Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

Questa procedura inizia allineando embrioni di pesce zebra a cellula singola in una piastra per microiniezione. Iniettare microscopica­mente una soluzione di destrina fluorescente nel tuorlo. Subito sotto gli embrioni iniettati si trovano i donatori per il trapianto.

Coat gli embrioni donatori e quelli ospiti e coltivateli fino allo stadio scudo; posizionate due embrioni iniettati con destrina rivestita con DEC affiancati in un singolo pozzetto di una piastra per trapianti. Ripetete sotto ogni coppia di donatori. Aggiungete un embrione ospite per pozzetto per indirizzare le cellule trapiantate alla futura diencefalo del proencefalo; trapiantate le cellule dalla e verso la linea mediana.

A metà strada tra il polo animale e lo scudo. Trapiantare le cellule dal gasa del donatore nel Gasa dell'ospite. Coltivare fino a 30 ore e fissare.

Eseguire l'immunochimica se necessario, montare e acquisire l'immagine. In alternativa, montare il campione vivo ed effettuare un'acquisizione con microscopia a intervalli di tempo. Ciao, mi chiamo Elizabeth De Shane del laboratorio del Dott. Michael ESI del Dipartimento di Scienze Biologiche del Smith College di Northampton, Massachusetts.

E io sono il responsabile scientifico del laboratorio, il dottor Michael Besi. Oggi vi mostreremo come creare embrioni chimerici eseguendo trapianti di cellule allo stadio gastrula utilizzando il sistema modello del pesce zebra. Utilizziamo questo procedimento nel mio laboratorio per studiare la funzione di geni specifici nello sviluppo delle commessure telencefaliche, nonché il processo delle interazioni assone-glia durante la formazione delle commessure.

Iniziamo. Per cominciare, preparare gli stampi a solco per le piastre di microiniezione spezzando con attenzione in due metà tre capillari non filamentosi lunghi quattro pollici e con diametro di un millimetro. Utilizzando colla istantanea, incollare due delle metà di capillare fianco a fianco su una superficie piana.

Il terzo capillare, posizionato sopra questi due, si adagia nella scanalatura formando una struttura a piramide. Con i tre capillari, lasciare asciugare lo stampo. È consigliabile realizzare da tre a cinque stampi per ogni piastra di iniezione.

Successivamente, preparare le piastre per l'iniezione versando da 20 a 25 millilitri di agarosio fuso al 1,5% in mezzo embrionale in una piastra di Petri da 100 millimetri. Posizionare immediatamente da tre a cinque stampi a scanalatura preparati sul fondo della piastra, assicurandosi che il lato piatto dello stampo sia a contatto con il fondo della piastra di Petri ed sia completamente ricoperto dall'agarosio. Una volta che l'agarosio si è solidificato, rimuovere gli stampi a scanalatura tagliando un quadrato di agarosio di grandi dimensioni che li contiene.

Rimuovere delicatamente l'agar dalla periferia del quadrato tagliato e scartarlo. Capovolgere il pezzo quadrato di agar e, utilizzando pinzette fini, rimuovere completamente gli stampi a solco. Versare l'agar fuso nella piastra di Petri intorno al quadrato per mantenere fissate le nuove pozzette appena formate.

Lasciarlo solidificare. Le piastre possono essere sigillate con parafilm e conservate per settimane a quattro gradi Celsius. Devono essere eliminate se compaiono segni di crescita nell'agar.

Infine, per preparare gli aghi di iniezione, utilizzare un estrattore di capillari per micropipette per fabbricare gli aghi partendo da capillari di vetro da un millimetro e quattro pollici con filamenti interni; a questo punto gli aghi e la piastra per microiniezione sono pronti. Vediamo ora come raccogliere gli embrioni e allestire l'apparato di microiniezione. Le uova fecondate vengono raccolte immediatamente dopo la deposizione e mantenute in una piastra di Petri riempita con mezzo per embrioni.

Utilizzando una pipetta di vetro con punta larga, espellere gli embrioni nei pozzetti di una piastra per iniezioni a temperatura ambiente riempita con mezzo per embrioni. Utilizzare pinze smussate tenute chiuse per spingere delicatamente gli embrioni sul fondo delle scanalature; scartare gli embrioni il cui corion o tuorlo siano stati compromessi.

