Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

Questa procedura inizia con il rivestimento di embrioni di zebrafish unicellulari in una piastra per microiniezione. Micro iniettare una soluzione di destrina fluorescente nel tuorlo. Appena sotto gli embrioni iniettati con la cellula ci sono i tuoi donatori di trapianto.

Unire gli embrioni donatori e ospiti e crescere fino allo stadio scudo caricare due embrioni iniettati con destrina rivestita di DEC fianco a fianco in un pozzetto di una piastra di trapianto. Ripeti sotto ogni coppia di donatori. Aggiungere un embrione ospite per pozzetto per indirizzare le cellule trapiantate al futuro dicefalo delle cellule del trapianto di proencefalo da e verso la linea mediana.

A metà strada tra il palo dell'animale e lo scudo. Trapiantare le cellule dal gasa donatore nel gasa ospite. Crescere fino a 30 ore di fissaggio.

Eseguire l'immunochimica se necessario, montare e creare l'immagine. In alternativa, montare l'host dal vivo ed eseguire l'imaging time lapse. Ciao, mi chiamo Elizabeth De Shane del laboratorio del Dr.Michael ESI nel Dipartimento di Scienze Biologiche dello Smith College di Northampton, Massachusetts.

E io sono il ricercatore principale del laboratorio, il dottor Michael Besi. Oggi ti mostreremo come creare embrioni chimerici conducendo trapianti di cellule allo stadio gastrico utilizzando il sistema modello di zebrafish. Utilizziamo questa procedura nel mio laboratorio per studiare la funzione di geni specifici sullo sviluppo della commessura del prosencefalo e il processo delle interazioni gliali degli assoni durante la formazione della commessura.

Quindi iniziamo. Per iniziare, preparare gli stampi per le piastre di microiniezione rompendo accuratamente a metà tre capillari non filamentosi lunghi un millimetro e quattro pollici. Usando la super colla, incolla due delle metà dei capillari una accanto all'altra su una colla per superfici piane.

Il terzo capillare sopra questi due si annidava nella scanalatura per creare una forma piramidale. Con i tre capillari, lasciare asciugare lo stampo. Dovresti fare da tre a cinque stampi per ogni piastra di iniezione.

Successivamente, preparare le piastre di iniezione versando da 20 a 25 millilitri di aros fuso all'1,5% in terreno embrionale in una capsula di Petri da 100 millimetri. Posizionare immediatamente da tre a cinque degli stampi preparati sul fondo della piastra, assicurandosi che il lato piatto dello stampo tocchi il fondo della capsula di Petri e sia completamente coperto da aros. Quando l'aros si sarà solidificato, togliete gli stampini ritagliando un grande quadrato di aros che li contiene.

Sfilare delicatamente l'agar sulla periferia del quadrato tagliato e scartarlo. Capovolgere il pezzo quadrato di agar e, utilizzando una pinza fine, rimuovere completamente gli stampi. Versare l'aros fuso nella capsula di Petri intorno al quadrato per tenere in posizione i pozzetti appena modellati.

Lascia che si solidifichi. Le piastre possono essere sigillate in paraforma e conservate per settimane a quattro gradi Celsius. Dovrebbero essere scartati se ci sono segni di crescita nell'agar.

Infine, per preparare gli aghi per iniezione, utilizzare un estrattore capillare per micropipette per realizzare gli aghi da capillari di vetro da un millimetro e quattro pollici con filamenti interni con la piastra per microiniezione e gli aghi preparati. Diamo un'occhiata alla raccolta degli embrioni e alla configurazione dell'apparato di microiniezione. Gli ovuli fecondati vengono raccolti immediatamente dopo essere stati deposti e conservati in una capsula di Petri riempita con terreno embrionale.

Utilizzando una pipetta di vetro a punta larga, espellere gli embrioni nei pozzetti di una stanza. Piastra di iniezione a temperatura riempita con mezzo embrionale. Usa una pinza smussata per incastrare delicatamente gli embrioni sul fondo delle mangiatoie Gli embrioni il cui corian o tuorlo sono stati compromessi dovrebbero essere scartati.

