Quantificare la frequenza di tumori di moltiplicazione celle usando Limitare trapianto di cellule Diluizione in Singenico Zebrafish

Il saggio di trapianto di cellule a diluizione limitante è il gold standard per valutare il potenziale di auto-rinnovamento nei modelli animali sperimentali. In questa dimostrazione, embrioni di zebrafish singenici in uno stadio cellulare vengono iniettati con RAG due MIC e RAG due GFP per creare zebrafish transgenico che svilupperà leucemia linfoblastica acuta a cellule T marcata in fluorescenza. Entro 60 giorni di vita, le cellule leucemiche primarie vengono isolate dal pesce zebra e quindi purificate utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.

Successivamente, le cellule vengono trapiantate a diluizione limite nella cavità peritoneale del pesce zebra adulto e i pesci vengono monitorati per la crescita tumorale per un massimo di 90 giorni. Infine, il programma software statistico per l'analisi della diluizione estremamente limitante viene utilizzato per quantificare la frequenza delle cellule che si propagano per la leucemia all'interno del tumore originale. L'analisi del trapianto di cellule a diluizione limitante consente agli investigatori di valutare con precisione il numero di cellule autorinnovanti contenute all'interno della maggior parte della massa tumorale.

Sono queste cellule che si auto-rinnovano che guidano la formazione del cancro e sono in ultima analisi responsabili della recidiva. Il vantaggio principale di eseguire saggi di trapianto di diluizione limitante nel modello di pesce zebra è che molti pesci possono essere trapiantati per ogni esperimento, con conseguente migliore precisione nel determinare la frequenza delle cellule tumorali che si auto-rinnovano. Questo metodo fornisce informazioni sulle cellule che si propagano nel tumore nelle cellule T, una leucemia linfoblastica acuta.

Può anche essere applicato per comprendere altri modelli di cancro del pesce zebra. Jessica Blackburn, una borsista del laboratorio e Sally Liu, un tecnico di talento, dimostreranno la procedura per voi oggi Per linearizzare Rag due CM e RAG due costrutti G-F-P-D-N-A Digerire 10 microgrammi di ciascun plasmide con l'enzima di restrizione, non uno a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'estrazione del cloroformio di fenile e la precipitazione dell'etanolo, sospendiamo ogni plasmide in 20 microlitri di acqua.

Determinare le concentrazioni di DNA su un gel agro all'1% eseguendo una diluizione uno-a-uno, da uno a cinque e da uno a 10 di ciascun plasmide digerito con 20 microlitri, 10 microlitri e cinque microlitri di una scala di DNA di fascia alta. Ora diluire il DNA a una concentrazione finale di 60 nanogrammi per microlitro per l'iniezione in CG one strain syngen. Un embrione di pesce zebra inietta 250 nanolitri di 30 nanogrammi per microlitro di rag, due CM e 30 nanogrammi per microlitro.

Stracciare due GFP in embrioni di pesce zebra in uno stadio cellulare mirando attentamente il DNA direttamente nella cellula e non nel tuorlo. Conservare gli embrioni iniettati a 28,5 gradi Celsius e rimuovere gli embrioni morti dopo 24 ore a cinque giorni di vita, trasferire gli animali in grandi serbatoi circa 28 giorni dopo l'iniezione. Anestetizzato il pesce zebra larvale aggiungendo 200 microlitri di quattro nanogrammi per millilitro trica S a 25 millilitri di acqua del sistema ittico in una capsula di Petri.

Esaminare le larve per lo sviluppo di TALL marcato in fluorescenza utilizzando un microscopio a epifluorescenza per rilevare la fluorescenza GFP. Separare le larve positive al tumore da quelle negative per garantire che nessun pesce leucemico venga trascurato nell'analisi. Le larve negative possono essere esaminate in un secondo momento, una volta che i tumori possono essere cresciuti più grandi, monitorare i pesci leucemici marcati in fluorescenza almeno una volta alla settimana utilizzando il microscopio a epifluorescenza per monitorare la crescita del tumore.

Quando le cellule leucemiche GFP positive hanno superato più del 50% dell'animale, aggiungere un millilitro di quattro nanogrammi per millilitro. Trica S in una capsula di Petri contenente nove millilitri di acqua del sistema ittico per sacrificare il pesce, mettere il pesce in una nuova capsula di Petri contenente un millilitro di siero bovino fetale al 5% in 0,9 XPBS, macerare il pesce con una lama di rasoio, pipettare la miscela per dissociare grandi grumi cellulari. Quindi passare le cellule attraverso un colino a maglie da 40 micrometri in una provetta da 50 millilitri.

