Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

Ciao, sono Hillary Kemp del laboratorio di Cecilia Owens. E io sono Cecilia Owens. Hillary e io lavoriamo nella divisione di scienze di base presso il Fred Hutchinson Cancer Research Center di Seattle.

Oggi vi mostreremo una tecnica per la produzione di embrioni di pesce zebra chimerici, noti anche come mosaicismo genetico. Questa procedura ci permette di valutare la base cellulare della funzione genica durante lo sviluppo. Possiamo determinare se un determinato gene agisce all'interno delle cellule con fenotipo mutante, noto come funzione cellulo-autonoma, oppure nell'ambiente circostante le cellule, noto come funzione non cellulo-autonoma.

Realizziamo questi mosaicici trapiantando cellule tra embrioni di tipo selvatico e mutanti a uno stadio di blastula o di gastrulazione precoce. Successivamente valutiamo la funzione genica osservando il fenotipo e il genotipo delle cellule derivate dal donatore nel loro ambiente ospite. Cominciamo dunque.

In questa parte del protocollo, un colorante lineage viene iniettato nell'embrione donatore in modo da poter seguire il destino delle cellule derivate dal donatore dopo il trapianto. Qualsiasi tipo di acidi nucleici può essere iniettato utilizzando questa tecnica; tuttavia, omettere il passaggio di decorazione quando si inietta il DNA. Prima di lavorare con gli embrioni, preparare una piastra per iniezioni inserendo un vetrino ad un angolo di 45 gradi attraverso la parte più larga di una piastra di Petri. Riempita per tre quarti con mezzo per embrioni 1,2% aros in pen strep.

Rimuovere la lamella dopo che l'agarosio si è solidificato per creare una scanalatura smussata. Riempire la scanalatura con mezzo embrionale penicillina-streptomicina. Procedere ora con la dechorionazione enzimatica di embrioni allo stadio ad una cellula.

Incubare gli embrioni allo stadio a una cellula per uno a cinque minuti in una soluzione di pronasi a 0,5 milligrammi per millilitro. Monitorare attentamente la dechorionazione.

Non appena il corione inizia a collassare visibilmente, immergere gli embrioni nell'acqua del sistema e versare via tutto il corio, lasciando gli embrioni sul fondo, nella parte più bassa della curvatura del becco. È molto importante che gli embrioni non tocchino nuovamente la superficie dell'acqua; la maggior parte di essi ha già perso il corione. Alcuni pochi, tuttavia, continuano a ruotare all'esterno senza essersene liberati.

Se qualcosa è ancora all'interno del corione, allora l'atto di prelevarli in questo modo li farà uscire e rilascerà gli embrioni in modo che non tocchino mai la superficie dell'acqua. È importante manipolare gli embrioni rivestiti con una pipetta che sia stata levigata a fuoco per ammorbidirne i bordi. Trasferire delicatamente gli embrioni dec rivestiti, molto fragili, nella vaschetta della piastra per iniezioni utilizzando una pipetta di vetro a fuoco con orifizio largo.

Quindi carichiamo un singolo file in questa vaschetta. Ora gli embrioni sono pronti per essere iniettati con un marcatore di linea utilizzando una pipetta di vetro tirata a fuoco, precisamente calibrata, e un dispositivo per iniezione a pressione. Useremo una piastra piena di mezzo per embrioni per rompere l'ago e una piastra piena di olio per calibrare l'ago.

Questo è un comune olio minerale di qualità per laboratorio. Prendiamo una coppia di pinzette da orologiaio affilate e, osservando attraverso gli oculari per determinare le dimensioni corrette, posizioniamo le pinzette su entrambi i lati dell'ago e quindi stacchiamo delicatamente il frammento, operazione che non posso effettuare senza guardare, al fine di determinare il volume di colorante o ribonucleotide somministrato. Prima di iniziare.

Misurare la dimensione del bolo in una piastra contenente olio minerale. L'ago deve essere spezzato in modo che un bolo di un nanolitro venga rilasciato con uno o due impulsi del microinjector. Il volume del bolo può essere calcolato a partire dal suo diametro, misurato mediante un micrometro oculare.

Iniettare un nanolitro di una soluzione al 1-3% di destrano fluorescente direttamente nel tuorlo di embrioni rivestiti tra lo stadio a una e a quattro cellule. Quello che farò è posizionare l'embrione esattamente sotto l'ago. Inserirò delicatamente l'ago al centro del tuorlo e premerò il pedale con il piede.