Successivamente, caricare l'ago di iniezione con uno o due microlitri di soluzione diluita di destrina fluorescente Alexa 594. Lasciare che la destrina raggiunga la punta dell'ago di iniezione per azione capillare. Fissare l'ago di iniezione al supporto per capillari di un micromanipolatore stereotassico e regolare inizialmente la pressione sull'apparato di microiniezione.

40-50 PSI e una durata dell'impulso di 500 millisecondi. Utilizzare pinzette per sfiorare delicatamente o recidere la punta dell'ago di iniezione al fine di rompere il sigillo. Idealmente, il diametro dovrebbe essere compreso tra 0,05 e 0,15 millimetri.

Per calibrare l'ago, utilizzare un microscopio stereoscopico e rilasciare la destrina su un micrometro ricoperto di olio minerale. Modificare la dimensione del bolo regolando la durata della pressione d'aria dell'impulso e la dimensione dell'ago. Consiglio. Durante le iniezioni, mantenere una dimensione del bolo equivalente a un volume compreso tra 0,8 e un nanolitro.

Ora possiamo iniziare la microiniezione di destrina utilizzando un ingrandimento di circa 3,2 x su un microscopio stereoscopico. Iniziare le iniezioni negli embrioni da un'estremità della vaschetta, perforando delicatamente il corione e la membrana cellulare degli embrioni per entrare nel tuorlo. Iniettare la soluzione di destrina appena al di sotto della cellula.

Assicurarsi di rimuovere l'ago di iniezione con lo stesso movimento delicato utilizzato per entrare nell'embrione. Spostare la piastra di Petri per posizionare l'embrione successivo in fila e continuare a iniettare lungo la lunghezza della scanalatura. Controllare periodicamente la pressione e la dimensione del bolo.

Ora utilizzare una pinzetta per spingere delicatamente gli embrioni fuori dai solchi. Trasferirli in una capsula di Petri contenente mezzo per embrioni con antibiotico. Incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius e controllarli per individuare uova non fecondate o decessi.

Gli embrioni sono ora pronti per futuri trapianti. Prima del completamento di un poli durante la razionatura del gas, porzioni del tuorlo rimangono esposte. Il tuorlo è estremamente fragile e aderirà facilmente alla plastica della piastra di Petri, strappandosi con facilità.

Pertanto, gli embrioni devono essere ricoperti su piastre rivestite un giorno prima che avvengano i trapianti. Preparare queste piastre di decorazione versando da cinque a dieci millilitri di aros fuso in una piastra di Petri da 100 millimetri. È necessario solo uno strato sottile di aros, di circa due-tre millimetri, per ammortizzare gli embrioni durante la decorazione.

Lasciare raffreddare le piastre. Successivamente, preparare piastre di trapianto separate versando 30 millilitri di soluzione di aros al 1,5% in una piastra di Petri da 100 millimetri e inserire un stampo per pozzi di trapianto. Lo stampo deve contenere 104 incavi triangolari, ciascuno composto da tre lati di 90 gradi e un lato angolato di 45 gradi.

I pozzetti sono progettati per contenere due embrioni affiancati. Prestare attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto lo stampo e lasciare indurire l'agarosio. La rimozione dello stampo rivela un'area incavata contenente i pozzetti quadrati con un bordo inclinato.

Per preparare gli embrioni ospiti e donatori per il trapianto, è necessario monitorarne lo sviluppo al fine di mantenere accoppiamenti pressoché omogenei per età. A tale scopo, gli embrioni possono essere allevati a temperature variabili comprese tra 23 e 31 gradi Celsius per rallentare o accelerare lo sviluppo. Un'ora prima dell'età desiderata, sia gli embrioni ospiti che quelli donatori devono essere manipolati manualmente su una piastra rivestita.

Nel caso di trapianti allo stadio gastrula, questa procedura deve essere completata entro cinque ore dalla fecondazione (HPF), prima dello stadio shield a 5,5 HPF. Utilizzare una pipetta di vetro per caricare l'embrione ospite e gli embrioni donatori in una piastra per trapianti riempita con mezzo embrionale antibiotico. La prima riga è riempita con embrioni donatori, due embrioni per pozzetto, mentre le due righe successive contengono un singolo embrione ospite per pozzetto.

