Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

L'espressione di reporter fluorescenti in animali transgenici rende possibile seguire le risposte cellulari a manipolazioni sperimentali in modelli di malattia viventi. Qui, la perdita cellulare selettiva è farmacologicamente indotta nel pesce zebra, confocale multicolore ad alta risoluzione. Le immagini delle cellule bersaglio e delle cellule immediatamente vicine vengono acquisite prima e subito dopo e i suoi intervalli distanziati dopo l'analisi delle immagini del trattamento farmacologico dimostrano l'attivazione di popolazioni di cellule staminali endogene e la successiva sostituzione delle cellule bersaglio durante la fase di recupero.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia rigenerata, come ad esempio quali sono i meccanismi cellulari e molecolari utilizzati per rigenerare tipi di cellule discrete Inizia trasferendo le uova transgeniche raccolte dagli accoppiamenti in una capsula di Petri contenente una soluzione di danio 0,3 x a 16 ore dopo la fecondazione. ADD PTU per inibire l'attività ACE della tirosina prima di qualsiasi evidenza di pigmentazione nel tessuto di interesse. Se l'embrione non è albino, incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius.

Una volta che i reporter sono evidenti, posizionare la capsula di Petri sotto uno stereomicroscopio zoom fluorescente e selezionare l'espressione transgenica desiderata. Prima dell'imaging. Preparare una soluzione di montaggio aeros a basso punto di fusione allo 0,5% in terreno embrionale e conservarla a 40 gradi Celsius.

Aggiungere trica e PTU se necessario. Mescolate delicatamente e rimettete a 40 gradi centigradi. Anestetizzare i pesci mettendoli in un mezzo embrionale contenente trica.

Per circa tre minuti, il pesce non risponderà. Per toccare con una micropipetta, aspirare i singoli pesci in un puntale di pipetta tagliato in un volume di circa 30 microlitri di soluzione anestetica. Quindi, capovolgere la pipetta e lasciare che il pesce si depositi sul fondo.

Toccare la punta sulla soluzione di montaggio e lasciarla trasferire per gravità. Fare attenzione a non diluire l'agro in modo che possa essere riutilizzato. Eliminare la soluzione anestetica rimanente dalla micropipetta.

Quindi, usando la stessa punta, trasferisci il pesce in una capsula di Petri. In circa 30 microlitri di soluzione di montaggio, orientare delicatamente il pesce in modo tale che la regione di interesse sia centrata nella gocciolina aeros. Assicurati che il pesce rimanga nell'orientamento desiderato fino a quando l'aerodinamica non si solidifica.

Se lo si desidera, è possibile montare più pesci in un'unica capsula di Petri. Dopo che l'aeros si è solidificato, trasportare il pesce allo stadio del microscopio confocale e aggiungere delicatamente il terreno embrionale contenente trica più o meno PTU al piatto fino a quando i pesci non sono completamente sommersi. Apri il software di imaging e concentrati sulla regione di interesse per ottenere un imaging ottimale dei dettagli cellulari e/o molecolari.

Utilizza obiettivi a lunga distanza di lavoro con aperture numeriche elevate nel software. Scegli il flora fours appropriato dall'elenco dei quadranti. Fare clic su impostazione spettrale e regolare gli intervalli di emissione.

Per ottenere una separazione netta dei segnali reporter e massimizzare i rapporti segnale/rumore. Seleziona l'obiettivo appropriato nel menu a discesa per assicurarti che tutte le preimpostazioni definite dal software siano regolate correttamente. Per focalizzare i laser e impostare i livelli di potenza, selezionare un'uscita dalla tabella di ricerca che riveli la saturazione dei pixel per ciascun canale.

Successivamente, impostare la sensibilità del rivelatore per ottenere la qualità dell'immagine desiderata, aumentare gradualmente l'uscita del laser fino a quando l'intensità dell'immagine non è accettabile. Evita la saturazione dei pixel nella regione di interesse e mantieni i livelli del laser il più bassi possibile. Per ridurre i problemi di fotosbiancamento e fototossicità.

Assicurarsi che ogni linea laser produca un segnale rilevabile solo nel canale appropriato accendendo e spegnendo manualmente i laser e monitorando tutti i canali di imaging. Se non è evidente alcuna diafonia, tutti i canali possono essere acquisiti contemporaneamente. Quindi, inquadrare l'area di interesse utilizzando le funzioni di zoom e rotazione.

Quindi imposta la velocità di scansione e le dimensioni dell'immagine utilizzando velocità di scansione più elevate, riduce al minimo il tempo di permanenza del laser e aumenta la risoluzione temporale. Impostare la dimensione del passo della dimensione Z in base alle esigenze sperimentali. Qui viene utilizzata una dimensione del passo di 10 micron per visualizzare sette sezioni ottiche di tessuto retinico.

Una volta determinate le impostazioni appropriate, acquisire le immagini di Zack e salvarle. Quindi passa al pesce successivo. L'imaging seriale di cattura e rilascio può essere eseguito per tenere traccia dei cambiamenti cellulari nei giorni successivi secondo le istruzioni nel documento scritto di accompagnamento.

