Name: Visualizzazione e quantificazione delle interazioni intracellulari di Neisseria meningitidis E umano α-actinina da Imaging confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Scopri come visualizzare e quantificare la colocalizzazione di Neisseria meningitidis con α-actinina nelle cellule endoteliali cerebrali umane mediante microscopia confocale. Questo metodo permette di studiare le interazioni batterio-ospite.

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Gli studi sono stati finanziati dal Wellcome Trust e meningite nel Regno Unito. HBMEC linea cellulare è stata fornita dal dottor KS Kim. L&#39;imaging confocale e microscopia elettronica sono stati eseguiti nel Fondo per Bioimmagini Wolfson, Università di Bristol. Vorremmo anche ringraziare l&#39;onorevole Alan Leard, Dr. Mark Jepson (Università di Bristol), e il signor Alan Tilley (PerkinElmer) per il loro aiuto e consigli.

1. Immunofluorescenza protocollo Semina, infezione e immuno-colorazione Le seguenti procedure richiedono idoneo livello di cultura della sicurezza dei tessuti e le strutture di laboratorio microbiologico. GIORNO 1 A. Preparazione delle cellule bersaglio per l'infezione <ol><li> HBMECs seme al 50% confluenza (~ 1.5x10 4 celle / cm 2) sul vetro coprioggetto (16 mm di diametro) inserito in un 12-pozzetti (3,8 cm 2 area di crescita / pozzetto). Terreno di crescita: RPMI 1640 integrato con il 15% di siero (56 ° C, 30 min) FBS, 2 mM glutamina, 1 mM sodio piruvato, 100 U / mL di penicillina / streptomicina, 1% (v / v) MEM aminoacidi non essenziali acidi soluzione e l'1% MEM soluzione di vitamine. </li><li> Cultura per tutta la notte (O / N) a 37 ° C, in un 5% di CO 2 incubatore. </li></ol> B. coltura batterica <ol><li> Crescere il ceppo di interesse di O / N (16-18 h) sul richiesto Infusion ad esempio Cuore medio Cervello (BHI) piastre di agar integrato con il 10% sangue di cavallo riscaldata a 37 ° C in 5% CO 2 nell'atmosfera 4. </li></ol> 2 ° GIORNO Preparazione A. Di batterica (N. meningitidis) Sospensione <ol><li> Utilizzando un loop 10 microlitri cultura, fare una sospensione della cultura durante la notte batterica in 2 ml generiche su baja california (PBS con calcio e magnesio). </li><li> Consentire grossi aggregati batterici per risolvere lasciando la sospensione per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). </li><li> Senza disturbare il pellet, trasferire l'1 ml della sospensione (stock inoculo) in una provetta sterile. </li><li> Per stimare i numeri batterica dell'inoculo magazzino, aggiungere aliquote (20-50 mL) di provette contenenti volumi di 1 ml di 1% SDS a 0,1 M NaOH e mescolare delicatamente per solubilizzare. </li><li> Misurare il contenuto di acido nucleico della soluzione determinando l'assorbanza a 260 nm (A260). Nelle nostre mani, A260 di 1 corrisponde a 5x10 8 unità formanti colonie / ml (ufc / ml). Questo può essere verificato preparando una serie di diluizioni del inoculo stock in generiche su baja california, placcatura su piastre di agar e il conteggio colonie dopo O / N incubazione. </li><li> Diluire una parte dell'inoculo magazzino nel medio infezione [(M199 integrata con il 2% decomplemented (56 ° C, 30 min) nel siero umano normale (SSN)] per ottenere la densità richiesta per l'infezione batterica delle cellule bersaglio. <ol><li> Nel nostro laboratorio, un rapporto di infezione di 200-300 batteri per cella di destinazione viene utilizzato di routine. </li></ol></li></ol> B. infezione delle cellule Cultura <ol><li> Lavare i coprioggetti in coltura con cellule bersaglio tre volte con mezzo di Hank per rimuovere ogni traccia di antibiotici. </li><li> Infettare le cellule preparati al momento con sospensioni batteriche (descritto sopra) per 3 ore a 8 ore a 37 ° C, nel 5% di CO 2. </li><li> Al termine del periodo di infezione, le cellule lavare tre volte con PBS e fissare in 500 ml di 2% paraformaldeide (PFA) per 30-45 minuti a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. <ol><li> Fissazione paraformaldeide alla concentrazione e il tempo sopra indicato è stato ritenuto idoneo per la conservazione della morfologia batterica e cellulare. </li></ol></li><li> Dopo il lavaggio off paraformaldeide, permeabilise la