme3. Videre viser giften til parasitoidveps bemerkelsesverdig mangfold i molekylære strukturer, mål og funksjoner, noe som gjenspeiler kompleks koevolusjon med vertene sine. Dermed er parasitoid gift en verdifull og undervurdert ressurs av aktive molekyler for insekticide eller medisinske formål4. I motsetning til giftet til slanger, kjeglesnegler, edderkopper, skorpioner og bier, kan parasitoid vepsegift ikke samles inn ved direkte stimulering eller elektrisk stimulering5. Den nåværende metoden for utvinning av parasitoid vepsegift er å dissekere giftreservoaret. Imidlertid er parasitoidveps ofte små, og disseksjon av parasitoidveps krever høye tekniske ferdigheter. Derfor, hvis vi kan finne en måte å samle giftet til parasitoidveps effektivt og praktisk, vil det være til stor hjelp å undersøke giftet til parasitoidveps.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) er en slekt av små (~0,5 mm lange) parasitoide veps6. Disse vepsene er blant de mest brukte biokontrollmidlene, spesielt rettet mot egg av ulike lepidopteran i både jord og skog. For eksempel har T. dendrolimi, en av de mest brukte Trichogramma-artene i Kina, blitt mye brukt til å kontrollere en rekke landbruks- og skogbruksskadedyr, som Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis og Chilo suppressalis. Tidligere studier viste at Trichogramma veps kunne injisere eggene sine i kunstige verter7. Kunstige verter kan lages ved hjelp av materialer som voks8, agar9, Parafilm10 og plastfilm11. Løsningen i kunstige verter som induserer tilstrekkelig oviposisjon for Trichogramma kan være enkel, for eksempel aminosyrer eller uorganiske salter12. Basert på karakteristikken at T. dendrolimi kan parasitere kunstige verter, gir denne studien en ny metode for å trekke ut gift fra parasitoidveps ved hjelp av kunstige verter. Denne tilnærmingen tar sikte på å løse manglene ved lavt utbytte, lav renhet og følsomhet for forurensning i dagens ekstraksjonsteknikker. Ved å bruke denne metoden kan en stor mengde gift med høy renhet fra T. dendrolimi ekstraheres, som tilfredsstiller behovene til vitenskapelig forskning og screening av bioaktive molekyler for insekticide eller medisinske formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insekt oppdrett
- Fôr Corcyra cephalonica på maismel ved en temperatur på 26 ± 1 ° C og en relativ fuktighet på 40% ± 10%.
- Breed T. dendrolimi stamme fra Jilin insekt innendørs ved hjelp av egg av Corcyra cephalonica som verter. Fôr veps voksne 10% sukrosevann i Drosophila-rør ved en temperatur på 26 ± 1 ° C, relativ fuktighet på 70% ± 10%, lys (L): mørk (D) periode på 14 timer: 10 timer.
2. Fremstilling av eggkort av polyetylenplastfilm
- Ta en polyetylenplastfilm med en lengde på 16 cm, en bredde på 12 cm og en tykkelse på 20 μm. Trykk ut 30 halvcirkelformede fremspring med en diameter på 2-3 mm og en høyde på ca. 3 mm ved hjelp av en glassslipestang i henhold til standard PCR-plateoppsett på 96 hull.
MERK: Prosessen med å presse ut 30 halvcirkelformede fremspring ved hjelp av en glassslipestang må gjøres med tanke på trykket fordi for hardt trykk vil punktere plasten og forurense den ekstraherte giftige slipestangen. - Desinfiser den pressede polyetylenplastfilmen ved å utsette begge sider for ultrafiolett (UV) lys i 1 time.
- Tilsett en liten mengde 10% polyvinylalkohol til den halvcirkelformede overflaten.
3. Trichogramma dendrolimi parasittisme
- Etter CO2 -anestesi, plasser T. dendrolimi kvinnelige veps i en innsamlingsboks, og antall veps var ~ 3000.
- Plasser den konvekse siden av filmeggkortet mot innsamlingsboksen og fest kantene med en gummistrikk.