Dopo l'iniezione, è importante iniettare nei flussi del tuorlo in modo che il colorante venga trasportato all'interno delle cellule. Questa iniezione sarà sufficiente per tracciare le cellule negli embrioni chimerici per diversi giorni di sviluppo. Idealmente, si esegue questa procedura prima che le cellule raggiungano lo stadio a quattro cellule; coltivare gli embrioni iniettati a bassa densità in una piastra di Petri rivestita, contenente mezzo per embrioni fresco con penicillina e streptomicina.

Si noti che gli embrioni iniettati tendono ad avere una velocità di sviluppo leggermente ridotta; incubare gli embrioni a diverse temperature, 25, 28 e 31 gradi Celsius, per sfasare il loro sviluppo e massimizzare la finestra temporale entro cui possono essere eseguiti i trapianti. L'apparato utilizzato per il trapianto cellulare nella blastula del pesce zebra è costituito da una siringa Hamilton con comando motorizzato, collegata tramite un rubinetto a tre vie a un serbatoio di olio minerale e a un supporto per micropipette attraverso un tratto di tubo flessibile. Rimuovere tutte le bolle d'aria dal sistema, poiché comprometterebbero la capacità di controllare aspirazione e pressione.

Utilizzare un microscopio stereoscopico dotato di ottiche di alta qualità con un ingrandimento minimo di DX. Per controllare il posizionamento del supporto della micropipetta e dell'ago, si consiglia un micromanipolatore manuale NARA shige. Assicurarsi che sia fissato al banco mediante una base magnetica per evitare il trasferimento di vibrazioni al trapianto.

Gli aghi per trapianto sono realizzati da pipette capillari di vetro che vengono allungate fino a formare una leggera punta conica su un polarizzatore per elettrodi. Consultare il protocollo JoVE del laboratorio di Miriam Goodman per i dettagli sul tiraggio delle pipette sotto un microscopio stereoscopico e sulla rottura della punta dell'ago prelevato. Per trapianti allo stadio di blastula, il diametro esterno dell'ago deve misurare circa 50-60 micron, oppure 30-40 micron per un trasferimento allo stadio gastrula.

Per un trasferimento allo stadio gastrico che migliori la penetrazione, è necessario creare una punta seghettata all'estremità dell'ago utilizzando prima una microfiamma, quindi appiattire la punta dell'ago avvicinandola al filamento della microfiamma. Successivamente, ruotare l'ago in modo che il bordo anteriore della bisellatura entri in contatto con il filamento. Una volta che il bordo anteriore dell'ago tocca il filamento, allontanarlo rapidamente per formare una barbetta.

Per evitare di danneggiare le cellule, la barbetta deve essere dritta e la punta dell'ago non deve essere ricurva. Una volta preparati il sistema di fissaggio e gli aghi per il trapianto, si è pronti per produrre embrioni chimerici. I trapianti alla fase di blastula vengono utilizzati per trasferire cellule tra embrioni quando non è necessaria un'informazione dettagliata sulla mappa del destino cellulare. A eccezione delle cellule germinali primordiali, la maggior parte delle cellule in questa fase non è generalmente impegnata in un particolare destino.

La carta dei destini embrionali della blastula è tale che possiamo distinguere tra cellule destinate a dare origine all'ectoderma e cellule destinate a dare origine al mesoderma. Le cellule mesodermiche ed endodermiche si trovano vicino al margine dell'embrione allo stadio di blastula, mentre i progenitori dermici, che daranno origine al sistema nervoso e al derma superficiale, si trovano più lontano dal margine dell'embrione. Pertanto, quando trapiantiamo cellule in embrioni allo stadio di blastula, possiamo indirizzarle verso il mesoderma presuntivo o verso l'ectoderma presuntivo.

Ma non possiamo indirizzare le cellule verso una regione specifica dell'ectoderma o del mesoderma perché non lo sappiamo. Allo stadio di blastula, in cui si trova il lato dorsale dell'embrione, preparare in anticipo le piastre per l'iniezione posizionando un stampo di plastica con file di protrusioni a forma di cuneo in una piastra di Petri riempita per metà con agarosio fuso al 1,2% in mezzo per embrioni. Una volta che l'agarosio si è solidificato, rimuovere lo stampo lasciando file di pozzi a forma triangolare, ognuno appena sufficiente a contenere un singolo embrione.

Riempire lo stampo per il trapianto con mezzo per embrioni contenente penicillina e streptomicina, quindi caricare singolarmente gli embrioni allo stadio di blastula in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta di vetro levigata a fiamma. Trasferire ora gli embrioni nei pozzetti destinati al trapianto, lasciandoli inizialmente distesi su un lato. Disporre gli embrioni in modo che quelli donatori siano posizionati lungo una colonna e quelli ospiti lungo la colonna adiacente.