paraformaldeide-cellule fissate incubando a 0,1% Triton X-100 diluito in PBS per 10 min. </li><li> Lavare i campioni 3 volte con PBS. </li><li> Procedere alla colorazione immuno-o, in alternativa, lasciare i campioni in 500 ml di 1% BSA / PBST O / N a 4 ° C. </li></ol> 3 ° GIORNO Immuno-colorazione Colorazione dei batteri intracellulari e α-actinina possono essere eseguite in sequenza o simultaneamente con l'uso di appropriati anticorpi primari e secondari come segue: tutte le procedure possono essere eseguite in 12-pozzetti. <ol><li> Blocca i coprioggetti contenente le cellule permeabilised con 500 ml di 3% BSA / PBST (PBS contenente 0,05% Triton X-100) per 30-60 min a RT </li><li> Dopo il lavaggio con PBS, il trasferimento di ogni coprioggetto di un nuovo pozzo secco in 12-pozzetti. </li><li> Aggiungere gli anticorpi primari contro i batteri e α-actinina; ottanta a 100 l di anticorpi per coprioggetto è sufficiente aggiunto attentamente per coprire la superficie del vetrino. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. <ol><li> Abbiamo usato antisiero policlonale di coniglio contro la Neisseria meningitidis (laboratorio-raise) e anticorpi murini monoclonali (mAb) contro α-actinina (Abcam) contemporaneamente. In alcuni esperimenti, al posto di anti α-actinina, anticorpi monoclonali contro l'actina e vimentina sono stati utilizzati (Sigma). </li></ol></li><li> Al termine della incubazione, aggiungere 200 ml di PBS al pozzo, sollevare il coprioggetti e posto in un nuovo pozzo contenente 500 microlitri di PBS. </li><li> Dopo 5 minuti, togliere PBS pipettando e quindi aggiungere PBS fresco. Ripetere due volte. Trasferimento ad un coprioggettinuovo pozzo asciutto. </li><li> Aggiungere gli anticorpi adeguati secondari coniugati con fluorocromi diversi diluito in 1% BSA / PBST; incubare a temperatura ambiente per 1 ora al buio. <ol><li> Per il rilevamento di batteri, abbiamo usato anti-coniglio coniugato con TRITC Ig e per α-actinina e altri rilevazione delle proteine ​​del citoscheletro, abbiamo usato Ig anti-topo coniugato con FITC o-(Sigma) o Alexa Fluor 488 - (Invitrogen). </li></ol></li><li> Al termine della incubazione, lavare come nei passaggi 4 e 5. </li><li> Contatore macchia con 0,6 mg / ml DAPI in PBS (DNA macchia) per 5 min a RT al buio. </li><li> Risciacquare con PBS. </li><li> Monte coprioggetti (cellule rivolto verso il basso) su vetrini con una goccia di mezzo di montaggio (e, g. Mowiol o Vectashield) </li><li> Conservare al buio a 4 ° C. </li><li> I campioni sono pronti per l'osservazione al microscopio. </li></ol> 2. Microscopia confocale a scansione laser (CLSM) Di osservare e catturare le immagini di batteri intracellulari e degli elementi del citoscheletro, abbiamo utilizzato campioni immunolabelled e immagini catturate con una SP5-AOBS Leica microscopio confocale a scansione laser collegato a un Leica DM i6000 microscopio invertito epifluorescenza. Tutte le immagini sono stati raccolti utilizzando un NA 63x 1,4 obiettivo ad immersione olio e di processo con il software Leica. CLSM procedura: <ol><li> Per iniziare la procedura di CLSM, aggiungere una goccia di olio di immersione per l'obiettivo e mettere il vetrino, coprioggetto rivolto verso il basso, sul palco microscopio. </li><li> Impostare il microscopio ad un modo visuale e trovare l'area di interesse utilizzando i pezzi occhio del microscopio. </li><li> Utilizzo del software Leica, selezionare la modalità di acquisizione xyz. </li><li> Selezionare il formato 512 x 512 (dimensioni del fotogramma). Per gli studi colocalisation, la risoluzione più alta, la più accurata dell'immagine, tenendo presente il limite di risoluzione del microscopio. Quindi selezionare la modalità bidirezionale X, che aumenterà la velocità di scansione e contribuire a ridurre fotometabolismo. </li><li> Configurare le impostazioni di scansione sequenziale. Fare clic sulla funzione "seq" e scegliere una delle modalità di scansione. Usiamo "tra le righe" modalità. </li><li> Fasci laser selezionare in base al fluorocromi coniugati agli anticorpi secondari: 405 nm per DAPI (blu), 488 nm per Alexa Fluor 488 (verde) e 561 nm per TRITC (rosso). Attivare tubo fotomoltiplicatore (PMT) 1, 2 e 