Name: Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Scopri la microscopia a fluorescenza a singola molecola per visualizzare complessi molecolari funzionali in cellule batteriche vive. Questo metodo consente di rilevare, tracciare e quantificare le interazioni molecolari in tempo reale.

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Noi riconosciamo le donazioni tipo di ceppi batterici dai gruppi del Prof. Judith Armitage (Università di Oxford, UK) e il Prof. Corrado Mullineaux (Queen Mary University of London, UK). IMD è finanziato congiuntamente dal Dipartimento di Biochimica (Oxford University) e OCISB; AR è finanziato da un Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) borsa di studio DTC; ND è finanziata dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC); MCL è finanziato da una borsa di studio della Royal Society University Research.

<ol><li> Per iniziare questa procedura, 50 ml di scorte congelate della proteina fluorescente che esprimono Escherichia coli cellule batteriche vengono prima scongelate e coltivate aerobicamente con agitazione in 5 ml di LB mezzi di crescita durante la notte a 37 ° C. Al mattino, 50 ml di questa cultura satura viene estratto e sub-coltura in mezzi di glucosio minima M63 cultura, incubando a 30 gradi C per 4 a 6 ore. Qui mostriamo che utilizza due differenti ceppi cellulari, uno dei quali esprime un elettrone-trasporto citocromo fuso con GFP, l&#39;altra che esprime una proteina coinvolta nel motore flagellare batterico fuso a GFP. </li><li> Le cellule possono sia raccolto direttamente dal crescente sub-cultura, se loro visione come campioni immobilizzati, o possono essere tosato per troncare flagelli batterici se la visualizzazione in &quot;legato&quot; le condizioni. </li><li> Tosatura prevede il posizionamento di solito 1-5ml di sub-cultura in un dispositivo costituito da due siringhe sterili uniti da tubi sterili. La tosatura viene effettuata alternando spingendo in ogni pompa a siringa per spingere la cultura attraverso il tubo stretto. Questo viene fatto 50-100 volte, a seconda della entità del taglio richiesto. La cultura viene poi centrifugato per agglomerare le cellule, che è risospeso in terreno minimo da rimuovere frammenti flagelli. </li><li> Abbiamo poi preparare pulito BK7 coprioggetto di vetro immergendo in una soluzione satura di KOH in etanolo per 20 minuti, poi sciacquare accuratamente in acqua deionizzata e etanolo e lasciare asciugare all&#39;aria per almeno 1 h. </li><li> Costruiamo un semplice flusso di celle per ospitare le cellule al microscopio. Questa consiste nel definire le linee di grasso paraffina su un vetrino da microscopio BK7 vetro e quindi la creazione di un tunnel-panino mettendo uno dei coverlips pulita in cima, e premendo delicatamente con un paio di pinze, dando un volume di cella di flusso di 5-10 microlitri . </li><li> Per osservare le cellule immobilizzate riempiamo il flusso delle cellule da iniezione con una w / v soluzione 0,1% di poli-L-lisina, e permettono di incubare a temperatura ambiente per almeno 1 minuto. Abbiamo poi scovare con 100 microlitri mezzi minimi, iniettando i media da un capo all&#39;altro del flusso delle cellule e che la migrazione con carta velina dall&#39;altro. </li><li> Abbiamo poi lo stoppino attraverso 20 ml di una diluizione 1:500 di 200 nm di diametro in lattice microsfere (Polysciences) in terreno minimo per contrassegnare la superficie coprioggetto. Il flusso delle cellule è invertito in modo che il coprioggetto sia rivolto verso il basso, posto su una piattaforma chiara della superficie in una camera umida semplice, e incubate a temperatura ambiente per 5 min. Perline legato sono poi lavate via dalle traspirazione a 100 microlitri mezzi minimi. </li><li> Se vogliamo osservare le cellule legato omettiamo la poli-L-lisina passo e invece riempire la cella a flusso con 5 mg / ml di anticorpi anti-flagellina. Il flusso delle cellule è posto nella camera umida per 10 minuti e viene poi eliminata attraverso di traspirazione. </li><li> 20 l di la coltura cellulare viene poi malvagio attraverso il flusso delle cellule, sia utilizzando il campione tranciati se osservando le cellule legato, incatenato o il campione unsheared nella visione cellule immobilizzate. </li><li> Il flusso delle cellule è invertito e collocato nella camera umida per 20 minuti. Le cellule non legati vengono lavati da traspirazione a 100 microlitri mezzi minimi. </li><li> Una goccia di olio di immersione si trova nel centro della superficie superiore del vetrino e il flusso delle cellule viene poi messo gentilmente a supporto del campione del costume microscopio a fluorescenza costruito, il contatto ottico con le lenti ad alta apertura numerica dell&#39;obiettivo. </li><li> L&#39;elettrone-moltiplicando microscopio fotocamera è accesa e la fotocamera impostata per essere raffreddato a -70 ° C, il software è impostato per acquisire immagini ad un frame rate tipico di 25 Hz in frame-modalità di trasferimento, inizialmente disenabling il controllo di guadagno sul fotocamera. </li><li> L&#39;illuminazione campo chiaro è acceso e l&#39;immagine viene messa a fuoco, la selezione di un cellulare adeguata o di un gruppo di cellule da acquisire sulla base del