Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Qui illustriamo il protocollo per eseguire la microscopia a fluorescenza a singola molecola su cellule batteriche vive, al fine di rilevare, tracciare e quantificare complessi molecolari funzionali. Questo protocollo inizia con la coltivazione di batteri che esprimono una proteina marcativa con una molecola fluorescente. Dopo quattro-sei ore, un piccolo volume di cellule viene prelevato dalla coltura e i filamenti dei flagelli vengono troncati mediante taglio meccanico.

Un vetrino di vetro all'interno di una camera di flusso viene rivestito per consentire alle cellule di aderire alla superficie. Le cellule vengono iniettate nella camera di flusso e ancorate mediante un gambo gellare, che viene osservato in fluorescenza utilizzando la microscopia a eccitazione laser. Una telecamera ad alta efficienza quantistica registra quindi le immagini in campo chiaro e in fluorescenza dei complessi molecolari marcati.

Ciao, mi chiamo Ian Doy e lavoro con Mark Lee presso il Dipartimento di Biochimica dell'Università di Oxford. Sono Alex Robertson e lavoro con Mark Lee nel dipartimento di fisica. Sono Nick De del laboratorio leak, anch'esso situato nel dipartimento di fisica.

Oggi vi mostreremo la procedura per visualizzare complessi molecolari singoli in batteri viventi mediante microscopia a fluorescenza avanzata. Utilizziamo questa procedura per studiare queste strutture in uno stato funzionale. La stiamo inoltre utilizzando per indagare la dinamica in tempo reale di macromolecole biologiche naturali e su scala nanometrica.

Iniziamo. Per prima cosa, scongeliare 50 microlitri di steli congelati di batteri e coli. Questi sono stati modificati geneticamente.

Per marcare una proteina con una molecola fluorescente, inoculare cinque millilitri di terreno di coltura LB e far crescere i batteri in agitazione aerobica durante la notte a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, prelevare 50 microlitri della coltura satura e trasferirli in terreno minimo M 63 con glucosio, incubando a 30 gradi Celsius per quattro-sei ore. In questo caso vengono utilizzati due ceppi cellulari diversi.

Uno esprime un citocromo trasportatore di elettroni fuso alla GFP. L'altro esprime una proteina coinvolta nel motore del flagello batterico. Le cellule fuse alla GFP possono essere raccolte direttamente dalla coltura in crescita se devono essere osservate come campioni immobilizzati, oppure possono essere sottoposte a taglio per troncare i flagelli batterici se vengono analizzate in condizioni legate.

Per tagliare i batteri, inserire da uno a cinque millilitri della sotto-coltura in un dispositivo costituito da due siringhe sterili mediante trasferimento sterile. Alternare la spinta in ciascuna siringa per forzare la coltura attraverso il tubo stretto circa da 50 a 100 volte, a seconda del grado di rottura desiderato. Successivamente, centrifugare la coltura per ottenere un pellet cellulare, quindi risospendere le cellule in mezzo minimo per rimuovere i frammenti di flagelli. Una volta che le cellule sono pronte, preparare sette coprioggetti di vetro BK puliti immergendoli in una soluzione satura di idrossido di potassio ed etanolo per 20 minuti.

Risciacquare accuratamente con acqua deionizzata e etanolo e lasciare asciugare all'aria per almeno un'ora. Successivamente, costruire una semplice cella a flusso per alloggiare le cellule nel microscopio. Per fare ciò, tracciare delle linee di grasso al paraffino su un vetrino microscopico in vetro BK7, quindi creare un sandwich a tunnel posizionando uno dei coverslip puliti sulla parte superiore.

Premere delicatamente con una pinzetta. Questo dovrebbe fornire un volume della cella di flusso compreso tra cinque e dieci microlitri. Per osservare le cellule immobilizzate, riempire la cella di flusso iniettando una soluzione allo 0,1% di poli-L-lisina e lasciare incubare a temperatura ambiente per almeno un minuto.

Successivamente, lavare la camera di flusso iniettando 100 microlitri di terreno minimo da un'estremità della camera e contemporaneamente aspirando il terreno attraverso la camera con carta da filtro dall'altra estremità. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di una diluizione 1:500 di microsfere di lattice di 200 nanometri di diametro in terreno minimo per marcare la superficie del vetrino. Posizionare la camera di flusso in una semplice camera umida e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. La camera di flusso viene capovolta in modo che il vetrino sia rivolto verso il basso.