3, rispettivamente. Regolare le impostazioni PMT di rilevare la lunghezza d'onda corretta emissione. </li><li> Impostare superiore ("inizio") e inferiore ("fine") di z-stack o serie. Successivamente, regolare la richiesta "z-step size". <ol><li> Neisseria meningitidis è un diplococco (Figura 1G) e dal momento che ogni cocchi ha un diametro approssimativo di 0,5 micron, lo z-step dimensioni di 0,20 micron è stato scelto per aumentare le probabilità di scansione di ogni coccus almeno due volte. E 'anche all'interno della dimensione del passo per la risoluzione ottimale di 0,1-0,2 micron. </li></ol></li><li> Impostare i parametri di scansione finale, selezionando la linea media del 3 per migliorare il rapporto segnale-rumore. </li><li> Facendo clic su "start" delle immagini a doppia o tripla macchiati sono ottenuti mediante la scansione sequenziale a diverse lunghezze d'onda per eliminare cross-talk tra cromofori diversi. </li><li> Per avere un'indicazione della colocalisation di due fluorocromi, selezionare la funzione "overlay" per unire i canali selezionati in una singola immagine, ad esempio, quando entrambi Alexa 488 (verde) e TRITC (rosso) fluorocromi colocalise, colore giallo apparirà l'immagine sovrapposta . </li><li> Compila z-stack o serie con il "massimo proiezione" la funzione per la costruzione di un'immagine 2D richiesto per la visualizzazione colocalisation possibile. Un'analisi più dettagliata dei colocalisation può essere ottenuta con l'analisi di ogni sezione ottica. </li><li> Dopo aver acquisito lo z-stack o una serie, i vostri dati per ottenere un'immagine ortogonale per la visualizzazione della localizzazione intracellulare di vari elementi (figura 1E). </li></ol> 3. Quantificazione del Colocalisation L'analisi statistica delle immagini microscopio confocale a scansione vengono eseguite con il software Volocity (improvvisazione, PerkinElmer). Questo software fornisce uno strumento progettato specificamente per l'analisi colocalisation come descritto da Manders et al. (1993) 5. Colocalisation nel contesto del digital imaging di fluorescenza può essere descritto come il rilevamento di un segnale alla stessa voxel (volume pixel) in posizione di ogni canale. I due canali sono costituiti da immagini di due fluorocromi diversi presi dalla zona stesso campione (guida Volocity). Le analisi statistiche sono eseguite con il software Volocity (improvvisazione, PerkinElmer), utilizzando l'analisi quantitativa Colocalisation descritto di seguito. Colocalisation analisi quantitativa <ol><li> Creare una libreria con le immagini CLSM usando il software Volocity. </li><li> Seleziona "focus esteso" dall'immagine nella barra in alto. Questo strumento verrà compilato z-stack in un'immagine 2D da analizzare. </li><li> Selezionare lo strumento "colocalizzazione". I due canali da analizzare deve avere la stessa profondità di colore. </li><li> Selezionare l'area che sta per essere quantificato. Impostare la soglia di rimuovere qualsiasi sfondo. </li><li> Creare l'uscita colocalisation selezionando "Genera colocalizzazione". Statistiche Colocalisation sono generati per le regioni di interesse selezionati in precedenza. </li><li> Seleziona Manders 'coefficienti R (coefficiente di sovrapposizione) e My (coefficiente colocalisation). <ol><li> Manders 'coefficienti non sono sensibili all'intensità della colorazione in quanto sono normalizzati contro l'intensità dei pixel totali; quindi possono essere impiegati quando la colorazione di un antigene è più forte rispetto agli altri. </li><li> Sovrapposizione R coefficiente secondo Manders 5,6 rappresenta il vero grado di colocalisation, cioè il numero di pixel che colocalise rispetto al numero totale di pixel. </li><li> D'altra parte, il coefficiente di colocalisation, My, descrive il contributo fluorescenza della frazione più abbondante (in questo caso α-actinina, verde) per la frazione meno abbondante (in questo caso i batteri, rosso), cioè il numero di pixel rossi che si sovrappongono con pixel verdi rispetto al numero totale di pixel rossi. </li><li> Manders 'coefficienti compresi tra 1 e 0, dove 1 colocalisation alta, 0 non essere, ma che può essere espresso come percentuale per una più facile interpretazione. </li></ol></li><li> Statistiche di esportare i valori di un documento di Excel per la presentazione dei dati. