Flash Congelamento e criosezionamento E12.5 cervello di topo

Ciao, sono Spencer Curley dell'Università della California Irvine e del laboratorio di Ed Maki e sto per dimostrare come eseguire la criosezione. Per fare ciò, uso prima questi reagenti di uso comune. Il composto di inclusione o il mezzo di inclusione che utilizzo è chiamato OCT per la temperatura di taglio ottimale.

È una soluzione trasparente, è molto densa e viscosa, e trattiene bene il tessuto mentre puoi orientarlo e poi si congela, e alla fine è solubile in acqua in modo da poterne sbarazzare durante qualsiasi tipo di procedura di colorazione. Quindi ho incorporato il tessuto in uno stampo. Questi contenitori per biopsia criogenica sono disponibili in varie dimensioni.

Userò questo stampo più piccolo qui perché faccio tessuto embrionale dal topo. Congeliamo rapidamente i nostri tessuti e l'azoto liquido. Quindi, per prima cosa, riempirò questa fiaschetta protettiva con azoto liquido dal nostro serbatoio.

Prima del congelamento rapido del tessuto, è necessario quello che viene chiamato crioprotezione del tessuto, altrimenti il congelamento stesso distruggerà il tessuto. Quindi quello che fai è affondare il tessuto in una soluzione di saccarosio al 30% durante la notte. E se ci vuole più tempo, va bene, basta che il tessuto affondi.

E come potete vedere, visto embrionale giorno 12,5 teste di topo sono, sono affondate nel, nella soluzione di saccarosio, quindi sono pronti per essere congelati. Quindi ora verserò semplicemente il tessuto che si trova in una soluzione di saccarosio in un piatto più grande di me, in modo da poter manipolare il tessuto. Prenderò un po' di questo OCT e lo verserò in questo piatto da 35 millimetri che in realtà è appoggiato sul coperchio in modo da poterlo inclinare.

Quindi l'OCT si accumula lungo il bordo per la profondità. Quindi sto usando un paio di pinze smussate più vecchie semplicemente perché non ne hai bisogno per essere affilate e non vuoi rovinare un altro paio di pinze. Allora io, le prendo e sollevo una di queste teste molto delicatamente, e la metto in questo primo bagno di OCT.

Voglio solo rivestire l'embrione di OCT. Ciò consente un congelamento migliore e più uniforme del tessuto. Non vuoi residui di saccarosio intorno al tessuto o bolle d'aria.

Evita sicuramente le bolle d'aria. Quindi sto semplicemente mescolando delicatamente l'OCT intorno e sotto la testa, muovendo la testa attraverso l'OCT e lasciandola riposare lì per pochi secondi mentre riempio il mio stampo criogenico. Quindi ora riempirò lo stampo criogenico con l'OCT, di nuovo, evitando le bolle.

E lo riempirò fino all'inizio dello stampo. E come noterete, ho etichettato lo stampo. Quindi lo farò, sarò in grado di vedere il mio orientamento dopo che sarà congelato.

Quando l'OCT si congela, diventa bianco e non puoi più vedere il tuo tessuto. Quindi vuoi assolutamente etichettare con un pennarello indelebile. Il, lo stampo criogenico.

In realtà ho avuto una bolla nell'OCT, quindi userò il mio forcipe per spingerla oltre il bordo. Non vuoi che questo interferisca con il tuo, con il congelamento dei tuoi tessuti. Quindi ora trasferirò la testa da questo piatto nell'OCT che è nel mio stampo.

Lo solleverò dal piatto e lo metterò nello stampo molto delicatamente. Poi andrò al microscopio dove orienterò il tessuto. Ho il tessuto nel mio stampo criogenico qui e guarderò attraverso il cannocchiale in modo da poterlo orientare.

Farò sezioni coronali attraverso questa testa di topo. Quindi ho bisogno di orientarlo in modo da poterlo posizionare nel criostato per le sezioni coronali. Quindi, ancora una volta, sto usando queste vecchie pinze smussate e, come puoi vedere, ci sono alcune bolle qui e farò del mio meglio per tirarle fuori.

Ma queste bolle più piccole non sono, non sono male. Non ho notato nulla con queste bolle più piccole. Semplicemente non vuoi bolle grandi.