Posizionare la piastra sul palchetto in modo che, quando l'ago di trapianto entra nell'embrione, spinga l'embrione contro la parete posteriore del suo pozzetto. Utilizzando il micromanipolatore, abbassare l'ago di trapianto nella piastra con un angolo piuttosto ripido. Idealmente, l'ago di trapianto dovrebbe entrare nell'embrione con un angolo di circa 45 gradi.

Una volta che la punta dell'ago si trova al di sotto della superficie del mezzo embrionale, aspirare una piccola quantità di mezzo embrionale all'interno dell'ago ruotando la vite micrometrica che controlla la siringa di Hamilton. Per un controllo più preciso, l'interfaccia tra l'olio minerale e il mezzo embrionale deve rimanere nella parte sottile e conica dell'ago, non troppo vicina all'estremità. Posizionare delicatamente l'embrione donatore con l'ago, quindi ritrarre leggermente l'ago ed entrare nella calotta blastulare dell'embrione nella posizione desiderata.

Un colpo deciso e rapido permetterà di penetrare nell'embrione senza farlo rotolare. Aspirare lentamente e con attenzione le cellule donatrici nell'ago per evitare di danneggiare le cellule. Evitare di aspirare tuorlo nell'ago una volta raggiunto il numero desiderato di cellule.

Invertire leggermente la pressione per arrestare l'aspirazione e rimuovere l'ago per portare l'embrione ospite in posizione. Spostando la piastra di trapianto, piccoli aggiustamenti nella posizione dell'embrione ospite possono essere effettuati ruotandolo delicatamente con l'ago di trapianto, purché si faccia attenzione a non toccare il tuorlo. Quando si espellono le cellule donatrici nell'embrione ospite, evitare di aspirare il tuorlo all'interno dell'embrione, poiché ciò danneggerebbe e ucciderebbe le cellule donatrici. Le cellule provenienti da un singolo embrione donatore possono essere trapiantate in più ospiti dopo che i trasferimenti cellulari sono stati completati.

Trasferire le coppie di ospiti donatori nelle pozzette rivestite di una piastra a 24 pozzetti per continuare lo sviluppo. L'unica eccezione alla regola secondo cui le cellule non sono impegnate in destini specifici allo stadio di blastula è rappresentata dalle cellule germinali primordiali. Le cellule germinali primordiali vengono determinate molto precocemente nello sviluppo e sono impegnate nel loro destino di cellule germinali primordiali.

In una fase molto precoce, le cellule germinali primordiali si trovano vicino al margine di un embrione a blastula e a uno stadio gastrula. Pertanto, se l'obiettivo dell'esperimento di trapianto è trapiantare cellule germinali primordiali, è molto importante da dove provengono le cellule nell'embrione donatore, mentre non è importante dove vengono inserite nell'embrione ospite. La regola è che, per le cellule somatiche, è importante dove vanno nell'embrione ospite, poiché ciò determinerà il loro destino.

Nel caso delle cellule germinali primordiali, è importante da dove provengono nell'embrione donatore, poiché il loro destino è già determinato. Se l'obiettivo è trapiantare cellule germinali primordiali, allora queste devono essere prelevate dal margine della regione posteriore dell'embrione donatore, dove si trovano proprio vicino al margine dell'embrione in quattro piccoli gruppi, ciascuno composto da tre o quattro cellule, in questa fase a foglio o fase avanzata di sviluppo. È necessario prelevarle con molta delicatezza per evitare di aspirare accidentalmente il tuorlo.

Ok, e quindi questo è ciò che ho fatto, e ora passo a un embrione ospite. Le cellule germinali primordiali migreranno autonomamente verso la cresta genitale dell'embrione in cui si trovano. Pertanto, non è necessario trapiantare queste cellule germinali primordiali al margine, poiché vi giungeranno da sole.

Quindi li sto semplicemente trapiantando, rimettendoli in qualsiasi punto nell'embrione post. La chiave per i trapianti di cellule germinali, che è esattamente l'opposto di ogni altro tipo di trapianto, è il luogo di provenienza delle cellule donatrici. Il trapianto di cellule in un ospite allo stadio gastrula permette all'operatore di sfruttare la mappa del destino del pesce zebra che si delinea quando lo scudo embrionale diventa visibile.