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Localizzazione intracellulare di Opc che esprimono Neisseria meningitidis e α-actinina Confocale di cellule cerebrali umane microvascolari endoteliali infettate con Nm per 3 e 8 ore come sopra indicato colocalisation di α-actinina e Nm che sembrava essere meno frequenti in 3 esperimenti di infezione h (non mostrato) in confronto con culture infetti per 8 ore ( Figura 1 AF). Un colocalisation dimostrabili di α-actinina con Opc che esprimono meningococchi è stata osservata ogni volta in&gt; 5 esperimenti di replicare. L'analisi statistica dei colocalisation utilizzando diverse immagini confocale è stata effettuata come descritto sopra. Complessivamente, nel HBMEC infettati con Opc che esprimono meningococchi,&gt; sovrapposizione del 25% del verde (α-actinina) e rosso (Nm) è stato ottenuto pixel (Figura 2B, Overlap coefficiente R). In contrasto con α-actinina, esperimenti in cui è stata effettuata l'etichettatura di batteri e interiorizzato sia actina e vimentina, colocalisation occasionalmente è stata osservata con l'actina, ma che con vimentina era rara (Figure. 2B). I dati sono stati analizzati utilizzando il coefficiente di mio, che prende in considerazione l'abbondanza relativa di ogni porzione. La mia è una misura della frequenza di occorrenza del segnale più abbondante (in questo caso verde, α-actinina) ogni volta che il segnale meno abbondanti (in questo caso rosso, batteri) si verifica. Questa misura mostra un livello notevole di presenza di α-actinina nelle vicinanze di interiorizzate meningococchi (Figura 2 A e C). <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Microscopia confocale a scansione laser per valutare le interazioni intracellulari di N. meningitidis con α-actinina. AH. Monostrati confluenti endoteliali coltivate su vetrini sono stati infettati con il Opc che esprimono (AF) N. meningitidis. Dopo 8 ore, non aderente batteri sono stati lavati via, cellule fissate con paraformaldeide e permeabilised con 0,1% Triton X-100. Successivamente, i batteri e α-actinina sono state colorate come descritto in precedenza (α-actinina, verde, batteri, rosso). AC. Un campo che mostra le immagini xy della posizione del Nm (A) o α-actinina (B). L'immagine in sovrapposizione (C) indica diverse regioni in cui colore giallo-arancio sembra suggerire colocalisation. Frecce (A) e (B) mostrano regioni in cui un alto grado di α-actinina accumulo sembra essere avvenuto intorno batteri. D. dissezione ottica di un infetto colocalisation monostrato HBMEC indicando intorno batteri intracellulari trova alla base di una cella. Di nuovo, questo colocalisation non è dovuto alla vicinanza accidentale di α-actinina, come il generale macchia di α-actinina in questa regione è basso. E e F. immagini tridimensionali di monostrati infettati HBMEC trattati come sopra. Una visione obliqua della superficie apicale (E) mostra i batteri aderenti macchiato di rosso (freccia rossa), mentre diversi batteri trova verso la superficie basale delle cellule endoteliali (freccia gialla) sono nettamente arancione / giallo a colori. Posizione basale può essere più chiaramente in (F), che è un fine-on XZ sezione trasversale. G. Un negativamente macchiato l'immagine al microscopio elettronico di N. meningitidis mostrando il suodiplococcal predominante da. Ogni cocco è di circa 0,5 micron di diametro. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Localizzazione e distribuzione di α-actinina, actina e vimentina nelle cellule HBMEC. Monostrati A. infetti di HBMEC sono stati trattati come descritto nella leggenda sopra, ma in aggiunta a α-actinina, alcune lamelle sono stati utilizzati per la rilevazione di actina e vimentina con procedura analoga a quella di α-actinina. Come sopra, α-actinina concentrata intorno ad alcuni batteri interiorizzato (frecce bianche). Vimentina e actina non colocalise con i batteri a livelli apprezzabili. Bar rappresenta il 20 micron. B. &amp; C. I valori per i coefficienti di R e I miei sono stati ottenuti da più di tre esperimenti utilizzando il software Volocity come descritto sopra.

