Flash Congelamento e criosezionamento E12.5 cervello di topo

Ciao, sono Spencer Curley dell'Università della California, Irvine, e del laboratorio di Ed Maki, e vi mostrerò come eseguire il taglio criostatico. Per farlo, utilizzo innanzitutto questi reagenti comunemente impiegati. Il composto di inclusione o il mezzo di inclusione che uso si chiama OCT, acronimo di optimal cutting temperature.

È una soluzione limpida, molto densa e viscosa, che trattiene bene il tessuto mentre lo si orienta, e successivamente si congela; inoltre, è solubile in acqua, quindi può essere rimossa durante qualsiasi procedura di colorazione. Pertanto, incorporo il tessuto in uno stampo. Questi contenitori per biopsie in stampi criogenici sono disponibili in diverse dimensioni.

Utilizzerò questo stampo più piccolo perché lavoro con tessuti embrionali di topo. Congeliamo rapidamente i nostri tessuti in azoto liquido. Per prima cosa, riempirò questa fiala vuoto-protetta con azoto liquido proveniente dalla bombola qui presente.

Prima di congelare rapidamente il tessuto, è necessario effettuare una crioprotezione del tessuto, altrimenti il congelamento stesso distruggerebbe il tessuto. Pertanto, si immerge il tessuto in una soluzione al 30% di saccarosio per tutta la notte. Se ci vuole più tempo, non è un problema, purché il tessuto affondi.

E come potete vedere, le teste di topo al giorno embrionale 12,5 sono affondate nella soluzione di saccarosio, quindi sono pronte per essere congelate. Ora verserò semplicemente il tessuto presente nella soluzione di saccarosio in una piastra più grande, in modo da poter manipolare il tessuto. Prenderò un po' di OCT e lo verserò in questa piastra da 35 millimetri, che in realtà è appoggiata sul suo coperchio, in modo da poterla posizionare con un angolo adeguato.

Quindi l'OCT si accumula lungo il bordo in profondità. Utilizzo un paio di pinzette smussate più vecchie semplicemente perché non è necessario che siano affilate e non si vuole rovinare un altro paio di pinzette. Prendo quindi una di queste teste con molta delicatezza e la pongo nel primo bagno di OCT.

Voglio semplicemente ricoprire l'embrione con OCT. Questo permette un congelamento del tessuto migliore e più uniforme. Non si desidera alcun residuo di saccarosio attorno al tessuto né bolle d'aria.

Evitare assolutamente le bolle d'aria. Sto quindi mescolando delicatamente l'OCT intorno e sotto la testa, muovendo la testa all'interno dell'OCT e lasciandola riposare per pochi secondi mentre riempio lo stampo criogenico. Ora riempirò lo stampo criogenico con l'OCT, evitando nuovamente la formazione di bolle.

E ora lo riempirò fino all'orlo dello stampo. Come potrete notare, ho etichettato lo stampo, in modo da poter vedere l'orientamento una volta congelato.

Quando l'OCT gela, diventa bianco e non si riesce più a vedere il tessuto. Pertanto, è fondamentale etichettare in modo permanente con un pennarello indelebile. Il, lo stampo criogenico.

In realtà si è formata una bolla nell'OCT, quindi userò la pinzetta per spingerla fuori dal bordo. Non si desidera che ciò interferisca con il congelamento del tessuto. Ora trasferirò la testa da questa piastra nell'OCT contenuto nello stampo.

Lo solleverò semplicemente dalla piastra e lo posizionerò nello stampo molto delicatamente. Poi andrò al microscopio per orientare il tessuto. Ho il tessuto nello stampo criogenico qui, e guarderò attraverso il microscopio in modo da poterlo orientare correttamente.

Sto per eseguire sezioni coronali attraverso questa testa di topo. Pertanto, devo orientarla in modo da poterla posizionare nel criostato per ottenere sezioni coronali. Utilizzo nuovamente queste pinzette arrotondate e, come potete vedere, ci sono alcune bolle d'aria; farò del mio meglio per eliminarle.

Tuttavia, queste bolle più piccole non sono, non sono un problema. Non ho notato alcun effetto negativo da queste bolle più piccole. Semplicemente, non si desiderano bolle di grandi dimensioni.