Quindi, caricare l'ago per iniezione con uno o due microlitri di soluzione fluorescente diluita di destrine Alexa 5 9 4. Lasciare che la destrina raggiunga la punta dell'ago per iniezione per azione capillare. Collegare l'ago per iniezione al supporto capillare di un micromanipolatore stereotassico e regolare la pressione sull'apparato del microiniettore per cominciare.

Da 40 a 50 PSI e una durata dell'impulso di 500 millisecondi. Usa una pinza per sfiorare delicatamente o taglia la punta dell'ago per iniezione per rompere il sigillo. Idealmente, il diametro dovrebbe essere compreso tra 0,05 e 0,15 millimetri.

Per calibrare l'ago, utilizzare uno stereomicroscopio ed espellere la destrina su un micrometro con sopra dell'olio minerale. Modifica la dimensione del bolo regolando la pressione dell'aria, la durata dell'impulso e la dimensione dell'ago. Mancia. Una dimensione del bolo equivalente a un volume da 0,8 a un nanolitro deve essere mantenuta durante le iniezioni.

Ora possiamo iniziare la microiniezione di destrina utilizzando un ingrandimento di circa 3,2 x su uno stereomicroscopio. Iniziare le iniezioni di embrioni da un'estremità della mangiatoia perforando dolcemente il corion e la membrana cellulare degli embrioni per entrare nel tuorlo. Iniettare la soluzione di destrina appena sotto la cellula.

Assicurati di rimuovere l'ago per iniezione con lo stesso movimento fluido utilizzato per entrare nell'embrione. Spostare la capsula di Petri per posizionare l'embrione successivo in linea e continuare a iniettare lungo la lunghezza della mangiatoia. Controllare periodicamente la pressione e la dimensione del bolo.

Ora usa una pinza per spingere delicatamente gli embrioni fuori dalle mangiatoie. Trasferiscili in una capsula di Petri riempita con embrione di antibiotico. Medio. Incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius e monitorarli per ovuli non fecondati o morte.

Gli embrioni sono ora pronti per i futuri trapianti. Prima del completamento di una razione di poli, parti del tuorlo rimangono esposte. Il tuorlo è estremamente fragile e aderisce e si strappa facilmente sulla plastica della capsula di Petri.

Pertanto, gli embrioni devono essere rivestiti su una piastra rivestita un giorno prima che avvengano i trapianti. Prepara queste piastre decorative versando da cinque a 10 millilitri di aros fuso in una capsula di Petri da 100 millimetri. È necessario solo un sottile strato di aros, di circa due o tre millimetri, per ammortizzare gli embrioni durante la decorazione.

Lasciate raffreddare i piatti. Successivamente, creare piastre di trapianto separate versando 30 millilitri di soluzione di aros all'1,5% in una piastra di Petri da 100 millimetri e inserire uno stampo per pozzetti di trapianto. Lo stampo dovrebbe contenere 104 divot triangolari, ciascuno composto da tre lati a 90 gradi e 1 lato angolato a 45 gradi.

I pozzetti sono progettati per contenere due embrioni fianco a fianco. Fare attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto lo stampo e lasciare che gli agros si induriscano. La rimozione dello stampo rivela un'area infossata contenente i pozzetti quadrati con un bordo inclinato.

Per preparare gli embrioni ospite e donatore per il trapianto, il loro sviluppo deve essere monitorato per mantenere accoppiamenti quasi uguali per l'età. Per fare ciò, gli embrioni possono essere allevati a temperature variabili da 23 a 31 gradi Celsius per rallentare o accelerare lo sviluppo. Sia gli embrioni ospiti che quelli donatori devono essere rivestiti a mano su una piastra di rivestimento rivestita un'ora prima dell'età desiderata.

Nel caso di trapianti allo stadio gastrogastro, questo dovrebbe essere completato entro cinque ore dopo la fecondazione o HPF prima dello stadio di scudo a 5,5 HPF. Utilizzare una pipetta di vetro per caricare gli embrioni dell'ospite e di un donatore in una piastra di trapianto riempita con terreno embrionale antibiotico. Qui la prima fila è riempita con embrioni donatori con due embrioni per pozzetto, mentre le due file successive sono riempite con un singolo embrione ospite per pozzetto.

