Name: Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Impara l'imaging multicolore time-lapse in zebrafish transgenici per studiare l'attivazione delle cellule staminali retiniche dopo ablazione neuronale mirata. Questo metodo consente di analizzare i meccanismi rigenerativi in vivo.

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Desideriamo ringraziare Drs. Meera Saxena e Jonathan Mathias per gli utili commenti sul manoscritto. Ringraziamo Drs. Michael Parsons, Pamela Raymond, e Rachel Wong per la fornitura di linee transgeniche. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal protocollo approvato IACUC MCG 07-12-003 * B. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R21 MH083614 e March of Dimes Basilio Scholar Award O Conner Starter per JSM

<ol><li>Köster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li>
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 zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
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 confocal microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

JSM ha ottenuto un brevetto sull&#39;utilizzo della nitroreductase sistema basato su di ablazione delle cellule in zebrafish (Mumm JS, e Schroeter, EH ablazione ablazione mirata e regionali cellulare in Zebrafish &quot;US Patent 7514595. 7 aprile 2009). Questa tecnica è utilizzato come piattaforma generale per una serie di strumenti e della biotecnologia società di servizi, Luminomics, Inc., che JSM fondato e rimane una delle parti interessate in

In questo video, una panoramica delle tecniche che usiamo per multicolore confocale time-lapse imaging e l&#39;ablazione delle cellule bersaglio è fornito. Ci avvaliamo di time-lapse imaging per monitorare il comportamento dei diversi tipi di cellule di interesse in vivo, mentre l&#39;ablazione delle cellule bersaglio viene utilizzato per studiare la funzione del circuito e delle cellule neuronali specifici paradigmi rigenerazione neuronale. Gli esempi riportati evidenziano diversi vantaggi che possono essere raccolte da questi approcci. Forse più significativa, time-lapse imaging fornisce un paradigma internamente controllata; fenomeni qualsiasi osservati possono essere legati a stati di nuovo precedenti. Questo permette un confronto diretto, piuttosto che dedurre da effettuare attraverso punti di tempo sperimentali, apportando modifiche relativamente facile da quantificare e riducendo sperimentale &#39;rumore&#39; associata a variazioni all&#39;interno di una popolazione. Un vantaggio di immagine multicolore è la capacità di visualizzare le modifiche ad interagire e / o tipi di cellule vicine. Ad esempio, utilizzando una linea transgenica che le etichette glia Müller, siamo ora che caratterizzano la risposta di questi potenziali lesioni indotte da cellule staminali per la perdita di discreto sottopopolazioni di cellule della retina. Abbiamo anche usato questo metodo per definire nuovi meccanismi di formazione del circuito neurale 2. Infine, oltre agli studi di rigenerazione cellulare, abbiamo recentemente iniziato a utilizzare il NTR sistema basato ablazione per indagare il ruolo funzionale dei sottotipi neuronali così i circuiti neurali separati utilizzando diversi paradigmi comportamentali e analisi elettrofisiologiche. Il vantaggio unico di impiegare il pesce zebra per tali studi è che, grazie alla loro capacità rigenerativa, i deficit indotti sono temporanee. Così, da correlare con time-lapse analisi di immagini si possono caratterizzare i meccanismi che portano alla reinnervazione, così come il grado di reinnervazione necessari per il recupero funzionale. Le modalità previste può essere adattato a molte domande differenti. Per esempio, analisi simili di ablazione e di rigenerazione può essere applicato a qualsiasi sottotipo transgenically definibile cellulare. Collettivamente, questi studi hanno un potenziale di espandere la nostra comprensione della rigenerazione a livello di tipi di cellule individuali ed entro nicchie discrete cellule staminali.

1. Reagenti: Soluzione Danieau di: <ul><li> cloruro di sodio (Fisher, S271 1) </li><li> cloruro di potassio (Fisher, P217 500) </li><li> HEPES (Fisher, BP310500) </li><li> solfato di magnesio (Fisher, M65 500) </li><li> nitrato di calcio (Fisher, C109500) </li><li> Penicillina-streptomicina (Fisher, ICN1670049) </li></ul> Altri reagenti: <ul><li> Bassa temperatura di fusione agarosio (Fisher, BP165-25) </li><li> Tricane metanosolfonato (Fisher, NC9435281) </li><li> N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) </li><li> Metronidazolo (Fisher, AC21034-1000) </li></ul> 2. Forniture: <ul><li> Profonda petri-piatti (Fisher Scientific / Corning, 08-772-32) </li><li> Dumont # 5 pinza sottile (Fisher, NC9404145) </li></ul> 3. Attrezzatura: <ul><li> Zoom stereoscopio (Olympus, SZ51) </li><li> Fluorescenza stereoscopio Zoom (Olympus, SZX16) </li><li> Microscopio confocale (Olympus FV1000) </li><li> Digital riscaldamento blocco - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) </li><li> Barnstead / Thermolyne Incubatore da banco (Fisher, 11-702-4). </li></ul>

