Elaborazione di un cervello di topo per l'analisi a valle

Prendi un cervello di topo appena raccolto e congelalo in isopentano pre-raffreddato per una rapida conservazione dei tessuti.

Quindi, trasferisci il cervello, con la corteccia rivolta verso l'alto, in una matrice cerebrale congelata per mantenere un ambiente freddo durante l'affettatura.

Lasciare che il cervello si equilibri alla temperatura della matrice. Allinearlo nella matrice lungo i seni sagittali e trasversali per garantire sezioni simmetriche.

Inserire le lame raffreddate nel cervello, assicurandosi che il corretto allineamento sia corretto.

Quindi, premili in modo uniforme per ottenere sezioni cerebrali uniformi.

Togliete le lame con le sezioni e posizionatele, con il rovescio verso l'alto, su una lastra di vetro congelata.

Organizzare le sezioni dall'orientamento rostrale a quello caudale nell'ordine anatomico corretto. Ora, separali.

Utilizzando un riferimento cerebrale adatto, individuare ed eliminare la regione di interesse dalla sezione.

Trasferire il tessuto asportato in una fiala pre-raffreddata per l'analisi a valle.

Dopo aver rimosso il cervello da topi adulti CD-1 di tipo selvaggio soppressi, congelare il tessuto per 60 secondi in azoto liquido o isopentano preraffreddato con ghiaccio secco e conservarlo a -80 gradi Celsius.

24 ore prima di sezionare il tessuto, posizionare una matrice cerebrale pulita su una pila di confezioni di congelatore scongelate e inserire i lati della matrice tra due confezioni di congelatore, assicurandosi di lasciare circa mezzo centimetro tra la parte inferiore delle fessure del rasoio e la parte superiore delle confezioni.

Preparare una lastra di vetro congelata per la dissezione riempiendo una scatola isolante con ghiaccio fino a circa 5 centimetri dall'alto. Quindi, metti sopra uno strato di ghiaccio secco di 2,5 centimetri e coprilo con un foglio di plastica nera. Metti un piatto di vetro sopra la plastica e asciuga il ghiaccio attorno ai bordi del piatto.

Rimuovere la matrice cerebrale congelata dal congelatore e inserire la corteccia cerebrale con il lato rivolto verso l'alto nella matrice. Lasciare che il fazzoletto si equilibri alla temperatura nella scatola per 10 minuti, mantenendo il coperchio aperto durante questo tempo. Usa una pinza fredda per regolare la posizione del cervello nella matrice, in modo che il seno sagittale e il seno trasverso si allineino con i solchi perpendicolari del blocco.

Una volta che il cervello è in posizione, posiziona una lama di rasoio raffreddata vicino al suo centro e premila per circa 1 millimetro nel tessuto. Quindi, posiziona una lama raffreddata a ciascuna estremità del cervello e premi fino in fondo nella matrice. Quindi, inizia ad aggiungere lame fredde all'estremità rostrale, posizionandole nelle fessure una alla volta e premendole delicatamente di 1 millimetro nel tessuto. Continuare ad aggiungere lame a intervalli di 1 millimetro, lavorando verso l'estremità caudale.

Quando tutte le lame sono in posizione, premere sulla parte superiore con le dita, il palmo o un oggetto contundente e farle oscillare lentamente da un lato all'altro per spostarle attraverso il tessuto. Una volta che le lame hanno raggiunto il fondo delle fessure, afferra ciascun lato del gruppo di lame e liberale dalla matrice oscillando avanti e indietro.

Dopo aver liberato il gruppo di lame, posizionarle con il lato rostrale rivolto verso l'alto sulla lastra di vetro e mettere del ghiaccio secco accanto o sopra la pila per congelare ulteriormente i campioni e facilitarne la separazione. Quindi, posiziona la pila con gli spigoli vivi rivolti verso il basso e separa le lame spostando la pila tra il pollice e le dita.

Allineare la sezione sulle lastre di vetro da rostrale a caudale, e separare il tessuto dalle lame flettendole tra le dita o separandole con una seconda lama raffreddata. A volte, il tessuto può attaccarsi a entrambi i lati di una lama e bisogna fare attenzione a mantenere l'orientamento rostrale-caudale.

Prima di iniziare la dissezione, apri l'Allen Mouse Brain Atlas o un altro riferimento e trova i punti di riferimento necessari per identificare le regioni di interesse. Usa pinze o lame fredde per capovolgere la sezione e assicurati che la regione di interesse sia coerente in tutta la sezione.

Taglia la sezione con un bisturi o un punzone pulito, spingendo il metallo delicatamente ma con fermezza nel tessuto, facendolo oscillare avanti e indietro per eseguire il taglio. Dopo aver raccolto la regione di interesse, metterla in tubi prerefrigerati etichettati da 1,5 millilitri e conservarli a -80 gradi Celsius.