Quando si esegue un esperimento di imaging multi-reporter, è meglio utilizzare pavimenti ben separati, spettrale, tuttavia, ciò non è sempre pratico. Qui mostriamo un semplice metodo di sottrazione di immagini utilizzando l'immagine software open source J per separare i pavimenti con profili di eccitazione ed emissione sovrapposti. Nel nostro caso, GFP e YFP.

Le tecniche di imaging delle timeline descritte in questo video sono state utilizzate per monitorare le cellule staminali retiniche marcate con GFP durante l'ablazione e la rigenerazione dei neuroni bipolari retinici Per eseguire la separazione spettrale, raccogliere immagini utilizzando modalità di imaging sequenziali e impostazioni variabili del filtro barriera, che consentono di acquisire rispettivamente i quattro piani sovrapposti in modo indipendente e parzialmente separati. Una volta acquisite le immagini, utilizzare l'importazione ImageJ loci bio formas per aprire i file di immagine e avviare lo strumento di importazione. Trascinare il file di interesse nella finestra J dell'immagine.

Dividi i canali in singole pile utilizzando la casella di controllo dividi canali nella finestra di importazione per avviare il plug-in di allineamento a tre TP. Fai clic sui plug-in, quindi allinea le pile. Quindi allineare tre tp.

Le pile devono essere allineate per garantire una corretta sottrazione. Seleziona lo stack di riferimento nella prima casella a discesa e lo stack disallineato nella seconda. Seleziona le caselle usa origine relativa XY e usa origine relativa Z e fai clic su OK.

Per avviare il processo di allineamento, fare clic sul pulsante di registrazione del volume. Apparirà una nuova finestra che contiene i parametri di allineamento. Fare clic su OK.

Questa sezione è stata ottimizzata dal distributore del plugin, quindi non sono necessarie modifiche. Al termine, apparirà una finestra di pile allineate. Seleziona l'output dalla finestra allineata per aprire la finestra di output.

Anche questa finestra è ottimizzata e non necessita di modifiche. Fare clic su OK. Nell'area di lavoro verrà visualizzata una nuova pila con l'aggiunta allineata alla fine del titolo del file.

Per rimuovere la diafonia utilizzando il calcolatore di immagini, fare clic su processo, quindi su calcolatore di immagini. Selezionare la pila da sottrarre nella casella a discesa dell'immagine e la pila da utilizzare nella sottrazione. Nella casella a discesa dell'immagine due, seleziona sottrai nella casella a discesa dell'operazione e fai clic su OK.

L'immagine J chiederà di elaborare la pila. Selezionare Sì. Dovrebbe apparire un nuovo stack, che ha rimosso la diafonia tra i canali sovrapposti.

Unisci le pile per ricreare la stessa struttura dell'immagine prima dell'allineamento e della sottrazione. Selezionando i canali uniti nella finestra degli strumenti del canale, lo strumento consente di unire fino a quattro stack in un hyper stack. Infine, colora i canali, regola la luminosità e il contrasto e salva i file come tiff per esaminare la perdita e la rigenerazione mirate della nitro reduttasi.

M ciliegia che esprime cellule bipolari retiniche. Prima del trattamento, è stata scattata una serie temporale di immagini confocali in singoli zebrafish. C'è un'espressione a mosaico del reporter YFP marcato con membrana nelle cellule bipolari controllate mostrate in giallo e la proteina di fusione della ciliegia nitro reduttasi nei bipolari mirati mostrati in rosso.

Il transgene CFP marcato con membrana mostrato in ciano fornisce informazioni contestuali sulla maggior parte delle altre cellule retiniche per una maggiore chiarezza. La stessa immagine senza il segnale CFP viene mostrata dopo il trattamento con metronidazolo. Le cellule bipolari rosse che esprimono la nitro reduttasi vengono perse, mentre le cellule bipolari gialle controllate vengono risparmiate.

Ciò dimostra la natura altamente specifica di questa metodologia di ablazione. Anche in questo caso, la stessa immagine senza CFP viene mostrata per chiarezza. Quando il metro NIAZ viene rimosso, le cellule che esprimono NTR ritornano qui.

Un esempio del metodo di sottrazione G-F-P-Y-F-P è mostrato in questa figura GFP etichettato Mueller. Le celle GL sono mostrate in verde e le celle bipolari marcate YFP sono mostrate in viola. La sovrapposizione tra i due produce il bianco per eseguire la sottrazione.

Le immagini GFP e YFP devono essere prima allineate. Il processo di sottrazione consente quindi di rimuovere le celle bipolari marcate YFP dall'immagine GFP, consentendo di rappresentare in modo pulito il ggl di Mueller marcato GFP e di rilevare le celle di Mueller più deboli. La sovrapposizione tra le celle bipolari marcate con ciliegia M di Mueller, ggl e M mostrate in rosso può ora essere verificata.

I dati qui mostrati suggeriscono che l'ablazione cellulare bipolare innesca la mullar ggl per sostituire le cellule perse. Questa interpretazione è in linea con i recenti studi sulla rigenerazione retinica, che implicano Mueller Ggl come progenitori indotti da lesioni sia nei mammiferi che nei pesci. Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare i meccanismi che regolano la rigenerazione di specifici tipi di cellule attraverso la visualizzazione delle cellule staminali nel pesce zebra.