- Tilsett 4 μL aminosyreoppløsning (6 g/l leucin, 4 g/l fenylalanin, 4,25 g/l histidin) til hvert halvsirkelformet fremspring. Dekk den med en flat polyetylenplastfilm 16 cm lang og 12 cm bred. Bruk et gummibånd til å dekke oppsamlingsboksen tett med to plastark.
- La T. dendrolimi veps parasitere fritt i 4-8 timer og gi 10% sukrosevann gjennom fuktet bomull.
4. Samle T. dendrolimi gift
- Hent den parasitiserte aminosyreoppløsningen fra det indre fremspringet av det kunstige eggkortet og overfør det til hetten på 1,5 ml rør.
- Dekk rørhetten med et 10 μm nylonnett med en diameter på 25 mm, fest nylonnettet og sentrifugerøret tett. Plasser sentrifugerøret stående for kort sentrifugering ved hjelp av en minisentrifuge (1360 x g) i 10 sekunder og samle den filtrerte løsningen (~ 100 μL T. dendrolimi gift).
- Mål konsentrasjonen av oppsamlet T. dendrolimi gift ved hjelp av et bicinchoninsyre (BCA) analysesett (materialfortegnelse).
- Oppbevar giften ved -80 °C for videre analyser.
5. SDS-PAGE analyser
- Tilsett 30 μL T. dendrolimi gift til 10 μL 4x natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) prøvelastbuffer (materialfortegnelse) og varme opp ved 95 °C i 10 minutter.
- Utfør SDS-PAGE gel kjørt på 130 V i 120 minutter.
- Beis og avfarg SDS-PAGE-gelen ved hjelp av proteinfargingsapparatet (materialfortegnelse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteinkonsentrasjonen i representative giftprøver ble målt ved hjelp av proteinanalysesettet, med resultatene presentert i tabell 1. Resultatene viste at konsentrasjonen av giftprotein samlet ved denne metoden varierte fra 0,35 μg / μL til 0,46 μg / μL, mens den negative kontrollen av aminosyreoppløsning bare hadde en proteinkonsentrasjon på 0,03 μg / μL til 0,05 μg / μL. Konsentrasjonen av giftprotein samlet ved denne metoden er mye høyere enn for negativ kontroll, noe som viser at denne metoden kan samle giftet til parasittveps godt. I tillegg er det ingen spesifikk sammenheng mellom parasittismetid og konsentrasjon fordi forskjellige partier av parasittveps kan ha forskjellig vitalitet.
I tillegg ble T. dendrolimi gift analysert av SDS-PAGE, og avslørte et giftproteinområde som spenner fra under 10 kDa til over 130 kDa i figur 1. Men da den negative kontrollen av aminosyren ble analysert av SDS-PAGE, ble det funnet at det ikke var noe protein i det (tilleggsfigur 1), som også viste at proteinet samlet ved denne metoden faktisk var giftproteinet til parasittveps.
Figur 1: SDS-PAGE-analyse av T. dendrolimi giftprotein. Bane 1-2: De belastede mengdene giftprotein var henholdsvis 8 μg og 10 μg. M: Markør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Eksempel | Parasittisme tid (h) | Konsentrasjon (μg/μL) | |
| Gift | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| Kontroll | 1 | NP | 0.04 |
| 2 | NP | 0.03 | |
| 3 | NP | 0.05 | |
| 4 | NP | 0.03 | |
| 5 | NP | 0.03 | |
Tabell 1: Konsentrasjonsinformasjonen til giften og kontrollen. Proteinkonsentrasjonen av representativ gift og kontrollprøver ble målt ved hjelp av BCA-proteinanalysesettet. Kontroll: de uparasitiserte kontrollene. NP: ingen parasittisme
Tilleggsfigur 1: SDS-PAGE analyse av kontroll og gift. Kontroll: den uparasitiserte kontrollen. Gift: de lastede mengdene giftprotein var 10 μg. M: Markør. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en metode for å trekke ut gift fra T. dendrolimi ved hjelp av kunstige verter. Hovedpunktene i giftinnsamlingseksperimentet er som følger. (1) Under tilberedning må T. dendrolimi bedøves raskt med en passende konsentrasjon av CO2. Hvis CO2 -konsentrasjonen er for lav, vil den ikke være tilstrekkelig til å bedøve Trichogramma raskt. Omvendt, hvis konsentrasjonen er for høy, kan Trichogramma dø, og redusere deres evne til å parasitere den kunstige verten. (2) Steriliteten til aminosyreoppløsningen må sikres, da forurensning av aminosyreoppløsningen kan påvirke parasittismeeffektiviteten negativt. (3) Parasitering av kunstige eggkort bør utføres i mørke forhold for å fremme parasitisme. (4) Det anbefales å enten utføre nedstrømseksperimenter direkte eller fryse prøvene for å sikre giftens aktivitet og forhindre nedbrytning.