multicolor time-lapse imaging di transgenici zebrafish: visualizzare cellule staminali della retina attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Ad alta risoluzione time-lapse imaging di larve di zebrafish vivente può essere utilizzato per visualizzare come i processi biologici si svolgono (per una rassegna vedi 1). Pesce composto transgenici che esprimono diversi reporter fluorescente in tipi di cellule vicine fornire un mezzo di seguire interazioni cellulari 2 e / o tessuto risposte a livello di manipolazioni sperimentali nel corso del tempo. In questo video, dimostriamo metodi che possono essere utilizzati per l&#39;imaging più tipi di cellule transgenically etichettati serialmente nel pesce singoli corsi nel tempo che può estendersi da pochi minuti a diversi giorni. Le tecniche descritte sono applicabili a qualsiasi studio cercando di correlare il &quot;comportamento&quot; della vicina tipi di cellule nel tempo, tra cui: &#39;catch and release&#39; 1) seriale metodi per l&#39;imaging di un gran numero di pesci più giorni consecutivi, 2) metodi semplificati per la separazione fluorofori con sovrapposizione di eccitazione / emissione di profili (ad esempio, GFP e YFP), 3) uso di ipopigmentate linee mutanti di estendere la finestra temporale a disposizione per imaging ad alta risoluzione in ritardo stadi larvali di sviluppo, 4) uso di membrane mirato reporter fluorescente per rivelare multa dettaglio morfologico delle singole cellule così come i dettagli cellulari in grandi popolazioni di cellule, e 5) un metodo precedentemente descritto per chimicamente indotte ablazione di tipi di cellule transgenically mirata, cioè, nitroreductase (NTR) conversione mediata di substrati profarmaco, come il metronidazolo (MTZ), ai derivati ​​citotossici 3,5. Come esempio di questi approcci, si visualizzerà l&#39;ablazione e la rigenerazione di un sottotipo di retina bipolare neurone all&#39;interno di singoli pesci più giorni. Contemporaneamente ci sarà monitorare diversi altri tipi di cellule della retina, compreso vicini e non mirato le cellule bipolari e il potenziale degenerazione stimolate le cellule staminali della retina (ad esempio, glia Mϋller). Questa strategia viene applicata nel nostro laboratorio per la caratterizzazione delle cellule e dei tessuti a livello (ad esempio, di nicchia delle cellule staminali) risposte alla perdita selettiva e la rigenerazione di mirati tipi di cellule neuronali.

In questo video, le tecniche per multicolor confocale time-lapse imaging e ablazione delle cellule bersaglio sono forniti. Time-lapse imaging è utilizzato per monitorare il comportamento dei diversi tipi di cellule di interesse<em&gt; In vivo</em&gt;. L&#39;ablazione delle cellule bersaglio facilita il circuito neurale funzione di studio e cellule specifici paradigmi rigenerazione neuronale.

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

L'imaging time-lapse ad alta risoluzione di larve di zebrafish vive può essere utilizzato per visualizzare come si sviluppano i processi biologici (per una rassegna, si veda 1). Il composto ...