Le perle non legate vengono quindi rimosse per capillarità con 100 microlitri di terreno minimo utilizzando carta da filtro. Per osservare le cellule ancorate, omettere invece il passaggio di incubazione con poli-L-lisina, riempire la camera di flusso con una soluzione di anticorpo Anti-Flag gellan a cinque microgrammi per millilitro e quindi collocarla in una camera umidificata per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare la camera di flusso per capillarità utilizzando carta da filtro.

Successivamente, aspirare 20 microlitri della coltura cellulare attraverso la cella a flusso con carta da filtro, utilizzando il campione tagliato per osservare le cellule ancorate o il campione non tagliato per visualizzare le cellule immobilizzate; la cella a flusso viene quindi capovolta e posizionata nella camera umida per 20 minuti. Le cellule non legate vengono quindi rimosse aspirando 100 microlitri di mezzo minimo. Applicare una goccia di olio per immersione al centro della superficie superiore del vetrino coprioggetto.

Posizionare delicatamente la cella di flusso sul portacampioni del microscopio a fluorescenza costruito su misura. Questo dovrebbe stabilire un contatto ottico con l'obiettivo a elevata apertura numerica. Successivamente, accendere la fotocamera a moltiplicazione elettronica del microscopio e impostare il raffreddamento della fotocamera a meno 70 gradi Celsius.

Il software è impostato per acquisire immagini a una frequenza tipica di 25 hertz. In modalità trasferimento di fotogramma. Accendere l'illuminazione in campo chiaro e mettere a fuoco l'immagine.

Selezionare una cellula o un gruppo di cellule adatto da immagine in base al fatto che sia fissato con il suo asse lungo parallelo alla superficie del vetrino coprioggetto. Regolare la messa a fuoco in modo che le microsfere di lattice da 200 nanometri aderenti alla superficie del vetrino coprioggetto siano appena a fuoco. Acquisire una sequenza di immagini in campo chiaro per registrare il contorno del corpo cellulare.

L'illuminazione in campo chiaro viene quindi spenta e il guadagno della telecamera viene impostato al massimo per l'acquisizione mediante fluorescenza da riflessione totale interna, nota anche come turf. Avviare l'acquisizione della telecamera e aprire lo shutter del laser per eccitare le proteine fluorescenti all'interno dei batteri. I parametri relativi all'intensità del laser e alla velocità di acquisizione devono essere ottimizzati in base al sistema biologico specifico.

I campioni in studio vengono illuminati fino al foto-sbiancamento, un processo che richiede tipicamente circa 10 secondi. Una volta raccolti i dati, le immagini vengono elaborate da un programma di analisi sviluppato appositamente, che rileva automaticamente le posizioni delle macchie fluorescenti all'interno delle cellule con una precisione di pochi nanometri ed estrae le informazioni relative alla dimensione e all'intensità luminosa. L'intensità luminosa del tracciato di foto-sbiancamento in funzione del tempo del complesso molecolare attrattore viene quindi utilizzata per stimare la stechiometria.

Utilizzando questo metodo, l'immagine delle cellule osservata in campo chiaro è molto distinta, in modo che i contorni dei corpi cellulari risultino scuri rispetto a un corpo cellulare grigio chiaro, quando si utilizza la fluorescenza con cellule immobilizzate. Qui vengono mostrati, in falsi colori, spot distinti di intensità con larghezza tipica compresa tra 250 e 300 nanometri. Cellule sane ancorate possono essere osservate ruotare attorno al punto di attacco dell'ancoraggio nelle immagini in campo chiaro durante l'eccitazione fluorescente.

Alcuni complessi molecolari potrebbero essere osservati anche nel punto di attacco, a indicare una localizzazione della proteina contenuta nel serbatoio con il motore di Geller. Queste macchie corrispondono a singoli complessi molecolari. Il numero di questi complessi visibili dipenderà dalla modalità di illuminazione utilizzata e dalla quantità effettivamente presente nella cellula in un determinato momento.

Se inizialmente la densità dei punti è molto elevata, come nel caso dei citocromi marcati utilizzati qui, allora l'esecuzione di un'ablazione iniziale FRAP può migliorare il contrasto dell'immagine. La mobilità dei punti dipende dal sistema biologico specifico in studio. Abbiamo appena mostrato come visualizzare complessi molecolari singoli mediante microscopia a fluorescenza avanzata.

Quando si esegue questa procedura, è importante evitare di esercitare una forza di taglio sulle cellule poiché ciò potrebbe compromettere la funzionalità del motore del flagello. È inoltre importante non lasciare le cellule sulle lamelle del microscopio per più di un'ora poiché potrebbero diventare carenti di ossigeno. È necessaria un'automatizzazione per individuare le migliori condizioni di imaging.

Può essere utile utilizzare solo GFP purificata per determinare la potenza laser corretta per il tuo particolare sistema microscopico. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.