<ol><li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells%3B+the+role+of+integrins+in+apical+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li>
<li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells%3A+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li>
<li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li>
<li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li>
<li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica+et+Cytochemica%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La possibilità di legame di interiorizzate Opc che esprimono Neisseria meningitidis di α-actinina è stata esplorata utilizzando HBMEC per l&#39;esame della colocalisation di batteri e le proteine ​​del citoscheletro nelle cellule infette dopo 3 e 8 periodo di incubazione. Mediante microscopia confocale, colocalisation di Neisseria meningitidis con α-actinina potrebbe essere dimostrata. In particolare, anche se i batteri sono stati internalizzati in 3 ore, c&#39;era colocalisation po &#39;con α-actinina a questo punto del tempo. Associazione batterica con la proteina del citoscheletro hanno richiesto un lungo periodo di residenza intracellulare come dopo 8 h periodo di infezione, un numero significativo di batteri aveva α-actinina apparentemente in stretta associazione. Alfa-actinina è una proteina multifunzionale, e le interazioni batteriche con l&#39;elemento del citoscheletro potrebbe avere un&#39;influenza significativa sulla funzione delle cellule bersaglio, che è un oggetto di studi in corso. Quantificazione dei colocalisation come sopra descritto richiede una meticolosa preparazione del campione. Particolare attenzione dovrebbe essere data alla fissazione del campione, il blocco diluizioni periodo e anticorpi. Per il miglior rapporto segnale rumore, ogni anticorpo primario e secondario devono essere titolati in esperimenti preliminari per determinare le concentrazioni ottimali. Nella nostra esperienza, il Mowiol mezzo di montaggio prodotta immagini migliori.

1. Microscopia confocale a scansione laser (CLSM): Leica SP5 confocale sistema di imaging: Questo sistema, utilizzando una combinazione di AOTF (acusto-ottico filtro sintonizzabile) e un AOBS (acusto-ottico divisore di fascio), semplifica l&#39;eccitazione con lunghezze d&#39;onda specifiche. 2-Software: Leica confocale software LCS, Leica Microsystems, in Germania. Volocity 5, improvvisazione, PerkinElmer, USA.

visualizzazione e quantificazione delle interazioni intracellulari di neisseria meningitidis e umano α-actinina da imaging confocale

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

La proteina Opc di Neisseria meningitidis (Nm, meningococco) è una superficie espressa proteina integrale della membrana esterna, che può agire come adesina e un invasin efficace per cellule epiteliali ed endoteliali. Abbiamo identificato endoteliali superficie situata integrine come recettori importanti per Opc, un processo che richiede Opc di legarsi prima a ligandi dell&#39;integrina come vitronectina e tramite questi alla cella-espresso recettori 1. Questo processo porta ad invasione batterica delle cellule endoteliali 2. Più di recente, abbiamo osservato una interazione di Opc con una proteina 100kDa trovato nei lisati cellulari totali di cellule umane 3. Inizialmente abbiamo osservato questa interazione quando le proteine ​​della cellula ospite separati mediante elettroforesi e cancellati a nitrocellulosa sono stati sovrapposti con Opc che esprimono Nm. L&#39;interazione è diretta e non coinvolgono le molecole intermedie. Mediante spettrometria di massa, abbiamo stabilito l&#39;identità della proteina α-actinina. Poiché non sono superficie espressa α-actinina è stato trovato su una delle linee di cellule otto esaminati, Opc e le interazioni con le cellule endoteliali in presenza di piombo nel siero all&#39;ingresso batteriche nelle cellule bersaglio, abbiamo esaminato la possibilità che le due proteine ​​interagiscono intracellulare. Per questo, colta cervello umano le cellule endoteliali microvascolari (HBMECs) sono stati infettati con Opc, che esprimono Nm per lunghi periodi e le località di batteri internalizzati e α-actinina sono stati esaminati al microscopio confocale. Abbiamo osservato tempo-dipendente aumento della colocalisation Nm con le proteine ​​del citoscheletro, che è stato notevole dopo un periodo di otto ore di internalizzazione batterica. Inoltre, l&#39;uso di software di imaging quantitativa ci ha permesso di ottenere una misura relativa della colocalisation di Nm con α-actinina e di altre proteine ​​del citoscheletro. Qui vi presentiamo un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione delle colocalisation del batterio con le proteine ​​intracellulari dopo l&#39;entrata batterica in cellule endoteliali umane, anche se la procedura è applicabile anche alle cellule epiteliali umane.