Per i trapianti, utilizziamo uno stereomicroscopio fluorescente Luer Zeiss con zoom e manipolazione della messa a fuoco completamente automatizzati controllati da joystick. Sebbene questo microscopio automatizzato non sia necessario, aumenta notevolmente la facilità e l'efficienza di questi trapianti chirurgici di precisione, soprattutto quando si desidera un numero elevato di trapianti. Per installare l'apparato di trapianto, posizionare il tram aereo einor nella posizione centrale della sua scala, collegare il tubo del tram aereo al supporto capillare e fissare il supporto al micromanipolatore automatizzato einor Con gli embrioni e l'apparato di trapianto preparati, possiamo ora passare ai trapianti di cellule allo stadio gastro.

L'abilità più critica nel completamento dei trapianti di cellule allo stadio gastrogastro è la capacità di riconoscere l'anatomia cellulare del labbro APO dei blasti dorsali, noto anche come scudo nel pesce zebra. Qui presentiamo un filmato in sequenza della gastrula da diversi punti di vista ed evidenziamo dove si trova lo scudo in questa vista laterale. Lo scudo o lato dorsale è a destra nel contorno rosso per indirizzare le cellule al proencefalo trapiantare le cellule da e verso la linea mediana.

Esattamente a metà strada tra il palo dell'animale e lo scudo, inizieremo a ruotare l'embrione prima verso di te per visualizzare il palo dell'animale, evidenziando lo scudo e il sito del trapianto lungo il percorso. Successivamente, l'embrione ruota sul proprio asse per posizionare lo scudo in basso. Il gastro ora ruota di nuovo verso l'alto, offrendoti una vista dorsale diretta.

L'embrione viene ora ruotato di nuovo in sequenza in una vista laterale a sei HPF. Utilizzando il micromanipolatore, sfiorare delicatamente l'embrione con la punta del capillare per ruotarlo in una posizione per l'estrazione delle cellule in modo tale che la sua linea mediana e lo scudo siano visibili e si oppongano alla punta del capillare, gli embrioni del donatore sono facilmente verificabili passando dal campo chiaro all'illuminazione fluorescente. Qui, le cellule del rosso gastrofluorescente aspirano una piccola quantità di terreno embrionale nel capillare per eliminare ogni possibilità che le cellule entrino in contatto con l'interfaccia aria-acqua che le danneggerebbe.

Forare delicatamente l'ectoderma dell'embrione donatore sulla linea mediana esattamente tra il palo dell'animale e lo scudo. C'erano solo circa 20 micrometri di cellule tra l'ectoderma superficiale e il tuorlo sottostante nel gasa. Quindi fai attenzione a non impalare, il tuorlo perché spesso porta alla morte nel giro di poche ore.

Utilizzando il tram d'aria, aspirare lentamente le cellule nel capillare. Mantenere sempre la visibilità della linea di galleggiamento agitando leggermente la punta. Mentre all'interno il donatore aiuterà ad allentare i contatti cellula-cellula.

Circa 10-50 cellule dovrebbero essere estratte dall'embrione del donatore. Quindi, rimuovere il capillare dal donatore. Allo stesso modo, orientare l'ospite e perforare ed espellere le cellule nella stessa identica posizione In un embrione ospite, il passaggio dal campo chiaro all'illuminazione fluorescente rivela il movimento delle cellule marcate con destrina nell'ago capillare nell'embrione ospite.

Infine, dopo il trapianto, rimuovere gli embrioni donatori e ospiti dai pozzetti. Separali e posizionali delicatamente su una capsula di Petri rivestita di A riempita con embrione antibiotico. Incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius con i trapianti completati.

Iniziamo con la visualizzazione e l'imaging. Gli embrioni iniziano fissando gli embrioni allo stadio appropriato per l'imaging in un conservante verificato dall'immunochimica. Nel nostro caso, questo sarebbe in 4% di formaldeide per due ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius in rotazione.

A seguire, sciacquare gli embrioni fissati due volte e poi lavarli per tre-cinque minuti. In 0,1 pb. molare Se necessario, eseguire un'adeguata etichettatura immunologica.

Metti gli embrioni nel glicerolo al 75%, immergili a temperatura ambiente e conservali a quattro gradi Celsius. Preparare un vetrino per montare due embrioni creando due contorni quadrati di vaselina su un vetrino che corrispondano al diametro interno di un quadrato. Copri scivolare accanto a un tuo embrione ed eseguire tutte le dissezioni necessarie per ottenere una visione frontale del proencefalo.