loro essere bloccato con le loro asse parallelo alla superficie lungo coprioggetto. L&#39;attenzione è finemente regolata per garantire che i 200 sfere di lattice nm attaccato alla superficie coprioggetto sono solo a fuoco. </li><li> Una sequenza di immagini viene acquisita in campo chiaro per registrare il contorno del corpo cellulare. L&#39;illuminazione campo chiaro è spento e il guadagno della telecamera è abilitato al massimo. </li><li> Per un totale di acquisizione standard utilizzando la fluorescenza di riflessione interna (o TIRF) un fascio laser sulla lunghezza d&#39;onda appropriata (in questo caso l&#39;eccitazione proteina fluorescente verde, si usa un laser a 473 nm) è pre-impostato in modo da essere concentrati nel piano focale posteriore della la lente dell&#39;obiettivo, ma spostato lateralmente rispetto all&#39;asse ottico per generare un campo evanescente per l&#39;eccitazione di fluorescenza nel campione di cellule. </li><li> L&#39;acquisizione della fotocamera viene avviato e l&#39;otturatore aperto laser per eccitare le proteine ​​fluorescenti all&#39;interno del batterio. I parametri per l&#39;intensità del laser e la velocità di acquisizione devono essere ottimizzati per il particolare sistema biologico sotto inchiesta da sperimentare con valori diversi, ma una gamma tipica rignificative a studiare complessi proteici mobile nella membrana cellulare sono 10-10 mW di potenza del laser su una superficie di eccitazione circolare del diametro di circa 30 micron, con un tempo di esposizione per ogni fotogramma di 50-40 ms. I campioni sono illuminate fino fotodecolorate, di solito per circa 10 s. </li><li> Questo protocollo può essere utilizzato sia per le cellule legato in cui il corpo della cellula ruota su un punto di attacco tra il coprioggetti e un mozzicone di flagelli, e per le cellule immobilizzate che sono rigidamente fissate alla superficie coprioggetto. </li><li> Alcuni ceppi di cellule che hanno un elevato numero di complessi copia beneficiare di una prima diffrazione limitata candeggina laser focalizzato su un polo della cellula prima TIRF imaging. Questa candeggina è equivalente a quella utilizzata per il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (o FRAP). Utilizzando il nostro microscopio personalizzati parte della luce laser di eccitazione può essere alimentata via in un secondo percorso indipendente utilizzato per FRAP-tipo sbiancamento. Tipicamente 1-10mW potenza del laser è utilizzato, con un tempo di candeggina tipico nella gamma 10-300 ms. Il risultato è in contrasto con immagini molto più alta nella zona sbiancata della cellula permettendo complessi individuali che successivamente diffusa in quella zona per essere più facili da visualizzare. </li><li> Per visualizzare i complessi nel citoplasma cellulare che diffondono molto più velocemente rispetto a quelli della membrana cellulare è impiegato un modo diverso di illuminazione chiamato &quot;slimfield&quot;. Ecco un laser focalizzato si espande lateralmente fino a comprendere solo una singola cella. Questo produce un campo molto intenso che permette esposizioni molto più veloce di solito un millisecondo da adottare. </li><li> A seguito di acquisizione dati, le immagini sono inseriti in software personalizzato scritto (codificato in LabVIEW 8.5). Questo rileva automaticamente la posizione delle macchie fluorescenti nelle cellule con una precisione di pochi nanometri tipicamente ed estratti delle loro dimensioni e luminosità. Il brightnessof la traccia photobleaching rispetto al tempo di un complesso molecolare tracciato viene quindi utilizzato per stimare la stechiometria, cioè quante singole proteine ​​fluorescenti formano un unico complesso molecolare. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Quando il protocollo è fatto correttamente le immagini delle cellule visto in campo chiaro è molto distinto, con i perimetri dei corpi cella buia contro un corpo cellulare bianco / grigio (Figura 1a). In fluorescenza utilizzando cellule immobilizzate, possiamo vedere l&#39;intensità distinte macchie, di solito 250-300 nm di larghezza (figura 1b). Sane, le cellule si vedrà legato a ruotare attorno al punto di attacco legare in campo chiaro le immagini. Sotto eccitazione di fluorescenza alcuni complessi molecolari nel nostro caso potrebbe anche essere visto al punto di attacco, che indica una localizzazione della proteina taggati con il motore flagellare. Queste macchie sono individuali complessi molecolari e il numero di viste dipende dalla modalità di illuminazione utilizzati e quanti dei complessi sono in realtà presenti nella cellula in un dato momento. La mobilità dei punti dipende dal sistema biologico specifico oggetto di studio. Se la densità dei punti è inizialmente molto alta, come è il caso con i citocromi marcato usato qui, poi eseguire una candeggina FRAP iniziale può migliorare il contrasto delle immagini. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) Brightfield e (B) immagine TIRF (falsi colori) per un immobilizzato cellule di Escherichia coli che esprimono una proteina fusa alla proteina fluorescente verde (GFP) che è noto per essere coinvolto nei motori flagellare di batteri. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1.