Neisseria meningitidis (Nm), un grammo negativo umano-specifici patogeni respiratori, possono legarsi ai umano α-actinina. Qui vi presentiamo un protocollo per la visualizzazione di colocalisation del batterio intracellulare con α-actinina dopo l&#39;entrata batteriche nelle cellule umane endoteliali microvascolari cerebrali (HBMECs).

Visualizzazione e quantificazione delle interazioni intracellulari di Neisseria meningitidis E umano α-actinina da Imaging confocale

La proteina Opc di Neisseria meningitidis (Nm, meningococco) è una proteina integrale della membrana esterna espressa in superficie, che può agire come adesina e come ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare il grado di codistribuzione dei batteri internalizzati, RIA Meningitidis, con la proteina del citoscheletro Alpha Actinin. Questo viene ottenuto infettando cellule microvascolari cerebrali umane in coltura con una coltura batterica di 24 ore per un periodo compreso tra tre e otto ore, consentendo ai batteri di entrare nelle cellule bersaglio. Come secondo passaggio, le cellule contenenti batteri intracellulari vengono lavate, fissate e quindi permeabilizzate, preparando così la coltura infetta per la colorazione immunoistochimica dei batteri internalizzati e dell'alpha actinin intracellulare.Dopo l'acquisizione delle immagini confocali e l'applicazione di software per la codistribuzione, è possibile osservare le immagini della codistribuzione intracellulare e ottenere risultati quantitativi che mostrano come Meninga Croci che esprime OPC e anche una proteina di membrana possano interagire specificamente con l'alfa-actinina intracellulare, in base alla visualizzazione al microscopio confocale e all'analisi quantitativa della codistribuzione. Ciao, sono Isel Maria del laboratorio della Professoressa Mata TI presso il Dipartimento di Medicina Cellulare e Molecolare dell'Università di Bri. Oggi vi mostreremo un procedimento per la stima del livello di col, del rapporto tra batteri intracellulari e proteine del citoscheletro.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare un'interazione tra meningite miceliale che esprime una proteina di membrana auto OPC e la proteina del citoscheletro alfa-actina. Cominciamo dunque. Questo lavoro deve essere svolto in un laboratorio con adeguate misure di sicurezza.Due giorni prima della procedura di immunomarcatura, inoculare il ceppo batterico di interesse su agar al brodo cerebello-cuore. Incubare le piastre di agar supplementate con il 10% di sangue equino inattivato termicamente durante la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al 5% di anidride carbonica il giorno precedente l'immunomarcatura. Utilizzare un’ansa da 10 microlitri per preparare una sospensione della coltura batterica notturna.In due millilitri di PBSB, lasciare in riposo la sospensione per cinque minuti a temperatura ambiente, in modo da permettere la sedimentazione dei grandi aggregati batterici. Successivamente, trasferire l'uno millilitro superiore della sospensione in un tubo sterile senza disturbare il pellet, solubilizzando i batteri aggiungendo un millilitro di SDS all'1% e idrossido di sodio 0,1 molare a due vial contenenti 20 microlitri di sospensione batterica e capovolgere il tubo per mescolare. Per stimare il numero di batteri.Misurare il contenuto di acidi nucleici determinando l'assorbanza della soluzione. A 216 anteri, regolare la sospensione batterica alla densità richiesta nel mezzo di infezione per infettare le cellule endoteliali microvascolari del cervello umano. Le cellule endoteliali microvascolari del cervello umano o H-B-M-E-C-A, seminate due giorni prima della colorazione immunoistochimica, posizionare coprivetrini di vetro da 16 millimetri nelle pozzette di una piastra a 12 pozzette e seminare le HBMEC al 50% di confluenza sui coprivetrini, incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% il giorno successivo.Infetta le cellule con la sospensione batterica appena preparata nel nostro laboratorio. Si utilizza comunemente un rapporto di infezione di 200-300 unità formanti colonie per cellula bersaglio. Incuba per tre fino a otto ore