Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

L'obiettivo generale di questo esperimento è quantificare la dinamica dell'actina corticale mediante spettroscopia di correlazione delle immagini, dopo l'acquisizione tramite riflessione totale interna, microscopia a illuminazione strutturata o turf sim. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biofisica, ad esempio quale ruolo svolge il flusso dell'actina corticale nella regolazione delle interazioni alla sinapsi immunologica. Il principale vantaggio della tecnica è che combina una risoluzione su scala nanometrica con compatibilità con lo stato vitale, consentendo di osservare e analizzare processi su scala più piccola rispetto alle tecniche convenzionali di microscopia a singola istanza.

Dimostrerà questa tecnica George Ashdown, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per un campione di prova, aggiungere cinque microlitri di una soluzione madre di microsfere fluorescenti sottodiffrazionali con diametro di 100 nanometri sulla superficie di un'oggettino nuovo non rivestito. Quindi distribuire la soluzione di microsfere sull'oggettino con la punta di una pipetta e lasciarla asciugare.

Aggiungere 200 microlitri di mezzo di montaggio sul vetrino da test per prepararsi all'acquisizione delle immagini; accendere l'incubatore per il riscaldatore del palco del sistema turf SIM e riempire il serbatoio con acqua distillata in modo da coprire completamente la base dell'elemento riscaldante. Lasciare che l'acqua raggiunga l'equilibrio a 37 gradi Celsius. Collegare il collare riscaldante all'obiettivo e impostarlo a 37 gradi Celsius.

Quindi fissare il blocco graduato compatibile con turf 4 88 nel percorso ottico del microscopio per assicurare che sia attivato il corretto percorso ottico. Impostare la modalità del canale sul letto laser sulla posizione singola. Ripetere questa operazione per il cavo in fibra sulla piastra del microscopio.

Si prevede che appaia un errore nella finestra del software se questi passaggi non vengono eseguiti. Dopo aver impostato la modalità, abbassare l'obiettivo al piano Z più basso e posizionare una goccia di olio su di esso. Posizionare il vetrino del campione di prova con le microsfere fluorescenti sul portacampioni del microscopio.

Quindi selezionare il sistema di fuoco perfetto o la funzione PFS sul corpo del microscopio. Spostare gradualmente l'obiettivo verso l'alto attraverso il piano Z e fermarsi quando il pulsante PFS smette di lampeggiare, indicando che il piano di fuoco è stato raggiunto nel software di controllo. Passare alla visualizzazione in tempo reale per osservare sullo schermo i microsfera.

Eseguire regolazioni fini del fuoco utilizzando la manopola micromanipolatrice PFS. Osservare un'illuminazione uniforme senza emissioni fluorescenti fuori fuoco al di sopra della lunghezza d'onda di 75 nanometri. Infine, verificare che sia stata ottenuta un'illuminazione strutturata osservando un modello di illuminazione fluttuante nel campione di microsfera fluorescente per la stimolazione delle cellule T che copre le camere di un otto.

Coprire il vetrino con 200 microlitri di miscela di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 e incubare il vetrino per due ore a 37 gradi Celsius. Dopo aver lavato il vetrino come descritto nel protocollo testuale, posizionarlo sul piano del microscopio e quindi individuare il piano focale del campo. Successivamente, pipettare delicatamente 200 microlitri di linfociti T trasfettati in una delle pozzette sul vetrino.

Utilizzare la fluorescenza episcopica per seguire le cellule trasfettate con GFP-actina mentre si depositano sul vetrino. Una volta che le cellule si sono assestate, passare alla modalità live utilizzando il N SimPad e verificare che le cellule sul monitor siano a fuoco. Per registrare un corso temporale, aprire la finestra di acquisizione ND e selezionare la scheda temporale.

Quindi fare clic su aggiungi e impostare l'intervallo su nessun ritardo. Impostare la durata su 10 minuti. Infine, avviare la registrazione dei dati selezionando Esegui ora nella finestra di acquisizione ND.

Per ricostruire le immagini, aprire innanzitutto il software di analisi contenente il modulo di analisi corretto. Fare clic su applicazioni e quindi selezionare la finestra mostra end sim. Impostare il contrasto di modulazione dell'illuminazione e la soppressione del rumore ad alta risoluzione su uno e ricostruire il set di dati turf SIM per produrre un'immagine SIM completa dalla barra di stato dell'immagine.

Verificare che la dimensione del pixel sia di 30 nanometri, quindi esportare i dati come file TIF per l'analisi dei bastoncelli. Dopo aver scaricato ed estratto il pacchetto software MATLAB sticks, aprire lo script. Quindi definire i parametri di ingresso come indicato nel protocollo testuale per il filtro di rimozione degli immobili.

Nella riga 23, impostare il parametro di filtraggio su media mobile e nella riga 24 utilizzare 21 come parametro della media mobile per generare una mappa vettoriale. Impostare la sottoregione temporale nella riga 31 al numero massimo di fotogrammi, in questo caso 63. Successivamente, nella riga 32, impostare lo spostamento temporale a uno nelle righe da 33 a 35.

Inserire i nomi dei file di output, i titoli delle mappe vettoriali di output e il percorso della directory di output. Quindi definire il formato in cui salvare le immagini delle mappe vettoriali. In questo caso, png.

Nella finestra dell'editor MATLAB, aprire lo script. Eseguire lo script per un canale e caricare la serie di immagini eseguendo le righe da 1 a 23 dello script. Successivamente, eseguire le righe da 29 a 35 dello script per un canale.

Per iniziare l'analisi dei tracciati, seguire il messaggio e selezionare un poligono per definire una regione di interesse o ROI, se desiderato. Per visualizzare le mappe vettoriali, eseguire le righe da 38 a 52. Successivamente, eseguire le righe da 53 a 72 per tracciare l'istogramma della magnitudine della velocità mostrato qui, relativo a una cellula T OT che esprime GFP etichettata per l'actina F, immaginata con il protocollo turf sim.

Discusso nel testo cinque minuti dopo che questa cellula è stata introdotta su un vetrino ricoperto con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28, finalizzati a stimolare la formazione delle sinapsi immunologiche. È stata effettuata una serie temporale al fine di visualizzare il flusso molecolare dell'actina F. L'analisi successiva di questi dati mediante il programma STICKS ha permesso la quantificazione del flusso molecolare dell'actina F, come rappresentato dalla mappa vettoriale corrispondente alla regione delimitata dal riquadro nella cellula a sinistra, che rappresenta una porzione della periferia della sinapsi.

Un'ulteriore ingrandimento di questa mappa e della sottoregione delle cellule T chiarisce la direzionalità e la velocità del flusso di actina, che può essere determinata dalla lunghezza dei vettori nonché dal codice a colori. I dati di velocità possono inoltre essere rappresentati in un istogramma, consentendo un'analisi statistica. Nel complesso, questi risultati mostrano che nella sinapsi immunologica l'actina F scorre in modo simmetrico dalla periferia verso il centro della cellula. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona idea su come acquisire dati ts e analizzare la dinamica dell'actina corticale mediante spettroscopia di correlazione d'immagine.

Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per ottenere informazioni sul flusso di actina durante la migrazione delle cellule T, può anche essere impiegato in altri sistemi in cui si ritiene che il flusso molecolare sia importante, come nello studio della migrazione cellulare.