Diventa possibile distinguere diversi tipi di tessuto, così come i domini all'interno del sistema nervoso centrale presuntivo. Durante il trasferimento di cellule tra embrioni allo stadio di gastrula, esistono alcune variazioni nel protocollo, ma la procedura generale è simile a quella utilizzata con le blastule per montare le gastrule. Innanzitutto, spalmare una striscia verticale di metilcellulosa nella depressione di un vetrino portaoggetto con depressione, quindi allagare con una generosa quantità di mezzo per embrioni con penicillina-streptomicina utilizzando una pipetta a fuoco levigato per il trasferimento.

Un donatore e tre ospiti allo stadio scudo per il vetrino della depressione. Selezionare embrioni donatori leggermente più giovani rispetto agli ospiti. È necessario un nuovo strumento per manipolare la colla gastros: inserire le estremità di un breve tratto di lenza da due libbre all'interno dell'estremità di un tubo capillare.

Formando così un piccolo cappio. Utilizzare il cappio per arrotolare delicatamente gli embrioni donatori e ospiti sulla parte superiore della striscia di metilcellulosa e spingerli all'interno fino a quando non sono ben fissati. Posizionarli in modo che la regione bersaglio risulti in posizione superiore.

Dato che durante il trapianto l'ago entrerà in modo tangenziale nell'embrione per consegnare le cellule donatrici senza danneggiare il tuorlo, i trapianti allo stadio di gastrocula vanno eseguiti preferibilmente con un microscopio composto a stadio fisso. Utilizzare i comandi del micromanipolatore per mettere a fuoco la punta dell'ago da trapianto.

Posizionare il supporto della micropipetta e l'ago con un angolo piuttosto ridotto, in modo che l'ago sia il più vicino possibile all'orizzontale consentito dal bordo della depressione sul vetrino. Successivamente, perforare l'embrione donatore. Se è stato montato correttamente, non rotolerà quando l'ago di trapianto entra, a meno che l'embrione non sia troppo vecchio per permettere all'ago di penetrare facilmente.

Per evitare di perforare il tuorlo, l'ago deve penetrare nell'embrione in un piano focale leggermente più profondo rispetto a quello dell'EDL. Una volta perforato, è possibile prelevare un numero elevato di cellule dal donatore per effettuare fino a tre iniezioni nelle cellule dell'ospite. Quando si aspirano le cellule, evitare di aspirare il tuorlo muovendo l'ago mentre si prelevano le cellule, se necessario.

È possibile raccogliere ulteriori embrioni per ottenere più cellule utilizzando lo stesso ago prima di espellere le cellule nell'ospite; durante l'espulsione delle cellule nell'embrione ospite, rilasciare le cellule mentre si ritrae l'ago attraverso l'area bersaglio, invece di depositarle in un singolo grumo. Ciò aumenterà la probabilità che le cellule donatrici contribuiscano al tessuto desiderato. Una volta completati i trasferimenti cellulari, posizionare l'intero vetrino in una piastra di Petri e allagarlo con attenzione con mezzo per embrioni contenente penicillina-streptomicina.

Nelle ore successive, la metilcellulosa si scioglierà liberando gli embrioni. Il numero di cellule trasferite dipende dall'obiettivo specifico dell'esperimento. Le cellule provenienti da un singolo donatore possono essere trapiantate in tre o quattro ospiti la mattina successiva al trapianto.

È possibile esaminare gli ospiti per determinare se il targeting delle cellule donatrici è stato effettuato con successo. Il trapianto riuscito di cellule germinali primordiali da stadio di blastula porta alla presenza di cellule marcate con fluorescenza, posizionate in sede ventrale in prossimità della giunzione tra il ylk e l'estensione del ylk. Abbiamo quindi appena illustrato come eseguire trapianti agli stadi di gastrula e di blastula.

Quando si esegue questa tecnica, è importante scegliere il tipo corretto di metodo di trapianto in base al tessuto bersaglio che si desidera raggiungere con le proprie cellule. Pertanto, il trapianto allo stadio di blastula è sufficiente per determinare se le cellule migrano verso il derma o verso l'ectoderma. È inoltre possibile utilizzare questa tecnica per indirizzare le cellule germinali primordiali.

Se si desidera effettuare un mappaggio più preciso, è preferibile utilizzare un trapianto allo stadio di gastrula in cui il lato dorsale è già stato determinato. Con questa tecnica, è possibile indirizzare le cellule verso diverse parti del sistema nervoso, in particolare il proencefalo, il mesencefalo, il romboencefalo e il midollo spinale. Questo è tutto.

Grazie mille per aver guardato e buona fortuna con tutti i vostri esperimenti.