Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Qui dimostriamo il protocollo per eseguire la microscopia a fluorescenza a singola molecola su cellule batteriche viventi per consentire il rilevamento, il tracciamento e la quantificazione di complessi molecolari funzionali. Questo protocollo inizia con la crescita dei batteri, che producono una proteina marcata con una molecola di colorante fluorescente. Dopo quattro-sei ore, un piccolo volume di cellule viene estratto dalla coltura e i loro filamenti di flagelli vengono troncati mediante taglio.

Un vetrino di copertura all'interno di una cella di flusso è rivestito per consentire alle celle di aderire alla superficie. Le cellule vengono iniettate nella cella a flusso e legate tramite un tronchetto gellare, che viene visualizzato in fluorescenza utilizzando la microscopia a eccitazione laser. Una telecamera ad alta efficienza quantica registra quindi le immagini in campo chiaro e in fluorescenza dei complessi molecolari etichettati.

Ciao, mi chiamo Ian Doy e sto lavorando con Mark Lee al Dipartimento di Biochimica dell'Università di Oxford. Sono Alex Robertson e lavoro con Mark Lee nel dipartimento di fisica. Sono Nick De del laboratorio di perdite, anche lui del dipartimento di fisica.

Oggi vi mostreremo la procedura per visualizzare singoli complessi molecolari in batteri viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza avanzata. Usiamo questa procedura per studiare questo in uno stato funzionale. Stiamo anche utilizzando per studiare le dinamiche in tempo reale delle macchine biologiche naturali e della scala delle lenti nanometriche.

Quindi iniziamo. Per iniziare scongelare 50 microlitri di gambi congelati di batteri e coli. Questi sono stati modificati geneticamente.

Per etichettare una proteina con una molecola di colorante fluorescente, inoculare cinque millilitri di terreno di coltura LB e far crescere i batteri agitando aerobicamente durante la notte a 37 gradi Celsius. La mattina successiva, prelevare 50 microlitri di coltura satura e sottocoltivarla in un terreno di coltura di glucosio M 63 minimo incubare a 30 gradi Celsius per quattro-sei ore. Qui vengono utilizzati due diversi ceppi cellulari.

Uno esprime un citocromo trasportatore di elettroni fuso a GFP. L'altro esprime una proteina coinvolta nel motore dei flagelli batterici. Le cellule fuse con GFP possono essere raccolte direttamente dalla sottocoltura in crescita se devono essere viste come campioni immobilizzati, oppure possono essere tranciate per troncare i flagelli batterici se vengono osservate in condizioni di tethering.

Per tosare i batteri, posizionare da uno a cinque millilitri di sottocoltura in un dispositivo costituito da due siringhe sterili mediante tubazioni sterili. Spingere alternativamente in ciascuna pompa a siringa per forzare la coltura attraverso il tubo stretto da 50 a 100 volte circa a seconda dell'entità del taglio acquisito: Successivamente, centrifugare la coltura per pellettare le cellule e quindi risospendere le cellule in un terreno minimo per rimuovere i frammenti di flagelli. Una volta che le celle sono pronte, preparare i vetrini di vetro BK seven puliti immergendoli in una soluzione satura di idrossido di potassio ed etanolo per 20 minuti.

Sciacquare abbondantemente in acqua deionizzata ed etanolo e lasciare asciugare all'aria per almeno un'ora. Quindi, costruisci una semplice cella a flusso per alloggiare le cellule nel microscopio. Per fare ciò, disegna linee di grasso di paraffina su un vetrino da microscopio BK a sette vetri, quindi crea un sandwich a tunnel posizionando sopra uno dei vetrini coprioggetti puliti.

Premere delicatamente con un paio di pinze. Questo dovrebbe dare un volume della cella di flusso da cinque a 10 microlitri. Per osservare le cellule immobilizzate, riempire la cella a flusso iniettandola con una soluzione allo 0,1% di poli-L-lisina e lasciarla incubare a temperatura ambiente per almeno un minuto.

Successivamente, risciacquare la cella di flusso iniettando 100 microlitri di media minima da un'estremità della cella di flusso e contemporaneamente assorbire il media attraverso la cella di flusso con carta velina dall'altra, in seguito, WIC ha gettato 20 microlitri di una diluizione su 500 di microsfere di lattice di 200 nanometri di diametro in un mezzo minimo per contrassegnare la superficie del vetrino coprioggetto. Posizionare la cella a flusso in una semplice camera di umidità e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. La cella di flusso è invertita in modo tale che il vetrino coprioggetti sia rivolto verso il basso.