Quindi li sposterò nel modo migliore possibile e sicuramente pulirò spesso le pinzette, perché in questo modo si evitano meglio le bolle d'aria. Ora, se riuscite a vedere le mie etichette, ho una "t" in alto e una "F" alla mia sinistra. Questo mi indica semplicemente che la testa, la parte superiore della testa, sarà rivolta verso l'alto e la parte frontale o il viso saranno alla mia sinistra.

In questo modo so quale superficie sezionare per ottenere sezioni coronali e sto semplicemente spostando il tessuto. E ancora, a volte questo introduce bolle d'aria e si desidera semplicemente spingerle verso l'esterno in modo che non si congelandino insieme al tessuto. Quindi è negativo avere bolle d'aria, principalmente perché durante il congelamento le bolle possono causare un congelamento non uniforme del tessuto.

Lo scopo del congelamento rapido è quello di congelare tutto istantaneamente. Inoltre, quando si taglia il tessuto al criostato, se la lama attraversa una bolla invece che l'OCT o il tessuto, può causare un incaglio o una lacerazione e, di conseguenza, rovinare o rompere il tessuto. Pertanto, è fondamentale evitare assolutamente queste bolle.

I più grandi soprattutto. Quindi sto ancora orientandolo qui. Questo tessuto è stato fissato per 24 ore, quindi è abbastanza resistente alle mie manipolazioni.

Un altro tessuto potrebbe essere un po' più morbido, quindi è necessario essere molto delicati. Una volta posizionato sotto la lente con la faccia a sinistra e la parte superiore della testa verso l'alto, dovrò assicurarmi che sia corretto anche negli altri piani di orientamento. Solleverò quindi il campione e osserverò attraverso tutte le facce del cubo per verificare che sia posizionato correttamente.

E vedo che è leggermente inclinato verso il basso, quindi devo sollevarlo con la pinzetta. Va bene? E questo richiede sicuramente molta pratica. Va bene, sembra andare bene.

Ora mi avvicinerò qui e la congelerò in azoto liquido. Ok, ora che il tessuto è orientato correttamente nello stampo criogenico, verserò l'azoto liquido in questa piastra qui. Si tratta di una normale piastra di Petri in plastica per colture cellulari, riempita fino all'orlo.

Evapora piuttosto rapidamente. Prenderò la mia pinzetta e abbasserò lo stampo criogenico. E come potete vedere, ho effettivamente piegato il labbro inferiore.

Questo permette sicuramente una manipolazione migliore. Procederò al congelamento. Mentre il tessuto e l'OCT si congelano, diventano di un bianco opaco.

E una volta completato, sarà tutto bianco. Poi devo posizionare rapidamente il tessuto congelato nel congelatore a meno 80 per la conservazione. È necessario tenerlo in modo che il tessuto non venga immerso.

Quindi devi fare molta attenzione a tenerlo solo sulla superficie superiore dell'azoto liquido. Ok, ora è congelato. Tienilo lì ancora per qualche secondo in più prima di passare al meno 80.

Ok, ora lo porterò nel congelatore a -80 °C. Ho prelevato il mio tessuto dal congelatore a -80 °C e lo ho posizionato in questo criostato qui. La camera è effettivamente a -24 °C.

Al momento è necessario lasciare equilibrare il tessuto per circa mezz'ora a un'ora prima di iniziare il sezionamento. Altrimenti, risulta troppo fragile. Poiché tutti i criostati sono diversi, indicherò semplicemente alcuni aspetti fondamentali relativi a questa apparecchiatura.

Pertanto utilizziamo il Leica CM 30 50 s. È una buona apparecchiatura perché dispone di un'unità di raffreddamento separata per il campione stesso, un vantaggio aggiuntivo molto utile. È possibile impostare la temperatura del campione e diversi tessuti richiedono temperature diverse per il taglio.

Quindi, quando si carica per la prima volta il tessuto, è necessario effettuare diverse regolazioni. Queste sono simili su tutti i criostati. Si tratta di componenti elettronici, alcuni dei quali sono azionati manualmente.

Ad esempio, sarà necessario ritrarre il braccio del criostato o avanzarlo per posizionarlo più vicino o più lontano dalla lama. È possibile farlo velocemente o lentamente. È possibile impostare lo spessore del taglio utilizzando questo tasto più o meno qui.

Selezionerete quindi tra il taglio o lo spessore della sezione, indicato sul pulsante centrale qui. Imposterete la temperatura della camera o del campione stesso accanto a questo display digitale semplicemente premendo questo pulsante e utilizzando queste frecce su e giù per regolare la temperatura. Per quanto ci riguarda, quando eseguiamo la criosezione, utilizziamo questi vetrini microscopici Fisherbrand Superfrost Plus.