Quindi li eliminerò nel miglior modo possibile e pulirò spesso il forcipe perché in questo modo puoi evitare meglio le bolle. E ora, se riuscite a vedere la mia etichettatura, ho una t qui in alto e una F alla mia sinistra. Questo mi indica solo che la testa, la parte superiore della testa sarà in alto e la parte anteriore o il viso sarà alla mia sinistra.

In questo modo so quale superficie sezionare per le sezioni coronali e sto solo spingendo il tessuto. E ancora, a volte questo introduce bolle e vuoi solo spingerle fuori in modo che non si congelino insieme al tessuto. Quindi è brutto avere le bolle, principalmente perché quando stai congelando, le bolle di tessuto possono causare un congelamento incoerente.

Lo scopo del congelamento rapido è quello di congelare tutto in una volta. Inoltre, quando si taglia il tessuto e il criostato, se la lama passa attraverso una bolla piuttosto che l'OCT o il tessuto, può causare un intoppo o uno strappo e, e distruggere o, sai, rompere il tessuto. Quindi si vuole assolutamente evitare come queste bolle a tutti i costi.

Soprattutto quelli più grandi. Quindi lo sto ancora orientando qui. Questo tessuto è stato fissato per 24 ore, quindi è abbastanza robusto per le mie manipolazioni.

Altri tessuti potrebbero essere un po' più morbidi, quindi vuoi solo essere molto delicato. Quindi, una volta che l'ho posizionato sotto il cannocchiale con la faccia a sinistra e la parte superiore della testa verso l'alto, dovrò assicurarmi che sia corretto anche su altri piani di orientamento. Quindi solleverò e guarderò attraverso tutte le facce del cubo per assicurarmi che sia giusto.

E vedo che è leggermente inclinato verso il basso, quindi devo solo sollevare con il forcipe. Ok? E questo richiede sicuramente molta pratica. Ok, sembra buono.

Ora vado qui e lo congelerò in azoto liquido. Ok, ora che il tessuto è orientato correttamente nello stampo criogenico, verserò il mio azoto liquido in questo piatto qui. Questa è solo una normale piastra di Petri in plastica per la coltura dei tessuti, fino in cima.

Evapora abbastanza rapidamente. Prenderò la mia pinza e abbasserò lo stampo criogenico. E come potete vedere, ho effettivamente piegato il labbro inferiore.

Ciò consente sicuramente una maneggevolezza migliore, migliore. Lo congelerò. E quando il tessuto e l'OCT si congelano, diventano di un bianco solido.

E una volta completato, sarà tutto bianco. E poi devo mettere rapidamente il fazzoletto congelato nel congelatore a meno 80 per la conservazione. Vuoi tenerlo in modo tale che il tessuto non venga sommerso.

Quindi bisogna stare molto attenti a tenerlo sulla superficie superiore dell'azoto liquido. Ok, ora è congelato. Tienilo lì per qualche secondo in più prima di andare a meno 80.

Ok, ora lo porterò a meno 80. Quindi ho preso il mio tessuto da meno 80 e l'ho messo in questo criostato qui. La camera è in realtà scesa a 24 gradi Celsius.

In questo momento devi lasciare che il tessuto si equilibri per circa mezz'ora o un'ora prima di poter iniziare la sezione. Altrimenti, è troppo fragile. Quindi, anche se tutte le statistiche di Cryos sono diverse, qui sottolineerò solo alcune delle cose fondamentali su questa macchina.

Quindi usiamo il Leica CM 30 50 s. È una buona macchina perché ha un'unità di raffreddamento separata per il campione stesso, il che è un bel vantaggio aggiuntivo. È possibile impostare la temperatura del campione e tessuti diversi richiedono temperature diverse per il taglio.

Quindi, quando carichi per la prima volta il fazzoletto, devi apportare diverse regolazioni. E questi sono simili su tutte le statistiche di Cryos. Si tratta di elettronica, alcuni dei quali sono azionati a mano.

Ad esempio, dovrai ritrarre il braccio del criostato o farlo avanzare per posizionarlo più lontano o più vicino alla lama. Puoi farlo velocemente o lentamente. Puoi impostare lo spessore del tuo taglio con, con questo più o meno qui.

E potrai selezionare tra lo spessore del taglio o della sezione, che è indicato nel pulsante centrale qui. È possibile impostare la temperatura della camera o del campione stesso accanto a questo display digitale semplicemente premendo questo pulsante e utilizzando queste frecce su o giù per regolare la temperatura. Quindi, per noi, quando eseguiamo la criosezione, usiamo questi Super frost di marca fish fisher e vetrini da microscopio.