Le perle non legate vengono quindi lavate via attraverso 100 microlitri di supporto minimo con carta velina. Per osservare le cellule legate, saltare invece la fase di incubazione della poli-lisina L, riempire la cella di flusso con cinque microgrammi per millilitro di soluzione anticorpale di gellano Anti-Flag, quindi posizionarla in una camera di umidità per 10 minuti. Dopo l'incubazione, sciacquare la cella di flusso con carta velina.

Successivamente, WIC 20 microlitri di coltura cellulare attraverso la cella a flusso con carta velina, utilizzando il campione tranciato per osservare le cellule legate o il campione non condiviso per visualizzare le cellule immobilizzate, la cella a flusso viene invertita e posta nella camera di umidità per 20 minuti. Le cellule non legate vengono quindi lavate via attraverso 100 microlitri di terreno minimo. Mettere una goccia di olio da immersione al centro della superficie superiore del vetrino coprioggetti.

Posizionare delicatamente la cella di flusso sul portacampioni del microscopio a fluorescenza personalizzato. Questo dovrebbe stabilire un contatto ottico con l'obiettivo ad alta apertura numerica. Quindi, accendi la fotocamera moltiplicatrice di elettroni del microscopio e imposta la fotocamera in modo che si raffreddi a meno 70 gradi Celsius.

Il software è impostato per acquisire immagini a un frame rate tipico di 25 hertz. In modalità di trasferimento fotogrammi. Attivare l'illuminazione in campo chiaro e mettere a fuoco l'immagine.

Selezionare una cella o un gruppo di celle adatto da visualizzare in base al fatto che sono bloccate con il loro asse lungo. Parallelamente alla superficie del vetrino coprioggetti, regolare la messa a fuoco per assicurarsi che le perle di lattice da 200 nanometri attaccate alla superficie del vetrino coprioggetti siano appena a fuoco. Acquisisci una sequenza di immagini in campo chiaro per registrare il contorno del corpo cellulare.

L'illuminazione del campo chiaro viene quindi disattivata e il guadagno della telecamera viene abilitato al massimo per l'imaging utilizzando la fluorescenza a riflessione interna totale, nota anche come tappeto erboso. Avvia l'acquisizione della fotocamera e apri l'otturatore laser per eccitare le proteine fluorescenti all'interno dei batteri. I parametri per l'intensità del laser e la velocità di acquisizione devono essere ottimizzati per il particolare sistema biologico.

I campioni in studio vengono illuminati fino a quando non vengono sbiancati con la foto, che in genere richiede circa 10 secondi. Una volta raccolti i dati, le immagini vengono inserite in un programma di analisi scritto personalizzato, che rileva automaticamente le posizioni delle macchie fluorescenti nelle celle con una precisione di pochi nanometri e ne estrae le dimensioni e la luminosità. La luminosità della traccia di fotosbiancamento rispetto al tempo di attrazione del complesso molecolare viene quindi utilizzata per stimare l'uso della stechiometria.

Utilizzando questo metodo, l'immagine delle cellule visualizzate in campo chiaro è molto distinta, in modo tale che i perimetri dei corpi cellulari siano scuri contro un corpo cellulare grigio bianco utilizzando la fluorescenza con cellule immobilizzate. Macchie distinte di intensità di larghezza da 250 a 300 nanometri possono essere viste qui visualizzate in falsi colori. Le cellule sane legate possono essere viste ruotare attorno al punto di attacco del cavo nelle immagini in campo chiaro sotto eccitazione fluorescente.

Alcuni complessi molecolari potrebbero anche essere visti nel punto di attacco, indicando una localizzazione della proteina tanked con il motore di Geller. Questi punti sono singoli complessi molecolari. Il numero di questi che vengono visti dipenderà dalla modalità di illuminazione utilizzata e da quanti dei complessi sono effettivamente presenti nella cellula in un dato momento.

Se la densità delle macchie è inizialmente molto alta, come nel caso dei citocromi marcati utilizzati qui, l'esecuzione di un frap bleach iniziale può migliorare il contrasto dell'imaging. La mobilità delle macchie dipende dal sistema biologico specifico. In fase di studio, vi abbiamo appena mostrato come visualizzare singoli complessi molecolari utilizzando la microscopia a fluorescenza avanzata.

Quando si esegue questa procedura, è importante non avere celle di taglio in quanto ciò potrebbe compromettere la funzionalità del motore a bandiera. È anche importante non lasciare le cellule sui vetrini del microscopio per più di un'ora, altrimenti potrebbero esaurirsi di ossigeno. L'automazione è necessaria per trovare le migliori condizioni di imaging.

Può essere utile utilizzare la sola GFP purificata per accertare la corretta potenza laser per il proprio sistema di microscopio. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.