Name: Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Scopri la quantificazione della dinamica dell'actina corticale nelle cellule T mediante spettroscopia di correlazione spazio-temporale delle immagini. Questa tecnica combina risoluzione nanometrica e imaging in cellule vive per studiare la sinapsi immunologica.

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D.M.O. riconosce la sovvenzione n. 337187 del Consiglio europeo della ricerca e la sovvenzione Marie-Curie per l'integrazione professionale n. 334303. P.W.W. riconosce il programma Discovery Grant del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada.

Nota: Tappe 1 e 2 avvengono prima del giorno delle immagini; garantire tutti i media e gli integratori da utilizzare prima o il giorno delle immagini sono equilibrate. Equilibration è ottenuta attraverso il riscaldamento dei media e integratori a 37 ° C in un incubatore impostato a 5% di CO 2. Tutte le fasi di placcatura lavoro coltura cellulare e coprioggetto avvengono in condizioni sterili sotto una cappa a flusso laminare. Trasfezione 1. cella <ol><li> Trasfezione le cellule T per essere ripreso 24 ore prima che l&#39;esperimento con un plasmide codificante una fusione fluorescente costrutto per l&#39;etichettatura GFP-F actina e di imaging. Nota: Le cellule devono essere suddivisi 24 ore prima della trasfezione (48 ore prima di imaging) per assicurare cellule sono in salute ottimale e nella loro fase di crescita logaritmica. <ol><li> Mettere 5 ml di RPMI supplemento (RPMI 1640 più il 10% FBS e 1% Pen-Strep (opzionale)) in un unico pozzo di un 6-pozzetti nell&#39;incubatore per equilibrare. </li><li> Pellet 2 x 10 7 cellule T cultorato a 37 ° C + 5% di CO 2 in RPMI integratore utilizzando un tubo centrifugare a 327 xg per 5 minuti e lavare in un volume uguale di supporti elettroporazione pre-riscaldato. Nota: elettroporazione media è un mezzo di siero ridotto contenente tamponi e supplementi (vedi materiali di consumo). </li><li> Dopo ri-pellet a 327 xg per 5 minuti, risospendere le cellule in 500 ml di mezzi di elettroporazione e lentamente aggiungere ad una cuvetta, aggiungere 5 mg di plasmide in grado PCR dH 2 O per l&#39;etichettatura di F-actina. </li><li> Battere delicatamente la cuvetta sull&#39;area di lavoro cofano per garantire la rimozione di eventuali bolle d&#39;aria nei media, che possono causare la formazione di archi di energia elettrica e per distribuire le cellule in modo uniforme nei media. </li><li> Accendere l&#39;apparecchio elettroporazione e la tensione impostata a 300 V e la capacità a 290 Ω. Campione elettroporazione utilizzando un decadimento esponenziale per 20 msec. Nota: L&#39;ottimizzazione può essere richiesto per le cellule diverse e diversi costrutti plasmide. </li><li> Una volta che il protocollo è transfezionecompleti, celle negozio in ghiaccio per 1 min prima di continuare. </li><li> Trasferire accuratamente le cellule dalla provetta al 6 pozzetti contenenti 5 ml di equilibrata supplemento RPMI dal punto 1.1.1. </li><li> Incubare le cellule O / N a 37 ° C + 5% di CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Coprioggetto Coat e Supplemento Imaging pre-caldo <ol><li> Coprioggetto Coat con anticorpi per indurre stimolazione delle cellule T. <ol><li> Cappotto ciascuna camera di un vetrino da 8 pozzetti con 1 mg / ml αCD3 e αCD28 in 200 l di PBS. </li><li> Conservare a 4 ° CO / N. In alternativa, coprioggetto cappotto 2 ore prima di imaging e mantenere in un incubatore a 37 ° C per ridurre la dispersione durante il processo di imaging riducendo al minimo le variazioni di temperatura al vetrino. </li></ol></li><li> Creare un campione di prova vetrino con microsfere fluorescenti 0,1 micron sub-diffrazione. <ol><li> Soluzione madre vortice di perline per evitare grumi. </li><li> In una nuova, coprioggetto pulito di the stesso tipo di quelli utilizzati in fase 2.1.1, pipetta 5 ml