L'espressione di reporter fluorescenti in animali transgenici permette di seguire le risposte cellulari a manipolazioni sperimentali in modelli viventi di malattia. Qui, la perdita selettiva di cellule viene indotta farmacologicamente nel pesce zebra; vengono acquisite immagini multicolore ad alta risoluzione mediante microscopia confocale delle cellule bersaglio e dei loro immediati vicini prima, immediatamente dopo e a intervalli successivi al trattamento con il farmaco. L'analisi delle immagini dimostra l'attivazione di popolazioni endogene di cellule staminali e la successiva sostituzione delle cellule bersaglio durante la fase di recupero.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia rigenerativa, come ad esempio: Quali sono i meccanismi cellulari e molecolari utilizzati per rigenerare tipi cellulari specifici? Iniziare trasferendo le uova transgeniche raccolte da incroci in una capsula di Petri contenente soluzione 0,3 x danio a 16 ore post-fecondazione. Aggiungere PTU per inibire l'attività della tirosina ACE prima di qualsiasi evidenza di pigmentazione nel tessuto di interesse. Se l'embrione non è albino, incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius.Una volta evidenti i reporter, posizionare la piastra di Petri sotto un microscopio stereoscopico a zoom fluorescente e selezionare l'espressione del transgene desiderata. Prima dell'acquisizione delle immagini, preparare una soluzione di montaggio al 0,5% di agarosio a basso punto di fusione in mezzo per embrioni e conservarla a 40 gradi Celsius.Aggiungere trica e PTU se necessario. Mescolare delicatamente e riportare a 40 gradi Celsius. Anestetizzare i pesci ponendoli in un mezzo embrionale contenente trica.Per circa tre minuti, i pesci diventeranno non reattivi. Per toccarli utilizzando una micropipetta, aspirare singoli pesci in una punta di pipetta tagliata con un volume di circa 30 microlitri di soluzione anestetica. Successivamente, capovolgere la pipetta e lasciare che i pesci si depositino sul fondo.Toccare la punta con la soluzione di montaggio e lasciare che il trasferimento avvenga per gravità. Prestare attenzione a non diluire l'agro in modo che possa essere riutilizzato. Smaltire la soluzione anestetica rimanente dalla micropipetta.Quindi, utilizzando la stessa punta, trasferire il pesce in una piastra di Petri. In circa 30 microlitri di soluzione di montaggio, orientare delicatamente il pesce in modo che la regione di interesse sia centrata nella goccia di aeros. Assicurarsi che il pesce mantenga l'orientamento desiderato fino a quando l'aeros non si solidifica.È possibile montare più pesci in una singola piastra di Petri, se desiderato. Dopo che l'agarosio si è solidificato, trasportare i pesci sul palchetto del microscopio confocale e aggiungere delicatamente nel piatto del mezzo per embrioni contenente trica più o meno PTU, fino a quando i pesci non sono completamente immersi. Aprire il software di acquisizione immagini e mettere a fuoco la regione di interesse per un'ottimale visualizzazione dei dettagli cellulari e/o molecolari.Utilizzare obiettivi con lunga distanza di lavoro e alte aperture numeriche nel software. Selezionare le corrette quattro florali dall'elenco del selettore. Fare clic su impostazione spettrale ed effettuare regolazioni sugli intervalli di emissione.Per ottenere una separazione pulita dei segnali del reporter e massimizzare i rapporti segnale-rumore, selezionare l'obiettivo appropriato nel menu a discesa per assicurare che tutti i preset definiti dal software siano regolati correttamente. Per mettere a fuoco i laser e impostare i livelli di potenza, selezionare un output dalla tabella di ricerca che indichi la saturazione dei pixel per ogni canale.Successivamente, impostare la sensibilità del rilevatore per ottenere la qualità dell'immagine desiderata, aumentando gradualmente l'uscita del laser finché l'intensità dell'immagine non risulti accettabile. Evitare la saturazione dei pixel nella regione di interesse e mantenere i livelli del laser il più bassi possibile, al fine di ridurre i problemi di fotobiancamento e fototossicità.Assicurarsi che ogni linea laser produca un segnale rilevabile solo nel canale appropriato attivando e disattivando manualmente i laser mentre si monitorano tutti i canali di acquisizione. Se non è evidente alcun crosstalk, tutti i canali possono essere acquisiti contemporaneamente. Successivamente, inquadrare l'area di interesse utilizzando le funzioni di zoom e rotazione.Impostare quindi la velocità di scansione e le dimensioni dell'immagine utilizzando velocità di scansione più elevate, che riducono il tempo di permanenza del laser e aumentano la risoluzione temporale. Impostare la dimensione del passo nella dimensione Z in base alle esigenze sperimentali. In questo caso, una dimensione del passo di 10 micrometri viene utilizzata per acquisire sette sezioni ottiche di tessuto retinico.Dopo aver determinato le impostazioni appropriate, acquisire le immagini di Zack e salvarle. Successivamente, passare al pesce successivo. L'acquisizione seriale con rilascio immediato può essere eseguita per monitorare le variazioni cellulari nei giorni successivi, seguendo le istruzioni riportate nel documento scritto allegato.Quando si esegue un esperimento di imaging multiplo con reporter, è preferibile utilizzare fluorofori i cui spettri siano ben separati. Tuttavia, ciò non è sempre pratico. Qui mostriamo un semplice metodo di sottrazione delle immagini, mediante il software open source ImageJ, per separare fluorofori con profili di eccitazione ed emissione sovrapposti. Nel nostro caso, GFP e YFP.Le tecniche di imaging temporale descritte in questo video sono state utilizzate per monitorare cellule staminali retiniche marcate con GFP durante l'ablazione e la rigenerazione di neuroni bipolari retinici. Per eseguire la separazione spettrale, acquisire immagini