Sono rivestiti con dell'adesivo in modo che il tessuto durante la lavorazione non si stacchi. A volte durante la sezione noterai che il tessuto sembra un po' morbido e alcune indicazioni di ciò saranno se colpisce la lama e si ammucchia. E quello che puoi usare per risolvere questo problema è questo congelamento super amichevole del marchio Fisher.

Esso, è, congela il tessuto e tu lo punti semplicemente sul tuo tessuto e premi il grilletto e ricongelerà rapidamente il tessuto se è troppo morbido. Prima di montare il fazzoletto su un mandrino per il sezionamento, vorrei accompagnarvi in un rapido tour di alcune delle cose presenti nella macchina. Quindi è qui che si carica effettivamente la lama, che è fissata con questa piastra metallica.

Tirando verso l'alto questo braccio, è possibile rimuovere e sostituire la lama secondo necessità. Assicurati che sia bello e sicuro. Non vuoi fissare eccessivamente la lama, altrimenti si deforma davvero.

E noterai nel tuo sezionamento che lo spessore del tessuto non è, non è coerente. Quindi volete, non volete spingere questo braccio fino in fondo. Vuoi semplicemente portarlo dove si trova, anche con la, con la lama stessa.

Questa è un'altra cosa che potrebbe essere necessario regolare durante il sezionamento. Si chiama piastra antirollio. È un pezzo di vetro che si inserisce in questo supporto qui e puoi regolarlo usando questa vite caricata a molla qui.

E fondamentalmente lo si sposta avanti o indietro. E questo manterrà il tuo tessuto o le tue sezioni piatte in modo da poterle montare su una diapositiva. Un'altra cosa che potresti voler regolare durante il sezionamento è il punto sulla lama che sta eseguendo il taglio vero e proprio.

Quindi, come si regola è che basta sollevare questa leva e si può far scorrere l'intero aggeggio a sinistra o a destra. E lo usi davvero solo se noti che il tuo tessuto si impiglia in una certa parte della lama o vuoi risparmiare le lame perché sono piuttosto costose. Quindi puoi trovare una bella area pulita semplicemente spostandola avanti e indietro.

Un'altra cosa che puoi regolare è l'angolo di taglio. Ora sul lato qui, che non sarai in grado di vedere, ci sono tre diverse posizioni. Usiamo semplicemente la posizione centrale e tu la regoli sollevando quest'altra leva.

E, e questo può, puoi far andare su e giù questo aggeggio. Lo teniamo sempre nel mezzo. Quindi ho intenzione di continuare così.

Quindi qui dietro c'è la testa del criostato. In realtà conterrà il campione di tessuto congelato durante la sezionamento. Oscilla su e giù e avanza verso la lama.

E fondamentalmente monti il tessuto su questo mandrino qui e noi posizioneremo il mandrino nel, nella testa, lo stringeremo e poi useremo queste manopole nella parte posteriore per regolare l'angolo per renderlo un taglio più dritto. Quindi ora monterò il fazzoletto sul, il mandrino. Vuoi mantenere i mandrini a temperatura ambiente perché prima aggiungerai uno strato di OCT e non vuoi che si congeli immediatamente perché vuoi che sia un bel strato piatto.

E useremo questo aggeggio qui per un, si chiama estrattore di calore. In realtà, verrà utilizzato per appiattire l'OCT mentre si congela. Quindi quello che faccio prima è fare il controllo della temperatura ambiente e metterlo in questo supporto qui.

Prendi alcune delle mie bolle OCT. Non importa qui perché saranno spremuti fuori. Basta aggiungere un, un po ', non ti serve molto.

Prendi l'estrattore di calore e siediti proprio lì. Attendi qualche secondo. E poi si può vedere che l'OCT è bello e piatto.

Quindi ora ho il mio fazzoletto e ho bisogno di segnare l'OCT vero e proprio. Ok, quindi segnerò un punto sulla, l'OCT a, per indicare la sua posizione. Quindi, ho appena contrassegnato la parte superiore con un punto blu.

Quindi ora tolgo il blocco di tessuto dallo stampo e lo faccio semplicemente spingendo contro la parte posteriore. Quindi spingerò delicatamente sulla schiena e lo spingerò nella mia mano, ma ancora una volta, non voglio che si scongeli. Così l'ho rimesso dentro.