soluzione madre microsfere fluorescenti sulla superficie (come da istruzioni del produttore). </li><li> Distribuire soluzione microsfere sopra il vetrino con la punta della pipetta. </li><li> Lasciare asciugare, quindi applicare 200 ul medio di montaggio come PBS. Nota: il mezzo di montaggio deve corrispondere a quello utilizzato per i campioni di cellule di imaging. </li></ol></li><li> Equilibrare HBSS (+ HEPES 20 mM, di seguito denominato &#39;HBSS integratore&#39;) in una provetta da centrifuga mettendo in un incubatore a caldo pre-O / N a 37 ° C + 5% CO 2. Nota: l&#39;aggiunta di HEPES è di buffer di CO 2, se si utilizza una camera di incubazione con CO 2 ingressi saltare questa integrazione. </li></ol> 3. Microscopio Set-up <ol><li> Accendere incubatore fase-top del microscopio e posto acqua distillata sufficiente TIRF-SIM nel serbatoio del microscopio a coprire completamente la base dell&#39;elemento riscaldante. Permettere all&#39;acqua di all&#39;equilibrate a 37 ° C. Aggiungere il collare di riscaldamento per la lente dell&#39;obiettivo, anche impostato a 37 ° C. Nota: A causa della sensibilità del set-up, questi passaggi sono fatto la notte prima quindi i componenti ottici sono ad una temperatura stabile prima di imaging. </li><li> Posizionare il TIRF 488 blocco reticolo compatibile nel percorso della luce del microscopio e fissarlo in posizione. <ol><li> Cambiare la modalità di canale e il cavo in fibra nella posizione &#39;Single&#39; sul palco base del laser e microscopio, rispettivamente, di coinvolgere il percorso ottico corretto per la modalità TIRF-SIM. Nota: Saltare questo passaggio porterà ad un errore (Figura 1A) all&#39;interno della finestra del software. </li></ol></li><li> Accendere tutti i componenti del microscopio e computer e aprire il software di controllo di acquisizione. <ol><li> Aprire il pannello OC, Ti Pad, N-SIM Pad e ND Acquisition finestre (Figura 1B). Nel &#39;Pannello OC&#39; selezionare l&#39;opzione &#39;TIRF 488&#39; (Figura 2B, freccia gialla). </li&gt; <li> Nella finestra N-SIM Pad, selezionare il &#39;TIRF-SIM&#39; e impostazioni &#39;Moving&#39; (Figura 2C, frecce gialle). Selezionare il pulsante Impostazioni (Figura 1C, scatola gialla) e selezionare &#39;TIRF 488 (per 100x TIRF 488 nm)&#39; dal menu a discesa, ha colpito &#39;Apply&#39; e &#39;OK&#39;. </li><li> Impostare le impostazioni della fotocamera in &#39;Impostazioni DU897&#39; a: Frame Rate 50 msec, modalità di lettura, EM guadagno 3 MHz a 14 bit, e EM guadagno moltiplicatore 300 con un guadagno di conversione di 1 (figura 1C, scatola verde). Nota: vedi Rappresentante dei risultati in base a considerazioni di frame rate. </li><li> Calibrare illuminazione del microscopio per TIRF-SIM selezionando l&#39;obiettivo 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF, sulla &#39;N-SIM Pad&#39; accendere la potenza del laser 488 nm a 10%. Nota: le dimensioni dei pixel delle immagini prime è di 60 nm, con un campo di 512 x 512 pixel di vista. </li><li> Pulire la lente dell&#39;obiettivo con panno per lenti per rimuovere la polvere e l&#39;olio. </li></ol></li&gt; <li> Trovare il piano focale TIRF-SIM. <ol><li> Iniziare con l&#39;obiettivo nell&#39;eventuale piano z più basso. Mettere una goccia di olio lente sull&#39;obiettivo e aggiungere il campione microsfere fluorescenti dal punto 2.2 al palco microscopio. </li><li> Selezionare la funzione perfetta Focus System (PFS) situata sul corpo del microscopio. </li><li> Spostare lentamente l&#39;obiettivo attraverso il piano z finché il pulsante PFS smette di lampeggiare per confermare il piano focale è stato raggiunto. </li><li> Passare alla visualizzazione &#39;Live&#39; sul software di controllo e l&#39;immagine le microsfere di regolazioni finali effettuate utilizzando la rotella micromanipolatore PFS. </li></ol></li><li> Osservare l&#39;illuminazione uniforme senza emissione out-of-focus