a 37 °C in presenza di 5% di anidride carbonica al termine del periodo di infezione.Lavare le cellule tre volte con PBS e fissarle con 500 microlitri di paraformaldeide al 2% per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso la paraformaldeide, permeabilizzare le cellule fissate con paraformaldeide incubandole in Triton X-100 0,1% diluito in PBS per 10 minuti. Infine, lavare i campioni tre volte con PBS e procedere alla colorazione immunoistochimica come indicato. La successiva colorazione per i batteri intracellulari e per l'actinina può essere eseguita contemporaneamente.In piastre a 12 pozzetti, bloccare le coprioggetti contenenti le cellule permeabilizzate con 500 microlitri di 3% B-S-A-P-B-S-T per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con PBS, trasferire ciascuna coprioggetto in un nuovo pozzetto asciutto della piastra a 12 pozzetti, aggiungendo contemporaneamente gli anticorpi primari contro i batteri e l'alfa-actinina; 80-100 microlitri di anticorpo per coprioggetto sono sufficienti se aggiunti con attenzione per coprire interamente la superficie della coprioggetto. Incubare per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 200 microlitri di PBS al pozzetto, sollevare la coprioggetto e posizionarla in un nuovo pozzetto contenente 500 microlitri di PBS. Dopo cinque minuti, rimuovere il PBS mediante pipetta e quindi aggiungere PBS fresco. Ripetere l'operazione due volte e trasferire le coprioggetti in un nuovo pozzetto asciutto.Successivamente, aggiungere le opportune immunoglobuline secondarie coniugate con diversi fluorocromi, diluite in 1% B-S-A-P-B-S-T. Incubare a temperatura ambiente per un'ora al buio. Alla fine dell'incubazione, eseguire il lavaggio come indicato in precedenza, quindi controcolorare il DNA con DPI per cinque minuti a temperatura ambiente al buio. Al termine di questa incubazione, lavare le lamelle in PBS una volta, quindi montarle con una goccia di mezzo di montaggio. Le lamelle montate devono essere conservate al buio fino al momento dell'osservazione. Al microscopio, osserviamo e acquisiamo immagini dei nostri campioni immunoetichettati utilizzando un microscopio confocale a scansione laser collegato a un microscopio a fluorescenza episcopica invertito.Per iniziare la procedura di CLSM, aggiungere una goccia di olio di immersione all'obiettivo e posizionare il vetrino con il coprioggetto, inserendolo delicatamente sul portapreparati del microscopio. Impostare il microscopio sulla modalità visiva e individuare l'area di interesse utilizzando gli oculari. A questo punto siamo pronti per utilizzare il software Leica. Selezionare la modalità di acquisizione XY zed. Scegliere il formato 5×12 per 5×12 per gli studi di codistribuzione.Più alta è la risoluzione, più accurata sarà l'immagine. Quindi selezionare la modalità X bidirezionale, che aumenterà la velocità di scansione e contribuirà a ridurre il fotoblesamento. Impostare le opzioni di scansione sequenziale.Fare clic sulla funzione SEC e quindi selezionare tra le linee. Selezionare i fasci laser in base ai fluorocromi coniugati agli anticorpi secondari. 4 0 5 nanometri per DPI, 4 88 nanometri per Alexa Fluor 4 88 e 5 61 nanometri.Per trixy, attivare rispettivamente il tubo fotomoltiplicatore uno, due e tre. Impostare l'inizio e la fine dello stack o serie Z. Successivamente, impostare l'incremento Z a 0,2 micrometri.RIA Mencius è un diplococco e, poiché ciascun coccus ha un diametro approssimativo di 0,5 micrometri, un incremento Z di 0,2 micrometri aumenta la probabilità di scansionare ciascun coccus almeno due volte. Impostare i parametri finali di scansione selezionando una media su tre linee per migliorare il rapporto segnale-rumore, cliccando su avvia. Le immagini colorate con doppia o tripla colorazione vengono ottenute mediante scansionamento sequenziale a diverse lunghezze d'onda e utilizzando la modalità tra le linee per ogni canale, al fine di eliminare il crosstalk tra i diversi cromofori.Per un'indicazione della codistribuzione di due fluorocromi, selezionare la funzione di sovrapposizione per unire i canali selezionati in un'unica immagine. Ad