<ol><li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential%2C+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Bisogna fare attenzione a non &quot;oltre al taglio&quot; delle cellule per guardare i batteri legati, poiché questo può compromettere la funzionalità del motore flagellare. E &#39;importante utilizzare le cellule per molto più tempo di un&#39;ora una volta sul vetrino da microscopio in quanto possono diventare ossigeno scarica. Notevole ottimizzazione può essere richiesto di trovare migliori condizioni di imaging microscopio soddisfatti al vostro specifico sistema biologico sotto inchiesta. Potrebbe essere saggio tenta...

visualizzazione singola complessi molecolari in vivo utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visione completa dei meccanismi delle cellule viventi può essere raggiunto solo attraverso lo studio dei processi chiave che suscitare e dirigere gli eventi a livello cellulare. Fino ad oggi la complessità dei sistemi biologici taglio ha causato preciso singola molecola sperimentazione di essere troppo esigente, concentrandosi invece su studi di singoli sistemi con massa relativamente greggio insieme alla media delle misurazioni. Tuttavia, molti processi importanti si verificano nella cellula vivente a livello di solo uno o poche molecole; misure ensemble generalmente mascherare la natura stocastica ed eterogenea di questi eventi. Qui, utilizzando avanzate di microscopia ottica e strumenti di analisi di analisi delle immagini ci mostrano come monitorare le proteine ​​all&#39;interno della cellula batterica vivente solo con una precisione di singole molecole e come possiamo osservare la dinamica all&#39;interno di complessi molecolari del funzionamento macchine biologiche. Le tecniche sono direttamente rilevanti fisiologicamente. Si tratta di mini-perturbativa e non-invasivo per il campione biologico oggetto di studio e sono completamente in sintonia per le indagini in materia viva, caratteristiche non facilmente disponibili ad altri approcci singola molecola di biofisica. Inoltre, i campioni biologici studiati tutti i prodotti proteina fluorescente-tag a livelli che sono quasi identici ai ceppi cellulari non modificato (&quot;codifica genomica&quot;), in contrasto con l&#39;approccio più comune ma meno ideale per la produzione di proteine ​​molto più di quanto avverrebbe naturalmente (&#39;plasmide di espressione&#39;). Così, i campioni biologici reali, che saranno oggetto di indagine sono molto più vicini al organismi naturali, e quindi le osservazioni più rilevanti per le reali processi fisiologici.

Qui mostriamo i protocolli per l&#39;esecuzione di singola molecola microscopia a fluorescenza a vivere cellule batteriche per permettere funzionali complessi molecolari per essere rilevati, monitorati e quantificati.

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Una comprensione completa dei meccanismi delle cellule viventi può essere ottenuta solo studiando i processi chiave che scatenano e dirigono gli eventi a livello cellulare...