Per i trapianti, utilizziamo un microscopio stereoscopico fluorescente Zeiss con attacco luer che dispone di zoom e regolazione del fuoco completamente automatizzati, controllati da un joystick. Sebbene questo microscopio automatizzato non sia strettamente necessario, aumenta notevolmente la facilità e l'efficienza di questi delicati interventi chirurgici di trapianto, specialmente quando si desidera effettuare un elevato numero di trapianti. Per configurare l'apparato per il trapianto, posizionare il tram aereo einor nella posizione centrale della sua scala, collegare il tubo del tram aereo al supporto per capillari e fissare il supporto al micromanipolatore automatico einor. Con gli embrioni e l'apparato per il trapianto pronti, possiamo ora passare ai trapianti cellulari allo stadio gastrula.

La competenza più importante per eseguire trapianti cellulari allo stadio gastrula è la capacità di riconoscere l'anatomia cellulare del labbro blastoporico dorsale APO, noto anche come scudo nel pesce zebra. Di seguito presentiamo un filmato sequenziale della gastrula vista da diversi punti di osservazione, evidenziando la posizione dello scudo in questa vista laterale. Lo scudo o il lato dorsale si trova a destra, indicato dal contorno rosso, dove vanno indirizzate le cellule da trapiantare nel cervello anteriore e lungo la linea mediana.

Esattamente a metà strada tra il polo animale e lo scudo, inizieremo a ruotare l'embrione prima verso di voi per visualizzare il polo animale, evidenziando nel percorso lo scudo e il sito di trapianto. Successivamente, l'embrione ruota attorno al proprio asse in modo da posizionare lo scudo nella parte inferiore. Il gastroide ora ruota nuovamente verso l'alto, offrendovi una vista dorsale diretta.

L'embrione viene ora ruotato nuovamente in sequenza fino a una vista laterale a sei HPF. Utilizzando il micromanipolatore, sfiorare delicatamente l'embrione con la punta della capillare per posizionarlo in modo da permettere l'estrazione cellulare, in modo che la linea mediana e lo scudo siano visibili e opposti alla punta della capillare. Gli embrioni donatori possono essere facilmente verificati passando dall'illuminazione in campo chiaro a quella fluorescente. In questa fase, le cellule del gastro fluorescono in rosso; aspirare una piccola quantità di mezzo embrionale nella capillare per eliminare qualsiasi rischio che le cellule entrino in contatto con l'interfaccia aria-acqua, il che potrebbe danneggiarle.

Bucherellare delicatamente l'ectoderma dell'embrione donatore lungo la linea mediana esattamente tra il polo animale e lo scudo. Nella regione gasa, vi erano solo circa 20 micrometri di cellule tra l'ectoderma superficiale e il tuorlo sottostante. Fare quindi attenzione a non ferire il tuorlo, poiché ciò spesso porta alla morte entro poche ore.

Aspirare lentamente le cellule nella capillare utilizzando il tram d'aria. Mantenere sempre visibile la linea dell'acqua, agitando leggermente la punta. Mentre si è all'interno del donatore, questo aiuterà a sciogliere i contatti tra cellula e cellula.

Devono essere estratte circa da 10 a 50 cellule dall'embrione donatore. Successivamente, rimuovere la capillare dall'embrione donatore. Orientare in modo analogo l'ospite e perforarlo, quindi iniettare le cellule nella stessa posizione esatta. In un embrione ospite, passando dall'illuminazione in campo chiaro a quella fluorescente, si osserva il movimento delle cellule marcate con destrina all'interno dell'ago capillare verso l'embrione ospite.

Infine, dopo il trapianto, rimuovere gli embrioni donatori e quelli ospiti dalle pozzette. Separarli e posizionarli delicatamente su una capsula di Petri rivestita con A, contenente embrioni in mezzo antibiotico. Incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius fino al completamento dei trapianti.

Iniziamo la visualizzazione e l'acquisizione di immagini. Gli embrioni vengono fissati allo stadio appropriato per l'acquisizione di immagini, utilizzando un fissativo verificato per immunoistochimica. Nel nostro caso, la fissazione avviene con formaldeide al 4% per due ore a temperatura ambiente oppure in modo rotante tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Successivamente, risciacquare due volte gli embrioni fissati e quindi lavarli per tre-cinque minuti in PBS 0,1 M. Eseguire un'opportuna marcatura immunoistochimica se necessario.

Posizionare gli embrioni in glicerolo al 75%, affondarli a temperatura ambiente e conservarli a quattro gradi Celsius. Preparare un vetrino per montare due embrioni creando due quadrati di vaselina su un vetrino che corrispondano al diametro interno di un quadrato. Coprire ciascun embrione con un coprioggetto e effettuare tutte le dissezioni necessarie per ottenere una vista frontale del proencefalo.