Pipettare 500 microlitri di cellule in una provetta di polistirene da quattro millilitri. Aggiungi un microlitro di milligrammo per millilitro, ioduro di peridio per etichettare il vortice delle cellule morte, quindi mantieni le cellule sul ghiaccio. Preparare anche un pesce CG di tipo selvatico per raccogliere le cellule del sangue normali, che fungono da vettore per le cellule tumorali durante il trapianto a quattro millilitri di 5% FPS in 0,9 X PB S al tubo da 50 millilitri per un volume totale di cinque millilitri.

Contare le cellule del sangue normali, diluirle a tre volte da 10 a una quinta cellula per millilitro in FBS al 5% in 0,9 x pbs, quindi pipettare 100 microlitri per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti utilizzando un selezionatore di cellule attivato a fluorescenza, selezionare le cellule tumorali PI negative GFP positive nella piastra a 96 pozzetti contenente le cellule del sangue alle dosi indicate. Inoltre, selezionare 10.000 cellule in un pozzetto senza cellule del sangue normali e rianalizzare utilizzando i fatti per valutare la purezza e la vitalità della centrifuga di cellule selezionate. La piastra a 96 pozzetti a 2000 GS per 10 minuti per pellettare le cellule.

Rimuovere 95 microlitri di snat e risospendere le cellule nei restanti cinque microlitri. Iniettare la sospensione cellulare nella cavità peritoneale di zebrafish sincronico adulto di età superiore a 60 giorni utilizzando una micro siringa da 26 gauge e mezzo. I pesci zebra non devono essere anestetizzati prima del trapianto.

Trapiantare 45 pesci con 10 cellule leucemiche, 20 pesci con 100 cellule, sette pesci con 1000 cellule e cinque pesci con 10.000 cellule alte circa 28 giorni dopo il trapianto. Esaminato il pesce zebra ricevente con un microscopio a epifluorescenza utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione 4 85 20 e un filtro di emissione 5 30 25. Per rilevare la fluorescenza GFP.

Registrare il numero di pesci positivi per numero totale di pesci iniettati. Riesaminare il pesce ogni 14 giorni per un massimo di 90 e registrare il numero di pesci positivi. Quando un tumore positivo il pesce diventa più abbondante.

Sacrificare l'animale per sovradosaggio di trica US, inserire i risultati in una tabella e caricare i dati nel software di analisi della diluizione limitante estrema basato sul web per determinare la frequenza delle cellule leucemiche auto-rinnovanti all'interno del CG primario CALL un ceppo embrioni sono stati iniettati con RAG due cmic e RAG due larve GFP sono stati sottoposti a screening per TALL primario Dopo 28 giorni coerente con il lavoro precedente, circa il 5% dei pesci iniettati ha cellule T GFP positive all'interno del timo e il 100% di questi pesci svilupperà la leucemia. Qui, le cellule TALL marcate in fluorescenza sono state selezionate da animali malati di 65 giorni e utilizzate nel test di trapianto di cellule di diluizione limitante. In primo luogo, è stata disegnata un'andatura per selezionare le singole cellule.

Quindi sono state selezionate le cellule negative allo ioduro di propidio. E infine è stata disegnata un'andatura per selezionare solo le cellule leucemiche GFP positive per lo smistamento. In questo esempio di pesce trapiantato TALL al giorno 28, i tumori in fase iniziale sono stati osservati come un'area di cellule GFP positive vicino al sito di iniezione.

Mentre alcuni TLS erano più progrediti, essendosi espansi per riempire la cavità peritoneale per questi esperimenti, sono stati trapiantati oltre 220 animali, il che può essere facilmente realizzato da una sola persona in poche ore. L'analisi dei dati con il software elda ha mostrato che, in media, una su 135 cellule T erano cellule che si auto-rinnovano per la leucemia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trapiantare le cellule tumorali alla diluizione limite nella cavità peritoneale del pesce zebra singenetico e di come utilizzare i dati risultanti per determinare la frequenza delle cellule che si propagano del tumore all'interno di un dato tumore.

Ulteriori studi su animali geneticamente modificati possono aiutare a identificare i meccanismi che regolano l'autorinnovamento di queste cellule che si propagano tumorale.