utilizzando modalità di imaging sequenziale e impostazioni variabili del filtro passa-banda, che consentono rispettivamente di acquisire in modo indipendente e di separare parzialmente fluorescenze sovrapposte. Una volta acquisite le immagini, utilizzare l'importazione ImageJ loci bio formas per aprire i file immagine e avviare lo strumento di importazione. Trascinare il file di interesse nella finestra di ImageJ.Dividere i canali in singoli stack utilizzando la casella di controllo "dividi canali" nella finestra di importazione per avviare il plugin allinea tre TP. Fare clic su plugin, quindi su allinea stack. Quindi su allinea tre tp.Le serie devono essere allineate per garantire una corretta sottrazione. Selezionare la serie di riferimento nella prima casella a discesa e la serie non allineata nella seconda. Selezionare le opzioni usa origine relativa XY e usa origine relativa Z, quindi fare clic su ok.Per avviare il processo di allineamento, fare clic sul pulsante di registrazione del volume. Apparirà una nuova finestra contenente i parametri di allineamento. Fare clic su ok.Questa sezione è stata ottimizzata dal distributore del plugin e non richiede modifiche. Al termine, verrà visualizzata una finestra con gli stack allineati. Selezionare l'output dalla finestra allineata per aprire la finestra di output.Questa finestra è anche ottimizzata e non richiede modifiche. Fare clic su OK. Un nuovo stack apparirà nell'area di lavoro con "allineato" aggiunto alla fine del titolo del file.Per rimuovere il crosstalk utilizzando il calcolatore di immagini, fare clic su elabora, quindi su calcolatore di immagini. Selezionare nella casella a discesa immagine uno la serie da sottrarre e nella casella a discesa immagine due la serie da utilizzare nella sottrazione. Nella casella a discesa operazione, selezionare sottrai e fare clic su ok.Image J chiederà di elaborare lo stack. Selezionare sì. Dovrebbe apparire un nuovo stack, che ha eliminato il crosstalk tra i canali sovrapposti.Unire gli stack per ricreare la stessa struttura dell'immagine prima dell'allineamento e della sottrazione. Selezionando i canali uniti nella finestra degli strumenti per i canali, lo strumento consente di fondere fino a quattro stack in un hyper stack. Infine, colorare i canali, regolare luminosità e contrasto e salvare i file in formato tiff per esaminare la perdita mirata e la rigenerazione della nitro riduttasi.Cellule bipolari retiniche che esprimono M cherry. È stata acquisita una serie temporale di immagini confocali in singoli zebrafish prima del trattamento. È presente un'espressione a mosaico del reporter YFP marcato sulla membrana nelle cellule bipolari di controllo, mostrato in giallo, e della proteina fusione cherry nitro riduttasi nelle cellule bipolari bersaglio, mostrata in rosso.Il transgene CFP marcato sulla membrana mostrato in ciano fornisce informazioni contestuali sulla maggior parte delle altre cellule retiniche per una maggiore chiarezza. La stessa immagine senza il segnale CFP è mostrata dopo il trattamento con metronidazolo. Le cellule bipolari esprimenti la nitro riduttasi rosse vengono perse, mentre le cellule bipolari controllate gialle sono risparmiate.Questo dimostra la natura altamente specifica di questa metodologia di ablazione. Ancora una volta, la stessa immagine senza CFP è mostrata per chiarezza. Quando metro NIAZ viene rimosso, le cellule che esprimono NTR ritornano qui.Un esempio del metodo di sottrazione G-F-P-Y-F-P è mostrato in questa figura: GFP etichetta Mueller. Le cellule GL sono mostrate in verde e le cellule bipolari etichettate con YFP sono mostrate in viola. L'overlap tra le due produce il bianco per eseguire la sottrazione.Le immagini GFP e YFP devono essere prima allineate. Il processo di sottrazione consente quindi di rimuovere dall'immagine GFP le cellule bipolari marcate con YFP, permettendo così di rappresentare chiaramente le cellule di Müller marcate con GFP e di rilevare le cellule di Müller più deboli. L'overlap tra le cellule di Müller deboli, ggl e le cellule bipolari marcate con M cherry mostrate in rosso può ora essere verificato.I dati mostrati qui suggeriscono che l'ablazione delle cellule bipolari induce i ggl Muller a sostituire le cellule perse. Questa interpretazione è in linea con studi recenti sulla rigenerazione retinica, che implicano i ggl di Müller come progenitori indotti dal danno sia nei mammiferi che nei pesci. Questa tecnica permette ai ricercatori di esplorare i meccanismi che regolano la rigenerazione di specifici tipi cellulari attraverso la visualizzazione delle cellule staminali nel pesce zebra.

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Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

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Fonte: Williams, A. L., et al. Imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione delle cellule neurali in cresta in migrazione negli embrioni di zebrafish. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra un protocollo di imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare la migrazione delle cellule della cresta neurale in un embrione di zebrafish in tempo reale con alta risoluzione.

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Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l'infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.

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Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle

Impara l'imaging multicolore time-lapse in zebrafish transgenici per studiare l'attivazione delle cellule staminali retiniche dopo ablazione neuronale mirata. Questo metodo consente di analizzare i meccanismi rigenerativi in vivo.

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali (Video) | JoVE Journal

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

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