Ora potete vedere il blocco di tessuto con il segno blu che ho messo su di esso. Quindi so che è la parte superiore della testa dell'embrione. E voglio sezionare il viso perché queste sono sezioni coronali.

Quindi ora quello che farò è aggiungere un'altra goccia di OCTA large droplet, e devo agire rapidamente ora perché tutto è freddo. E prenderò il mio fazzoletto e lo metterò proprio al centro, assicurandomi che sia piatto contro il letto di OCT già fatto. Ora lascerò che si congeli e ci vorranno circa un minuto o due.

Quindi ora ha finito di congelare. E ho intenzione di prendere il fazzoletto che è montato sul, sul mandrino, metterlo nella testa, farlo dritto il più possibile, e poi stringerlo. Può, è bello e stretto.

Lo posizionerò proprio davanti alla lama e poi lo farò avanzare, il che potrebbe richiedere diversi secondi. Ok, ora userò il bordo piatto della lama per fare davvero il posizionamento preciso del tessuto. Quindi guardo semplicemente il bordo e faccio oscillare il tessuto su e giù solo per assicurarmi che i bordi siano allineati.

Se non lo facessero, sai, potrebbe assomigliare a qualcosa del genere. Sto esagerando ovviamente, ma potete vedere qui che non è dritto contro la lama. Quindi continuo a fare aggiustamenti finché non sento che è il più dritto possibile.

Penso che sia abbastanza buono. Quindi guardo da ogni angolazione per assicurarmi che il tessuto stia per tagliare dritto contro la lama e uso il bordo della lama per indicarlo. Quindi sto guardando in alto e sto guardando di lato e il tessuto sembra davvero abbastanza buono.

Non devo fare molte regolazioni, ma se lo facessi, userei solo le manopole che si trovano nella parte posteriore della testa. E ruotandoli a sinistra o a destra, puoi vedere che puoi fare regolazioni fini in questo modo. Ma sembra abbastanza buono.

Ora, sto effettivamente facendo avanzare il tessuto. È, non sta ancora tagliando perché non è contro la lama. Il tessuto è incorporato all'interno in profondità nell'OCT.

Quindi potrebbero essere necessari diversi minuti per arrivare al tessuto. Non vuoi andare troppo veloce perché potrebbe catturare e rompere l'OCT e il tuo tessuto, ma non vuoi nemmeno andare troppo lentamente perché potrebbe volerci un'eternità. C'è una bella funzione su questa macchina in cui puoi fare un taglio in una sezione più spessa, che ti permetterà di andare più veloce.

Quindi ora sto tagliando l'OCT ora, quindi sto rallentando un po'. Quindi non sono ancora arrivato al tessuto, ma questo è il momento in cui valuto come andrà il sezionamento. Molte variabili possono, possono far sì che il tuo sezionamento dei tessuti vada molto bene o, o davvero male.

Quello che trovo che succede più spesso con questo criostato è che il tessuto è in realtà un po' troppo freddo. Io, ho abbassato la temperatura, ma ancora sembra che faccia un po' troppo freddo. E quello che succede è che la lama chiacchiererà attraverso, attraverso il tessuto o, e attraverso l'OCT.

Quindi otterrete queste piccole linee, queste linee orizzontali attraverso l'OCT. Quello che faccio è prendere il pollice e semplicemente riscaldo il bordo, riscaldare l'OCT semplicemente toccandolo delicatamente, facendo scorrere il pollice, non per molto tempo. E poi, quando l'ho sezionato, ho notato che escono molto meglio e le vibrazioni si sono fermate.

Quindi questi sono i tipi di cose che valuterò prima di arrivare al tessuto. Quindi ho notato che quando la lama attraversa il tessuto, c'è un intoppo o, o una crepa, in realtà nell'OCT. Quindi una delle cose che faccio prima è cambiare la lama.

Non sono sicuro da quanto tempo questa lama sia qui e chi l'abbia usata prima di me, quindi andrò avanti e tirerò fuori una nuova lama. Questi sono molto affilati ovviamente, quindi devi stare attento. Quindi regolerò la piastra antirollio e qui c'è una vite caricata a molla sul fondo che devi solo raggiungere sotto e puoi spostarla dentro o fuori.