Sono ricoperti con un adesivo in modo che il tessuto durante la lavorazione non si stacchi. A volte durante il taglio si può notare che il tessuto risulta un po' morbido e alcuni segni di ciò si hanno quando entra in contatto con la lama e si raggruma. Per risolvere questo problema si può utilizzare il congelante super friendly del marchio Fisher.

Esso, è in grado di congelare rapidamente il tessuto; basta puntarlo sul tessuto e premere il grilletto per ricongelare velocemente il campione qualora risulti troppo morbido. Prima di montare il tessuto su un portacampioni per la sezionatura, vorrei mostrarvi brevemente alcune delle componenti di questa apparecchiatura. Questo è il punto in cui si inserisce effettivamente la lama, la quale viene fissata mediante questa piastra metallica.

Tirando verso l'alto questo braccio, è possibile rimuovere e sostituire la lama secondo necessità. Assicurarsi che sia ben fissa. Non bisogna stringere eccessivamente la lama, altrimenti potrebbe deformarsi.

Noterai che nella tua sezionatura lo spessore del tessuto non è costante. Pertanto, non devi spingere completamente verso il basso questo braccio, ma fermarti quando si trova all'incirca allo stesso livello del bordo della lama stessa.

Questo è un altro elemento che potrebbe essere necessario regolare durante la sezionatura. Si chiama piastra anti-oscillazione. È una lastrina di vetro che si inserisce in questo supporto qui e può essere regolata mediante questa vite a molla qui.

E fondamentalmente la si muove in avanti o indietro. In questo modo si mantiene il tessuto o le sezioni piatte, in modo da poterle montare su un vetrino. Un altro aspetto che si potrebbe desiderare di regolare durante il sezionamento è la posizione sulla lama in cui avviene effettivamente il taglio.

Quindi, come si effettua la regolazione? È sufficiente sollevare questa leva per far scorrere l'intero dispositivo a sinistra o a destra. Questa operazione va eseguita solo se si nota che il tessuto si impiglia in una determinata parte della lama oppure se si desidera preservare le lame, poiché sono piuttosto costose. In questo modo, è possibile individuare un'area perfettamente pulita spostando semplicemente il dispositivo avanti e indietro.

Un'altra cosa che puoi regolare è l'angolo di taglio. Ora sul lato qui, che non riuscirai a vedere, ci sono tre posizioni diverse. Utilizziamo soltanto la posizione centrale e la regoli sollevando questa leva.

E, e questo congegno può, puoi farlo salire e scendere. Noi lo teniamo sempre al centro. Quindi adesso lo lascerò così com'è.

La parte posteriore qui è la testa del criostato. Contiene effettivamente il campione di tessuto congelato durante la sua sezionatura. Si muove su e giù e avanza verso la lama.

Fondamentalmente si monta il tessuto su questo mandrino qui e poi posizioneremo il mandrino nella testa, lo serreremo e useremo le manopole posteriori per regolare l'angolo e ottenere un taglio più dritto. Ora procederò a montare il tessuto sul mandrino. È consigliabile mantenere i mandrini a temperatura ambiente perché inizialmente si aggiunge uno strato di OCT e non si desidera che questo si congeli immediatamente, in modo da ottenere uno strato uniforme e piatto.

E useremo questo dispositivo qui per, è chiamato estrattore di calore. In realtà, verrà utilizzato per appiattire l'OCT durante il congelamento. Quindi, quello che faccio prima è prendere il campione a temperatura ambiente e posizionarlo in questo supporto qui.

Prendi alcune delle mie bolle di OCT. Non importa qui perché verranno espulse. Aggiungine solo una piccola quantità, non ne serve molto.

Prendere l'estrattore di calore e posizionarlo proprio lì. Attendere alcuni secondi. A questo punto si può notare che l'OCT è bello e piatto.

Ora ho il mio tessuto e devo segnare effettivamente l'OCT. Ok, quindi segnerò un punto sull'OCT per indicarne la posizione. Ecco, ho appena segnato la parte superiore con un punto blu.

Ora prenderò il blocco di tessuto dallo stampo spingendo delicatamente sul retro. Spingerò quindi con delicatezza sul retro per farlo uscire e farlo cadere nella mia mano, ma, ancora una volta, non voglio che si scongeli. Per questo lo rimetto subito al suo posto.