Qui illustriamo il protocollo per eseguire la microscopia a fluorescenza a singola molecola su cellule batteriche vive, al fine di rilevare, tracciare e quantificare complessi molecolari funzionali. Questo protocollo inizia con la coltivazione di batteri che esprimono una proteina marcativa con una molecola fluorescente. Dopo quattro-sei ore, un piccolo volume di cellule viene prelevato dalla coltura e i filamenti dei flagelli vengono troncati mediante taglio meccanico.Un vetrino di vetro all'interno di una camera di flusso viene rivestito per consentire alle cellule di aderire alla superficie. Le cellule vengono iniettate nella camera di flusso e ancorate mediante un gambo gellare, che viene osservato in fluorescenza utilizzando la microscopia a eccitazione laser. Una telecamera ad alta efficienza quantistica registra quindi le immagini in campo chiaro e in fluorescenza dei complessi molecolari marcati.Ciao, mi chiamo Ian Doy e lavoro con Mark Lee presso il Dipartimento di Biochimica dell'Università di Oxford. Sono Alex Robertson e lavoro con Mark Lee nel dipartimento di fisica. Sono Nick De del laboratorio leak, anch'esso situato nel dipartimento di fisica.Oggi vi mostreremo la procedura per visualizzare complessi molecolari singoli in batteri viventi mediante microscopia a fluorescenza avanzata. Utilizziamo questa procedura per studiare queste strutture in uno stato funzionale. La stiamo inoltre utilizzando per indagare la dinamica in tempo reale di macromolecole biologiche naturali e su scala nanometrica.Iniziamo. Per prima cosa, scongeliare 50 microlitri di steli congelati di batteri e coli. Questi sono stati modificati geneticamente.Per marcare una proteina con una molecola fluorescente, inoculare cinque millilitri di terreno di coltura LB e far crescere i batteri in agitazione aerobica durante la notte a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, prelevare 50 microlitri della coltura satura e trasferirli in terreno minimo M 63 con glucosio, incubando a 30 gradi Celsius per quattro-sei ore. In questo caso vengono utilizzati due ceppi cellulari diversi.Uno esprime un citocromo trasportatore di elettroni fuso alla GFP. L'altro esprime una proteina coinvolta nel motore del flagello batterico. Le cellule fuse alla GFP possono essere raccolte direttamente dalla coltura in crescita se devono essere osservate come campioni immobilizzati, oppure possono essere sottoposte a taglio per troncare i flagelli batterici se vengono analizzate in condizioni legate.Per tagliare i batteri, inserire da uno a cinque millilitri della sotto-coltura in un dispositivo costituito da due siringhe sterili mediante trasferimento sterile. Alternare la spinta in ciascuna siringa per forzare la coltura attraverso il tubo stretto circa da 50 a 100 volte, a seconda del grado di rottura desiderato. Successivamente, centrifugare la coltura per ottenere un pellet cellulare, quindi risospendere le cellule in mezzo minimo per rimuovere i frammenti di flagelli. Una volta che le cellule sono pronte, preparare sette coprioggetti di vetro BK puliti immergendoli in una soluzione satura di idrossido di potassio ed etanolo per 20 minuti.Risciacquare accuratamente con acqua deionizzata e etanolo e lasciare asciugare all'aria per almeno un'ora. Successivamente, costruire una semplice cella a flusso per alloggiare le cellule nel microscopio. Per fare ciò, tracciare delle linee di grasso al paraffino su un vetrino microscopico in vetro BK7, quindi creare un sandwich a tunnel posizionando uno dei coverslip puliti sulla parte superiore.Premere delicatamente con una pinzetta. Questo dovrebbe fornire un volume della cella di flusso compreso tra cinque e dieci microlitri. Per osservare le cellule immobilizzate, riempire la cella di flusso iniettando una soluzione allo 0,1% di poli-L-lisina e lasciare incubare a temperatura ambiente per almeno un minuto.Successivamente, lavare la camera di flusso iniettando 100 microlitri di terreno minimo da un'estremità della camera e contemporaneamente aspirando il terreno attraverso la camera con carta da filtro dall'altra estremità. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di una diluizione 1:500 di microsfere di lattice di 200 nanometri di diametro in terreno minimo per marcare la superficie del vetrino. Posizionare la camera di flusso in una semplice camera umida e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. La camera di flusso viene capovolta in modo che il vetrino sia rivolto verso il basso.Le perle non legate vengono quindi rimosse per capillarità con 100 microlitri di terreno minimo utilizzando carta da filtro. Per osservare le cellule ancorate, omettere invece il passaggio di incubazione con poli-L-lisina, riempire la camera di flusso con una soluzione di anticorpo Anti-Flag gellan a cinque microgrammi per millilitro e quindi collocarla in una camera umidificata per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare la camera di flusso per capillarità utilizzando carta da filtro.Successivamente, aspirare 