esempio, quando entrambi i fluorocromi Alexa 4 88 e trissy Fluor sono codistribuiti, apparirà un colore giallo nell'immagine sovrapposta. Per una ricostruzione 2D necessaria per visualizzare la possibile codistribuzione, compilare lo stack Z o la serie utilizzando la funzione di proiezione massima. Dopo aver acquisito lo stack Z o la serie, elaborare i dati per ottenere un'immagine ortogonale per la visualizzazione della localizzazione intracellulare di vari elementi.La quantificazione della codistribuzione è eseguita utilizzando il software Vol City della fornitura IMP. Per iniziare, creare una libreria con immagini CLSM, selezionando la messa a fuoco estesa dall'immagine nella barra superiore. Questo strumento combinerà gli stack Z in un'immagine 2D da analizzare.Ora selezionare lo strumento COLOCALIZZAZIONE. I due canali da analizzare devono avere la stessa profondità di colore. Selezionare l'area che verrà quantificata.Impostare la soglia per rimuovere qualsiasi sfondo. Creare l'output di colocalizzazione selezionando "genera colocalizzazione". Verranno generati i dati statistici di colocalizzazione per le regioni di interesse selezionate in precedenza.Successivamente, selezionare i coefficienti di Mander R e ny. Infine, esportare i valori statistici in un documento Excel per la presentazione dei dati; qui mostrati sono risultati rappresentativi di immagini confocali di cellule endoteliali cerebrali umane infettate con meningococco per otto ore. La localizzazione dei batteri è indicata in rosso.Sebbene la localizzazione dell'alfa-actinina sia mostrata con frecce verdi che indicano regioni in cui sembra essersi verificata un'elevata accumulazione di alfa-actinina attorno ai batteri. In questa immagine sovrapposta, vi sono diverse aree in cui appare un colore giallo-arancione, suggerendo una codistribuzione tra meningo-occi e alfa-actinina. In questa immagine successiva, la dissezione ottica di un monocstrato di H-B-M-E-C infetto indica una codistribuzione attorno ai batteri intracellulari localizzati alla base di una cellula.Quando sono state elaborate immagini tridimensionali di monolayer di H-B-M-E-C infetti, una vista obliqua della superficie apicale mostra batteri Durant colorati di rosso, indicati dalla freccia rossa, dove diversi batteri si trovano in prossimità delle superfici basali delle cellule endoteliali, indicate dalla freccia gialla. Una localizzazione basale di colore arancione, giallo, può essere vista più chiaramente in questa sezione trasversale XZ endon. In contrasto con esperimenti di actinin da lontano, nei quali è stata effettuata l'etichettatura di batteri internalizzati e di menton o actina, si osserva una rara colocalizzazione con fermenting nelle cellule H-B-M-E-C, mentre la colocalizzazione con l'actina è occasionale.Come osservato nei precedenti esperimenti, la Retin era concentrata attorno a diversi batteri internalizzati indicati dalle frecce bianche. I dati sono stati inoltre analizzati per ottenere il grado relativo di sovrapposizione. Il coefficiente R, che secondo Manda rappresenta il reale grado di codistribuzione IE, ovvero il numero di pixel che colocalizzano rispetto al numero totale di pixel, e i valori NY per l'alfa-actinina, la menting e l'actina nel complesso in H-B-M-E-C infettate da OPC esprimenti meningococchi, hanno mostrato una sovrapposizione superiore al 25% della rein nei meningococchi.Il coefficiente e la Y sono una misura della frequenza di una valuta del segnale di rein più abbondante ogni volta che si verifica il segnale di meninga cocoa meno abbondante. Questa misura mostra un livello sorprendente di occorrenza di alfa-actinina nelle vicinanze di meninga cockeye internalizzata. Mostreremo semplicemente come visualizzare e quantificare l'introduzione di batteri internalizzati con elementi del citoscheletro all'interno di questo esperimento.È importante ricordare di seguire scrupolosamente le procedure di fissazione e di immunomarcatura per mantenere l'integrità delle strutture ed evitare un elevato rumore di fondo. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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