Ora potete vedere il blocco di tessuto con il segno blu che ho fatto. So quindi che si tratta della parte superiore della testa dell'embrione. E voglio effettuare sezioni attraverso il volto perché si tratta di sezioni coronali.

Ora aggiungerò un'altra goccia di OCT, una goccia grande, e devo agire rapidamente perché tutto è freddo. Prenderò quindi il mio tessuto e lo posizionerò esattamente al centro, assicurandomi che sia ben appiattito contro il letto di OCT già formato. Ora lascerò congelare il tutto, operazione che richiederà circa un minuto o due.

Ora il congelamento è terminato. Prendo il tessuto montato sul mandrino, lo inserisco nella testa, cercando di posizionarlo nel modo più dritto possibile, quindi stringo. Può essere, è bello stretto.

Lo posizionerò appena davanti alla lama e poi lo avanzerò, operazione che potrebbe richiedere diversi secondi. Ora userò il bordo piatto della lama per effettuare un posizionamento preciso del tessuto. Quindi, semplicemente, osserverò il bordo e sposterò leggermente il tessuto verso l'alto e verso il basso per assicurarmi che i bordi siano perfettamente allineati.

Se non lo facessero, sapete, potrebbe assomigliare a qualcosa del genere. Sto ovviamente esagerando, ma potete vedere qui che non è dritto contro la lama. Quindi continuo semplicemente ad apportare aggiustamenti finché non sento che è il più dritto possibile.

Penso che vada abbastanza bene. Quindi osservo da ogni angolazione per assicurarmi che il tessuto verrà tagliato in modo dritto rispetto alla lama e uso il bordo della lama per indicarlo. Osservo quindi dall'alto e di lato, e il tessuto in effetti sembra abbastanza buono.

Non devo fare molti aggiustamenti, ma se fosse necessario, utilizzerei semplicemente le manopole situate nella parte posteriore della testa. Ruotandole a sinistra o a destra, si possono effettuare aggiustamenti fini in questo modo. Tuttavia, sembra già abbastanza buono.

Ora, sto effettivamente avanzando il tessuto. Non sta ancora tagliando perché non è a contatto con la lama. Il tessuto è incorporato in profondità all'interno dell'OCT.

Pertanto, potrebbero essere necessari diversi minuti per raggiungere il tessuto. Non si desidera procedere troppo velocemente perché si potrebbe inceppare e crepare l'OCT e il tessuto, ma non si vuole neppure procedere troppo lentamente perché ci vorrebbe un tempo infinito. C'è una funzione utile su questa macchina che permette di effettuare un taglio di assestamento con una sezione più spessa, consentendo di avanzare più rapidamente.

Ora in effetti sto tagliando l'OCT, quindi sto rallentando un po'. Non sono ancora arrivato al tessuto, ma è questo il momento in cui valuto come procederà il sezionamento. Molti fattori possono influenzare notevolmente la qualità del sezionamento del tessuto, facendolo riuscire molto bene o molto male.

Quello che riscontro più spesso con questo criostato è che il tessuto è effettivamente un po' troppo freddo. Ho ridotto la temperatura, ma sembra comunque che sia leggermente troppo freddo. Quello che accade è che la lama vibra durante il taglio del tessuto o dell'OCT.

Quindi si otterranno queste piccole linee, queste linee orizzontali attraverso l'OCT. Quello che faccio è prendere il mio pollice e semplicemente riscaldare il bordo, riscaldare l'OCT toccandolo delicatamente con il pollice, senza farlo per troppo tempo. Poi, quando effettuo il taglio, noto che i sezioni risultano molto migliori e il fenomeno del chattering scompare.

Questi sono quindi i tipi di aspetti che valuto prima di arrivare al tessuto. Ho notato che, mentre la lama attraversa il tessuto, si verifica un incaglio o, più precisamente, una crepa nell'OCT. Una delle prime cose che faccio è quindi cambiare la lama.

Non sono sicuro da quanto tempo questa lama sia qui e chi l'abbia usata prima di me, quindi procederò semplicemente a prendere una lama nuova. Sono ovviamente molto affilate, quindi bisogna fare attenzione. Ora regolerò la piastra anti-rotolamento; c'è una vite con molla di richiamo nella parte inferiore qui che va raggiunta da sotto e che può essere spostata in avanti o indietro.