Quindi sono avanzato e sezionato abbastanza da essere ora nel tessuto. E sfortunatamente c'è una crepa nel blocco dell'OCT, che accade spesso e sfortunatamente non si può davvero controllare, ma ci sono cose che si possono fare per risolverlo. Se la crepa ha attraversato il tessuto, allora devi scartare il campione o cercare di salvare quello che puoi.

In questo caso, la crepa sembra essere sopra il tessuto. Quindi quello che farò è prendere una lama di rasoio che è stata inserita nel criostato. È, è freddo.

E cercherò di tagliare la parte incrinata, che si trova nella parte superiore del blocco OCT. Quindi, di nuovo, userò il pollice per riscaldare la faccia del blocco OCT. E poi vado a sezionarlo, e se riuscite a vederlo qui, è rotto.

Quindi lì ho tolto il pezzo con il fazzoletto e poi il resto dell'OCT che ho appena buttato via, era la parte incrinata. Quindi quello che farò è provare a tagliare quella parte incrinata usando una lama di rasoio raffreddata. Devo andare molto dritto e devo usare entrambe le mani e applicare una pressione uniforme sulla lama.

E farò oscillare la lama avanti e indietro nell'OCT. Quindi sto dondolando avanti e indietro, tagliando lentamente l'OCT. Spero di rimuovere la parte incrinata.

Ok, ho intenzione di ridurre la rimozione di questo OCT in eccesso. Ok, sembra buono. Quindi ritrarrò leggermente la testa perché ho creato bordi che possono impigliarsi nella lama e, se ciò accade, potrebbe effettivamente rompere l'OCT e il tessuto e rovinare il mio campione.

Quindi mi sono ritirato, quindi dovrò avanzare un po' di più per tornare nel tessuto e spero di aver corretto la crepa. Ok, ora sto tornando nel fazzoletto. Ok, sembra che io, l'ho corretto.

Quindi non ci sono più crepe nell'OCT che renderanno molto più facile catturare le sezioni. Quindi ora passerò alla parte del tessuto che mi interessa. In questo momento, sto colpendo la superficie e vorrei entrare nel cervello di questo embrione.

Questi sono abbastanza grandi da permettermi di vedere le strutture che mi interessano. Ho dimenticato di menzionare che uso questi pennelli per pulire la lama tra ogni sezione che sto per catturare. Questo grande serve solo per pulire l'area e rimuovere l'OCT in eccesso.

Uso anche questi pennelli più fini per manipolare la sezione contro questa piastra fredda qui per posizionarla quando la sto catturando sulla sezione. Anche in questo caso, questi vengono mantenuti freddi, in modo che l'OCT non si sciolga e non si attacchi ai pennelli. Quindi, per catturare il tessuto, riscalderò prima l'OCT e il tessuto con il pollice.

E prenderò una di queste diapositive che ho già etichettato. Lo tengo a testa in giù e ognuno lo fa in modo diverso. Ma il modo in cui lo faccio è che mi piace tenere questo angolo in alto a destra quando lo scivolo è rivolto verso il basso con la mano destra.

E poi uso il pollice sinistro come punto di articolazione in modo da poter scendere dritto contro la piastra e catturare la sezione. L'OCT e il tessuto si scioglieranno effettivamente contro il vetrino e si monteranno da soli. Quindi per prima cosa riscaldo il fazzoletto con il pollice in sezioni lente, afferro il carrello, tengo l'angolo destro con la mano destra, sposto la piastra, la abbasso verso il basso, la lascio sciogliere.

Guardo il fazzoletto per assicurarmi che non ci siano pieghe o bolle e che abbia un bell'aspetto. E continuerò a farlo fino a quando non avrò sezionato l'intero cervello. Ora sto guardando le sezioni attraverso il cannocchiale di dissezione per assicurarmi che abbiano un bell'aspetto e lo facciano, si può vedere il proencefalo nella parte superiore della sezione e sembrano tutti molto belli.

È possibile utilizzare queste sezioni criogeniche per cose come l'ibridazione in situ. A volte eseguiamo l'istologia di base, le colorazioni h ed e. Si può anche fare l'immunofluorescenza e, sai, una serie di test del genere.

Per me in particolare, queste sezioni sono state fissate e lavorate per l'ibridazione in situ. Quindi questo è quello che farò dopo.