Dissezionare il cervello anteriore tagliando perpendicolarmente attraverso il mesencefalo. Posizionare questo tessuto con una minima quantità di glicerolo all'interno del petrolio. Orientare correttamente il tessuto nella posizione appropriata e posizionare una lamella sopra il campione.

In alternativa, per embrioni vitali, montarli in una soluzione di agarosio allo 0,75% su vetrino. Prima che l'agarosio solidifichi, utilizzare un ago di tungsteno per manipolare l'embrione e posizionarlo nell'orientamento corretto per l'acquisizione delle immagini. Sia gli ospiti fissati che quelli vitali vengono sottoposti a imaging.

Utilizzando il microscopio confocale a scansione laser Leica SP, vengono acquisite pile ZS ed è effettuata un'elaborazione dell'immagine in tre o quattro dimensioni mediante il software Velocity, al fine di generare embrioni chimera in cui una parte della popolazione di astroglii all'interno dell'embrione differisce per genotipo o fenotipo. Abbiamo adottato un approccio multifaccettato che combina l'uso di embrioni transgenici GFP, che marcano gli astroglii, con il trapianto di cellule stadiato gastrulazione per indirizzare in modo specifico le nostre linee cellulari al cefalone. Abbiamo utilizzato la mappa del destino gastrulazione del pesce zebra per estrarre selettivamente cellule lungo la linea mediana, equidistanti dal polo animale e dallo scudo.

Queste cellule isolate sono state quindi trapiantate nella stessa posizione in un ospite di tipo selvatico gasa, che è stato successivamente allevato fino a 30 HPF ed etichettato immunologicamente per tutti gli assoni, utilizzati come riferimenti anatomici per il cervello anteriore. Nell'esempio mostrato qui, l'immagine confocale di un singolo embrione ospite rivela cellule positive al GFP isolate in tutta la regione cefalica. La morfologia completa di queste cellule positive al GFP può essere osservata in questo saggio clonale, che mostra come la maggior parte di queste cellule assuma la tipica morfologia delle cellule gliali radiali, in cui il soma si trova adiacente alla zona ventricolare e un ampio piede terminale conclude un processo radiale alla superficie esterna.

La ricostruzione tridimensionale dello Zack di queste sezioni ottiche raccolte mostra chiaramente la posizione di queste cellule rispetto agli assoni marcati. Un altro approccio comunemente utilizzato per visualizzare le cellule trapiantate consiste nell'iniettare inizialmente un colorante fluorescente per la linea cellulare nel tuorlo di un embrione selvatico o transgenico GFP allo stadio ad una singola cellula. In questo esempio, abbiamo iniettato dextrina Alexa 594 in embrioni di tipo selvatico.

Alla fase ad una cellula, li abbiamo lasciati sviluppare fino alla fase shield gasa, quindi abbiamo eseguito quattro trapianti mirati al cervello come descritto in precedenza. Tuttavia, invece di ciò, abbiamo trapiantato in gastrule transgeniche ospiti l'immagine del cefalone dorsale mediante scansione laser. La microscopia confocale ha rivelato ammassi fluorescenti rossi di cellule donatrici tra nuclei positivi per GFP all'interno del proencefalo.

Abbiamo ulteriormente analizzato questo ospite raccogliendo immagini Zacks ogni tre minuti per un periodo di due ore mediante microscopia confocale a scansione laser. La ricostruzione in quattro dimensioni di questa sequenza temporale, ottenuta con il software Velocity fornito da IMP, mostra movimenti cellulari dinamici delle membrane delle cellule del dominio del bastoncello e dei nuclei positivi per GFP. Vi abbiamo appena mostrato come preparare tutta l'apparecchiatura e i reagenti necessari per trapianti cellulari in embrioni di pesce zebra.

In particolare, abbiamo dimostrato la tecnica allo stadio di gastrula. Tuttavia, essa è applicabile anche a trapianti allo stadio di blastula. Quando si utilizza questa procedura, è importante correlare con precisione la posizione finale desiderata delle cellule trapiantate con la precedente mappa del destino di queste cellule nella gastrula. Si consulti lo studio dettagliato del Dott. Scott Frazier del 1995 intitolato Fate Maps of the Zebrafish Embryo per ulteriori indicazioni.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.