20 microlitri della coltura cellulare attraverso la cella a flusso con carta da filtro, utilizzando il campione tagliato per osservare le cellule ancorate o il campione non tagliato per visualizzare le cellule immobilizzate; la cella a flusso viene quindi capovolta e posizionata nella camera umida per 20 minuti. Le cellule non legate vengono quindi rimosse aspirando 100 microlitri di mezzo minimo. Applicare una goccia di olio per immersione al centro della superficie superiore del vetrino coprioggetto.Posizionare delicatamente la cella di flusso sul portacampioni del microscopio a fluorescenza costruito su misura. Questo dovrebbe stabilire un contatto ottico con l'obiettivo a elevata apertura numerica. Successivamente, accendere la fotocamera a moltiplicazione elettronica del microscopio e impostare il raffreddamento della fotocamera a meno 70 gradi Celsius.Il software è impostato per acquisire immagini a una frequenza tipica di 25 hertz. In modalità trasferimento di fotogramma. Accendere l'illuminazione in campo chiaro e mettere a fuoco l'immagine.Selezionare una cellula o un gruppo di cellule adatto da immagine in base al fatto che sia fissato con il suo asse lungo parallelo alla superficie del vetrino coprioggetto. Regolare la messa a fuoco in modo che le microsfere di lattice da 200 nanometri aderenti alla superficie del vetrino coprioggetto siano appena a fuoco. Acquisire una sequenza di immagini in campo chiaro per registrare il contorno del corpo cellulare.L'illuminazione in campo chiaro viene quindi spenta e il guadagno della telecamera viene impostato al massimo per l'acquisizione mediante fluorescenza da riflessione totale interna, nota anche come turf. Avviare l'acquisizione della telecamera e aprire lo shutter del laser per eccitare le proteine fluorescenti all'interno dei batteri. I parametri relativi all'intensità del laser e alla velocità di acquisizione devono essere ottimizzati in base al sistema biologico specifico.I campioni in studio vengono illuminati fino al foto-sbiancamento, un processo che richiede tipicamente circa 10 secondi. Una volta raccolti i dati, le immagini vengono elaborate da un programma di analisi sviluppato appositamente, che rileva automaticamente le posizioni delle macchie fluorescenti all'interno delle cellule con una precisione di pochi nanometri ed estrae le informazioni relative alla dimensione e all'intensità luminosa. L'intensità luminosa del tracciato di foto-sbiancamento in funzione del tempo del complesso molecolare attrattore viene quindi utilizzata per stimare la stechiometria.Utilizzando questo metodo, l'immagine delle cellule osservata in campo chiaro è molto distinta, in modo che i contorni dei corpi cellulari risultino scuri rispetto a un corpo cellulare grigio chiaro, quando si utilizza la fluorescenza con cellule immobilizzate. Qui vengono mostrati, in falsi colori, spot distinti di intensità con larghezza tipica compresa tra 250 e 300 nanometri. Cellule sane ancorate possono essere osservate ruotare attorno al punto di attacco dell'ancoraggio nelle immagini in campo chiaro durante l'eccitazione fluorescente.Alcuni complessi molecolari potrebbero essere osservati anche nel punto di attacco, a indicare una localizzazione della proteina contenuta nel serbatoio con il motore di Geller. Queste macchie corrispondono a singoli complessi molecolari. Il numero di questi complessi visibili dipenderà dalla modalità di illuminazione utilizzata e dalla quantità effettivamente presente nella cellula in un determinato momento.Se inizialmente la densità dei punti è molto elevata, come nel caso dei citocromi marcati utilizzati qui, allora l'esecuzione di un'ablazione iniziale FRAP può migliorare il contrasto dell'immagine. La mobilità dei punti dipende dal sistema biologico specifico in studio. Abbiamo appena mostrato come visualizzare complessi molecolari singoli mediante microscopia a fluorescenza avanzata.Quando si esegue questa procedura, è importante evitare di esercitare una forza di taglio sulle cellule poiché ciò potrebbe compromettere la funzionalità del motore del flagello. È inoltre importante non lasciare le cellule sulle lamelle del microscopio per più di un'ora poiché potrebbero diventare carenti di ossigeno. È necessaria un'automatizzazione per individuare le migliori condizioni di imaging.Può essere utile utilizzare solo GFP purificata per determinare la potenza laser corretta per il tuo particolare sistema microscopico. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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La tecnica CLEM è stato adattato per analizzare morfologia ultrastrutturale delle membrane, organelli e strutture subcellulari affetti da molecole microiniezione. Questo metodo combina le potenti tecniche di micromanipolazione / microiniezione, microscopia confocale a fluorescenza, e la microscopia elettronica per consentire millimetro a multi-risoluzione nanometrica. Questa tecnica è suscettibile di una vasta gamma di applicazioni.