Sezionare il proencefalo tagliandolo perpendicolarmente attraverso il mesencefalo. Posizionare questo tessuto con una quantità minima di glicerolo all'interno del petrolio. Orientare bene il tessuto nella posizione appropriata e posizionare un vetrino coprioggetti sul campione.

In alternativa, per gli embrioni vivi, montarli in una soluzione agro allo 0,75% su vetro. Piastre di coltura inferiore prima che l'agro si solidifichi, utilizzare un ago di tungsteno per manipolare l'embrione nell'orientamento corretto per l'imaging. Vengono create immagini sia degli host fissi che di quelli attivi.

Utilizzando il microscopio confocale a scansione laser Leica SP five, vengono acquisite pile di ZS e l'elaborazione di immagini tridimensionali o quadridimensionali viene condotta utilizzando il software di velocità per generare embrioni chimerici in cui una parte della popolazione astrogliale all'interno dell'embrione è diversa per genotipo o fenotipo. Abbiamo utilizzato un approccio multiforme che combina l'uso di embrioni transgenici GFP, che marcano l'astroglia con l'uso del trapianto di cellule gastro stadio, per indirizzare specificamente i nostri cloni al cephalon. Abbiamo utilizzato la mappa del destino gastro del pesce zebra per estrarre selettivamente le cellule sulla linea mediana equidistanti dal polo dell'animale e dallo scudo.

Queste cellule estratte sono state poi trapiantate nella stessa posizione in un gasa ospite wild type, che è stato poi portato a 30 HPF e immunomarcato per tutti gli assoni come punti di riferimento per l'anatomia del cervello. Nell'esempio mostrato qui, l'imaging confocale di un embrione ospite rivela cellule GFP positive isolate in tutto il cephalon e il cephalon. La morfologia completa di queste cellule GFP positive può essere osservata in questo test clonale, rivelando che la maggior parte di queste cellule assume la caratteristica morfologia gliale radiale in cui il soma si trova adiacente alla zona ventricolare e un grande piede terminale termina un processo radiale sulla superficie della buccia.

Il rendering tridimensionale dello Zack di queste fette ottiche raccolte mostra chiaramente la posizione di queste cellule rispetto agli assoni marcati. Un altro approccio comunemente utilizzato per visualizzare le cellule trapiantate consiste nell'iniettare inizialmente un colorante fluorescente di linea cellulare nel tuorlo di un embrione transgenico di tipo selvatico o GFP a una cellula. In questo esempio, abbiamo iniettato la destrina di Alexa 5 94 in embrioni di tipo selvatico.

A uno stadio cellulare abbiamo permesso loro di svilupparsi allo stadio di scudo gasa e poi abbiamo effettuato quattro trapianti cerebrali mirati come menzionato sopra. Invece, abbiamo trapiantato in una gastrula ospite transgenica l'imaging del cefalo dorsale mediante scansione laser. La microscopia confocale ha rivelato cluster rossi fluorescenti di cellule di donatori tra i nuclei positivi alla GFP all'interno del proencefalo.

Abbiamo ulteriormente analizzato questo ospite raccogliendo Zacks ogni tre minuti nel corso di due ore con la scansione laser confocale. Il rendering quadridimensionale di questo lasso di tempo utilizzando il software di velocità di IMP mostra i movimenti cellulari dinamici delle membrane cellulari del domine a bastoncello, e dei nuclei positivi alla GFP. Vi abbiamo appena mostrato come preparare tutti gli apparecchi e i reagenti necessari per i trapianti di cellule in embrioni di zebrafish.

In particolare, abbiamo dimostrato la tecnica nella fase gaso. Tuttavia, è applicabile anche ai trapianti allo stadio di blastula. Quando si utilizza questa procedura, è importante correlare con precisione la posizione finale desiderata delle cellule trapiantate con la precedente posizione della mappa del destino di queste cellule nel gas consultare, lo studio dettagliato del Dr.Scott Frazier sulle mappe del destino del pesce zebra del 1995 intitolato Mappe del destino dell'embrione di pesce zebra per ulteriori indicazioni.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.