Visualizzazione e quantificazione delle interazioni intracellulari di Neisseria meningitidis E umano α-actinina da Imaging confocale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di valutare il livello di colocalizzazione dei batteri internalizzati, RIA Meningitidis con la proteina del citoscheletro alfa actinina. Ciò si ottiene infettando le cellule microvascolari del cervello umano in coltura con una coltura notturna di batteri per tre-otto ore per consentire ai batteri di entrare nelle cellule bersaglio. In una seconda fase, le cellule con batteri intracellulari vengono lavate, fissate e quindi permeate, preparando la coltura infetta per la colorazione immunitaria dei batteri internalizzati e dell'alfa actinina intracellulare.

Dopo l'imaging confocale e l'applicazione del software di colocalizzazione, è possibile osservare immagini della colocalizzazione intracellulare e ottenere risultati quantificati che mostrano che Meninga Croci esprime OPC e anche la proteina di membrana può interagire specificamente con l'alfa actina intracellulare sulla base della visualizzazione microscopica confocale e dell'analisi quantitativa di colocalizzazione. Ciao, sono Isel Maria del Professor Mata TI Lab presso il Dipartimento di Medicina Molecolare Cellulare dell'Università di Bri. Oggi vi mostreremo una procedura per la stima del livello di col, rapporto tra batteri intracellulari e proteine del citoscheletro.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare un'interazione tra la meningite del micelio che esprime una proteina OPC di membrana automatica con la proteina alfa actina del citoscheletro. Quindi iniziamo. Questo lavoro deve essere svolto in un laboratorio di sicurezza adeguato.

Due giorni prima della procedura di immunocolorazione, inoculare la colorazione batterica di interesse durante l'infusione del cuore cerebrale. Le piastre di agar integrate con sangue di cavallo riscaldato al 10% crescono durante la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% il giorno prima della colorazione immunologica. Utilizzare un anello di coltura da 10 microlitri per effettuare una sospensione della coltura batterica notturna.

In due millilitri di PBSB, lasciare riposare la sospensione per cinque minuti a temperatura ambiente per consentire la sedimentazione di grandi aggregati batterici. Quindi, trasferire il millilitro superiore della sospensione in una provetta sterile senza disturbare il pellet, solubilizzare i batteri aggiungendo un millilitro di idrossido di sodio molare all'1% SDS 0,1 a due fiale contenenti 20 microlitri di sospensione batterica e capovolgere la provetta per mescolare. Per stimare il numero di batteri.

Misurare il contenuto di acido nucleico determinando l'assorbanza della soluzione. A 216 corna regolano la sospensione batterica alla densità richiesta nel mezzo di infezione per infettare le cellule endoteliali microvascolari del cervello umano. Cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane o H-B-M-E-C-A seminate due giorni prima della colorazione immunologica, posizionate su vetrine da 16 millimetri nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti e seminano i mari HBME al 50%Confluenza sui vetrini, incubano per una notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% il giorno successivo.

Infettare le cellule con la sospensione batterica appena preparata nel nostro laboratorio. Viene utilizzato di routine un rapporto di infezione compreso tra 200 e 300 unità formanti colonie per cellula bersaglio. Incubare da tre a otto ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% alla fine del periodo di infezione.

Lavare le cellule tre volte con PBS e fissare 500 microlitri di para formaldeide al 2% per 30-45 minuti a temperatura ambiente Dopo aver lavato via la paraformaldeide, permeare le cellule fissate con paraldeide incubando in Triton X 100 allo 0,1% diluito in PBS per 10 minuti. Infine, lavare i campioni tre volte con PBS e procedere alla colorazione immunologica come mostrato. La successiva colorazione dei batteri intracellulari e della dfor actinina può essere eseguita contemporaneamente.

In piastre a 12 pozzetti ostruiscono i vetrini di copertura contenenti le celle permeabili con 500 microlitri di 3% B-S-A-P-B-S-T per 30-60 minuti. A temperatura ambiente dopo il lavaggio con trasferimento PBS, ogni vetrino di copertura in un nuovo pozzetto asciutto nella piastra a 12 pozzetti in corrispondenza degli anticorpi primari contro i batteri e l'alfa actinina contemporaneamente Da 80 a 100 microlitri di anticorpi per vetrino coprioggetti sono sufficienti se aggiunti con cura per coprire la superficie del vetrino coprioggetti, incubare per un'ora a temperatura ambiente Al termine dell'incubazione, aggiungere 200 microlitri di PBS al, sollevare bene il vetrino coprioggetti e posizionarlo in un nuovo pozzetto contenente 500 microlitri di PBS Dopo cinque minuti, rimuovere il PBS mediante pipettaggio e quindi aggiungere PBS fresco. Ripetere due volte e trasferire i vetrini coprioggetto in un nuovo pozzetto asciutto.

Successivamente, aggiungere gli anticorpi secondari appropriati coniugati a diversi fluorocromi diluiti all'1%B-S-A-P-B-S-T Incubare a temperatura ambiente per un'ora al buio al termine del lavaggio di incubazione mostrato in precedenza, quindi controcolorare il DNA con DPI per cinque minuti a temperatura ambiente al buio al termine di questa incubazione, lavare una volta i vetrini coprioggetto in PBS e quindi montare con una goccia di montaggio. I vetrini coprioggetti montati di media lunghezza devono essere conservati al buio fino a quando non sono pronti per l'osservazione. Al microscopio, osserviamo e catturiamo immagini dei nostri campioni immunomarcati utilizzando un microscopio a scansione laser confocale collegato a un microscopio a epifluorescenza invertito.