Luce Correlativo e Microscopia Elettronica (CLEM) come strumento per visualizzare molecole microiniezione e dei loro sub-cellulari eucariotiche Obiettivi

Descriviamo un metodo di microscopia correlativa che combina 3D live-cell microscopia a luce fluorescente ad alta velocità e la tomografia crio-elettroni ad alta risoluzione. Dimostriamo la capacità del metodo correlativo di imaging dinamico, piccoli HIV-1 particelle interagiscono con le cellule HeLa ospitanti.

Microscopia correlativa per l&#39;analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Dimostriamo l'uso della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM) per visualizzare simultaneamente più tipi di molecole marcate in fluorescenza all'interno delle cellule. Le tecniche descritte producono la localizzazione di migliaia o centinaia di migliaia di singole proteine marcate con fluorescenza, con una precisione di decine di nanometri all'interno di singole cellule.

Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

Descriviamo gli approcci di imaging usiamo per indagare la distribuzione e la mobilità delle proteine ​​fluorescenti trasfettate residenti nel reticolo endoplasmatico (ER) mediante la microscopia confocale di cellule viventi. Abbiamo anche ultrastrutturalmente di analizzare l'effetto della loro espressione sulla architettura di questo comparto subcellulare.

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

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Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati ​​singola molecola di monitoraggio

Quadridimensionale (4D) di imaging viene utilizzato per studiare il comportamento e le interazioni tra i due tipi di endosomi a vivere terminazioni nervose vertebrati. Movimento di queste piccole strutture è caratterizzata in tre dimensioni, permettendo conferma di eventi come endosomi fusione ed esocitosi.

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

Un metodo di microscopia luce correlativa (CLEM) viene applicato alle strutture intracellulari indotte da virus immagine tramite microscopia elettronica (EM) in cellule che sono già stati scelti da microscopia chiara (LM). LM ed EM sono combinati in un approccio di imaging ibrido per ottenere una visione integrata delle interazioni virus-ospite.

Microscopia a luce correlativa (CLEM) per il monitoraggio e la proteina virale di Imaging strutture in cellule di Cryo-immobilizzata associate

Qui vi presentiamo una guida pratica di costruzione di un sistema di microscopia integrato, che si fonde imaging epi-fluorescente convenzionale, singola molecola basata sul rilevamento di Super-risoluzione imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, tra cui trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola di imaging, in un set-up in modo efficiente.

Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

Presentiamo un protocollo per studiare la distribuzione di mitocondri e reticolo endoplasmico in intere cellule dopo la modificazione genetica utilizzando la microscopia elettronica di luce e volume correlata, tra cui l'ascorbate perossidasi 2 e la colorazione della perossidia di rafano, sezionamento seriale di cellule con e senza il gene bersaglio nella stessa sezione e imaging seriale tramite microscopia elettronica.

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia ottica ed elettronica correlativa post-embedding di Epon utilizzando una proteina fluorescente chiamata mScarlet. Questo metodo può mantenere contemporaneamente la fluorescenza e l'ultrastruttura. Questa tecnica è suscettibile di un'ampia varietà di applicazioni biologiche.

Epon Post Embedding Microscopia Ottica ed Elettronica Correlativa

Questo protocollo descrive un meccanismo per l'utilizzo della microscopia ottica ed elettronica correlativa per visualizzare l'interazione di mitocondri e lisosomi marcati rispettivamente con mEosEM e APEX2.

Microscopia correlativa a luce ed elettronica a due colori per la visualizzazione delle interazioni tra mitocondri e lisosomi

Scopri la microscopia a fluorescenza a singola molecola per visualizzare complessi molecolari funzionali in cellule batteriche vive. Questo metodo consente di rilevare, tracciare e quantificare le interazioni molecolari in tempo reale.

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

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