Det anbefales å bedømme parasitisering ved å visualisere deponerte egg. Hvis de deponerte eggene ikke er observert under mikroskopet, kan det ikke ha blitt trukket ut gift. Begrensningen av teknikken er at den krever et stort antall parasitoidveps. Et enkelt giftuttak krever omtrent 3000 parasitoide veps, noe som øker arbeidsmengden.
Den tidligere metoden for utvinning av parasitoid vepsegift var å dissekere giftreservoaret. Imidlertid er parasitoide veps små; for eksempel er Trichogramma mindre enn 1 mm lang. Ikke bare er de tekniske kravene til dissekering av giftreservoarer høye, men forurensning av andre vev under disseksjon er også vanlig. Den nye metoden ved bruk av kunstige verter kan forbedre effektiviteten av giftekstraksjon og unngå forurensning fra andre vev forårsaket av disseksjon.
Denne metoden kan også utvides til andre parasitoidveps. For eksempel kan polyetylenplastfilmoocytter som inneholder en blanding av saltioner og aminosyrer anvendes for å oppnå T. neustadt-gift, og kunstige voksegg som inneholder KCl-MgSO4-løsning kan brukes til å oppnå T. pretiosum gift. I tillegg til Trichogramma har det blitt rapportert at Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 og Habrobracon hebetor10 kan parasitere kunstige verter. Ved å bruke egenskapene til disse parasitoidvepsene for å parasitere kunstige verter, kan lignende giftekstraksjonsmetoder utvikles.
Parasitoid vepsegift er en underutforsket kilde til biologiske molekyler med potensiell skadedyrsbekjempelse og medisinske anvendelser. Nylig har den potensielle bruken av parasitoid gift i farmakologi og landbruk blitt anerkjent14,15. Farmakologisk har mange komponenter i parasitoid gift brede potensielle applikasjonsutsikter for å optimalisere immunterapi, behandle trombotiske lidelser og finne maler for nye antibiotika. I landbruket kan noen komponenter i parasitoid gift brukes som biologiske kontrollmidler for å regulere utvikling, reproduksjon og immunitet for for å oppnå formålet med effektivt å kontrollere15. Imidlertid begrenser mangelen på effektive giftekstraksjonsmetoder ofte forskning på giftet til parasitoide veps, spesielt små parasitoidveps som Trichogramma. Dette papiret gir en effektiv metode for å trekke ut giftet til Trichogramma, som gir en metode for oppfølgingsstudien av Trichogramma-gift, for eksempel identifisering av proteinsammensetning og giftfunksjon. I tillegg kan denne metoden også brukes som referanse for annen parasitoid vepsegiftforskning og gir støtte for å fremme screening av bioaktive molekyler fra parasitoide giftstoffer for insekticide eller medisinske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre og ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi anerkjenner økonomisk støtte fra Natural Science Foundation of Hainan-provinsen (Grant no. 323QN262), National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 31701843 og 32172483), Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund (Grant nr. CX (22) 3012 og CX (21) 3008), "Shuangchuang Doctor" Foundation of Jiangsu Province (Grant nr. 202030472), og Nanjing Agricultural University oppstartsfond (Grant nr. 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568 (1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