Per iniziare la procedura CLSM con una goccia di immersione sull'obiettivo e posizionare il coperchio del vetrino del campione, scivolare sul tavolino del microscopio, impostare il microscopio in modalità visiva e trovare l'area di interesse utilizzando gli oculari del microscopio, siamo ora pronti per utilizzare il software Leica. Selezionare la modalità di acquisizione XY zed. Seleziona il formato five 12 by five 12 per gli studi di colocalizzazione.

Maggiore è la risoluzione, più accurata è l'immagine. Quindi seleziona la modalità X bidirezionale, che aumenterà la velocità di scansione e aiuterà a ridurre lo sbiancamento delle foto. Configurare le impostazioni di scansione sequenziale.

Fare clic sulla funzione SEC e quindi selezionare tra le righe. Selezionare i raggi laser in base ai fluorocromi coniugati agli anticorpi secondari. 4 0 5 nanometri per DPI 4 88 nanometri per Alexa, Fluor 4 88 e 5 61 nanometri.

Per trixy attivare rispettivamente il tubo fotomoltiplicatore uno, due e tre. Configura la parte superiore e inferiore della pila Z o della serie. Set successivo, dimensione del passo Zed a 0,2 micrometri.

RIA Mencius è un diplo occus e poiché ogni caucus ha un diametro approssimativo di 0,5 micrometri, una dimensione del passo Z di 0,2 micrometri aumenta la probabilità di scansionare ogni caucus almeno due volte. Impostare i parametri di scansione finale selezionando la media delle linee di tre per migliorare il rapporto segnale/rumore facendo clic su start. Le immagini con colorazione doppia o tripla sono ottenute mediante scansione sequenziale a diverse lunghezze d'onda e utilizzando la modalità tra le linee per ciascun canale per eliminare la diafonia tra i diversi cromofori.

Per un'indicazione della colocalizzazione di due fluorocromi, selezionare la funzione di sovrapposizione per unire i canali selezionati in un'unica immagine. Ad esempio, quando sia Alexa 4 88 che trissy Fluor Chromes colocalizzano il colore giallo apparirà nell'immagine sovrapposta per Una ricostruzione 2D necessaria per visualizzare possibili compili di colocalizzazione Zed stack o serie utilizzando la funzione di massima proiezione. Dopo aver acquisito lo stack Z o la serie, elabora i dati per ottenere un'immagine ortogonale per la visualizzazione della localizzazione intracellulare di vari elementi.

La quantificazione della colocalizzazione viene eseguita utilizzando il software Vol City di IMP provision. Per iniziare a creare una libreria con immagini CLSM, selezionare la messa a fuoco estesa dall'immagine nella barra superiore. Questo strumento combinerà Zacks in un'immagine 2D da analizzare.

Ora seleziona lo strumento di COLOCALIZZAZIONE. I due canali da analizzare devono avere la stessa profondità di colore. Selezionare l'area che si intende quantificare.

Imposta la soglia per rimuovere qualsiasi sfondo. Creare l'output della colocalizzazione selezionando genera colocalizzazione. Le statistiche di colocalizzazione saranno generate per le regioni di interesse selezionate in precedenza.

Quindi, seleziona i coefficienti di mander R e ny. Infine, l'esportazione o i valori statistici in un documento Excel per la presentazione dei dati hanno mostrato qui i risultati dell'imaging confocale rappresentativo delle cellule endoteliali del cervello umano infettate da meninga cockeye per otto ore. La posizione dei batteri è mostrata in rosso.

Mentre la posizione dell'alfa actinina è mostrata in verde, le frecce indicano le regioni in cui sembra essersi verificato un alto grado di accumulo di alfa actinina intorno ai batteri. In questa immagine in sovrimpressione, ci sono diverse regioni in cui appare il colore giallo arancio che suggerisce una colocalizzazione tra meninga occi e alfa actinina. Nell'immagine successiva, la dissezione ottica di un monostrato H-B-M-E-C infetto indica la colocalizzazione attorno ai batteri intracellulari situati alla base di una cellula.

Quando sono state elaborate immagini tridimensionali di monostrati H-B-M-E-C infetti, una vista obliqua della superficie apicale mostra un batterio Durant colorato di rosso indicato dalla freccia rossa dove diversi batteri si sono localizzati verso le superfici basali delle cellule endoteliali indicate dalla freccia gialla. Una posizione basale distintamente arancione e di colore giallo può essere vista più chiaramente in questa sezione trasversale XZ. A differenza di afar, gli esperimenti sull'actinina in cui è stata eseguita la marcatura di batteri internalizzati e mentone o actina rivelano una colocalizzazione occasionale con l'actina ma una rara colocalizzazione con la fermentazione nelle cellule H-B-M-E-C.

Come osservato negli esperimenti precedenti, Retin era concentrato attorno a diversi batteri internalizzati indicati dalle frecce bianche. I dati sono stati anche analizzati per ottenere una sovrapposizione relativa. Il coefficiente R, che secondo Manda, rappresenta il vero grado di colocalizzazione IE, il numero di pixel che si colocalizzano rispetto al numero totale di pixel e i valori NY per alfa actinina, menting e actina in generale in H-B-M-E-C infettati da meningococchi che esprimono OPC, è stata ottenuta una sovrapposizione maggiore del 25% delle redini in un meningococchi.

Il coefficiente e Y è una misura della frequenza di una valuta del segnale di rein più abbondante ogni volta che si verifica il segnale di meninga cacao meno abbondante. Questa misura mostra un livello sorprendente di occorrenza di alfa attinina in prossimità di meninga cockeye internalizzata. Vi mostriamo solo come visualizzare e quantificare l'introduzione di batteri internalizzati con elementi del citoscheletro all'interno di questo esperimento.

È importante ricordarsi di seguire rigorosamente i protocolli di fissazione e staminali immunitarie per mantenere l'integrità delle strutture ed evitare un background elevato. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.