Quindi ho avanzato e sezionato abbastanza da essere ormai all'interno del tessuto. Sfortunatamente, c'è una crepa nel blocco di OCT, un evento frequente che purtroppo non si riesce a controllare, ma esistono alcune misure correttive possibili. Se la crepa attraversasse il tessuto, sarebbe necessario scartare il campione o cercare di recuperare il più possibile.

In questo caso, la fessura sembra trovarsi al di sopra del tessuto. Quindi prenderò una lametta che è stata nel criostato ed è fredda.

E ora proverò a rimuovere semplicemente la parte crepata, che si trova nella parte superiore del blocco di OCT. Quindi, ancora una volta, userò il pollice per riscaldare la superficie del blocco di OCT. Poi procederò al taglio; come potete vedere qui, è crepato.

Quindi ho rimosso la parte con il tessuto e poi il resto dell'OCT che ho semplicemente eliminato, ovvero la parte crepata. Quello che farò ora è provare a tagliare la parte crepata utilizzando una lametta fredda. Devo procedere in modo molto preciso e devo usare entrambe le mani applicando una pressione uniforme sulla lametta.

E ora muoverò avanti e indietro la lama nell'OCT. Sto oscillando avanti e indietro, tagliando lentamente nell'OCT. Spero di rimuovere la parte crepata.

Ok, procederò a tagliare rimuovendo l'eccesso di OCT. Ok, sembra buono. A questo punto ritrarrò leggermente la testa perché ho creato dei bordi che potrebbero impigliarsi nella lama e, in tal caso, potrebbero effettivamente staccare l'OCT e il tessuto, rovinando il campione.

Quindi ho ritratto, quindi dovrò avanzare un po' di più per rientrare nel tessuto e spero di aver corretto la frattura. Ok, ora sto rientrando nel tessuto. Ok, sembra che l'abbia corretta.

Quindi non ci sono più crepe nell'OCT, il che renderà molto più facile il recupero delle sezioni. Ora procederò con l'avanzamento fino alla parte del tessuto di mio interesse. Al momento sto appena raggiungendo la superficie e vorrei penetrare nel cervello di questo embrione.

Sono abbastanza grandi da permettermi di vedere effettivamente le strutture che mi interessano. Non ho menzionato prima che uso questi pennelli per pulire la lama tra ogni sezione che intendo raccogliere. Questo più grande serve semplicemente per pulire la zona e rimuovere l’eccesso di OCT.

Utilizzo anche questi pennelli più fini per manipolare la sezione contro questa piastra fredda qui per posizionarla mentre la prelevo. Anche questi vengono mantenuti freddi, in modo che l'OCT non si sciolga e aderisca ai pennelli. Per prelevare il tessuto, riscalderò prima l'OCT e il tessuto con il pollice.

E prenderò uno di questi vetrini che ho già etichettato. Lo tengo capovolto e ognuno lo fa in modo diverso. Ma il modo in cui lo faccio io è tenere l'angolo in alto a destra quando il vetrino è rivolto verso il basso con la mano destra.

E poi uso il mio pollice sinistro come punto di appoggio in modo da poter scendere dritto contro il vetrino e catturare la sezione. L'OCT e il tessuto si scioglieranno effettivamente sul vetrino e si monteranno da soli. Quindi, per prima cosa riscaldo lentamente il tessuto con il pollice, effettuo il taglio, prendo il vetrino, tengo l'angolo destro con la mano destra, sposto la piastra, abbasso il tutto delicatamente e lascio che si sciolga.

Esaminerò il tessuto per assicurarmi che non ci siano pieghe o bolle e che abbia un aspetto adeguato. Continuerò a fare ciò fino a quando avrò sezionato l'intero cervello. Ora sto osservando i preparati al microscopio stereoscopico per verificare che abbiano un aspetto corretto, e infatti è così: si può vedere il proencefalo nella parte superiore del preparato e tutti appaiono molto ben conservati.

È possibile utilizzare queste sezioni criogeniche per analisi come l'ibridazione in situ. A volte eseguiamo una semplice istologia, con colorazioni ematossilina ed eosina. È inoltre possibile effettuare immunofluorescenza e, come noto, diverse analisi di questo tipo.

Per me in particolare, questi campioni sono stati fissati ed elaborati per ibridazione in situ. È quindi ciò che farò successivamente.