fluorescenza sopra l&#39;onda evanescente 75 nm. Nota: Conferma illuminazione strutturato si realizza osservando un pattern di illuminazione fluttuante dal campione microsfere fluorescenti. </li><li> Misurare campione microsfere fluorescenti e quantificare il miglioramento resolut immaginiion osservando la larghezza a metà massimo (FWHM) del profilo di intensità. <ol><li> Aprire il software Analyze (v4.20.01), con il modulo di NIS-N-SIM Analisi installato e selezionare &quot;Applicazioni&quot; -&gt; &#39;Mostra finestra N-SIM&#39;. </li><li> Con il contrasto di modulazione illuminazione (IMC) e la soppressione del rumore ad alta risoluzione (HRNS) impostato a 1 per dataset TIRF-SIM (Figura 2), ricostruire l&#39;immagine del campione microsfere di generare una immagine ricostruita di 1.024 x 1.024 pixel con una dimensione dei pixel di 30 nm. </li><li> Con lo strumento linea di profilo con una larghezza di 1 pixel (Figura 3A, scatola gialla), tracciare una linea attraverso il centro di un unico microsfere. </li><li> Selezionare il pulsante FWHM (figura 3B, scatola gialla) e fare clic in corrispondenza del massimo di intensità della distribuzione gaussiana, seguito dalla sua intensità minimi. </li><li> Conferma la FWHM della microsfera è nell&#39;intervallo di 100 nm (Figura 3C). Nota: la risoluzione achquando di imaging campioni biologici ieved variano a seconda del rapporto segnale-rumore di efficienza di etichettatura e fluorescenza di fondo. </li></ol></li></ol> 4. Preparazione del campione per l&#39;imaging <ol><li> Preparazione Coverslip. <ol><li> Recupera coprioggetto αCD rivestite dal punto 2.1 da frigo o in un incubatore e rimuovere PBS contenente αCD3 e αCD28 da ogni pozzetto. </li><li> Aggiungere 200 ml di pre-riscaldato supplemento HBSS dal punto 2.3 a ciascun pozzetto del vetrino. Lavare e togliere per garantire il minimo αCD3 e αCD28 viene lasciato in soluzione. Aggiungere altri 200 ml di supplemento HBSS ai pozzetti coprioggetto. </li><li> Pulire la parte inferiore del vetrino con il tessuto dell&#39;obiettivo per rimuovere l&#39;olio e particolato. </li></ol></li><li> Posizione vetrino sul palco microscopio e trovare il piano focale TIRF del vetrino utilizzando il piano z PFS come si trova al punto 3.4. </li><li> Preparazione cellulare. <ol><li> Dispensare 200 microlitri della con supporticontenenti cellule trasfettate dal punto 1.1.8 in un tubo di micro-centrifuga. </li><li> Cellule pellet in un micro-centrifugare a 268 xg per 20 secondi e rimuovere i supporti cellulari. </li><li> Risospendere le cellule in 200 ml preriscaldata HBSS supplemento dal punto 2.3. </li></ol></li></ol> 5. Le cellule Imaging <ol><li> Prendere cella contenente HBSS supplemento al microscopio e delicatamente pipetta 200 microlitri in uno dei pozzi. </li><li> Pur rimanendo nel piano focale TIRF al vetrino (in modalità PFS), utilizzare l&#39;oculare microscopio e illuminazione epifluorescenza per monitorare le cellule fluorescenti avvicina il vetrino. </li><li> Una volta che le cellule atterrano sul vetrino, passare alla modalità &#39;Live&#39; nel N-SIM Pad per portare l&#39;immagine sul monitor e controllare le celle sono a fuoco sullo schermo del computer. </li><li> Per registrare il tempo-corsi, aprire la finestra ND Acquisizione e selezionare la scheda &#39;Time&#39;, fare clic su &#39;Aggiungi&#39; e impostare &#39;Intervallo&#39; a Nessun ritardo, &#39;Durata&#39;a 10 minuti, &#39;Loop&#39; è impostato a 1. Nota: durata può essere cambiato a seconda del processo di interesse; il software STICS può estrarre risultati quantitativi, con pile di immagini di ≈10 fotogrammi quando catturato con &#39;Nessun ritardo&#39;. </li><li> Con le impostazioni di acquisizione identici al campione tallone, avviare la registrazione dati selezionando &#39;Esegui ora&#39; nella finestra di acquisizione ND. </li></ol> 6. Ricostruire SIM Immagini <ol><li> Dopo l&#39;imaging, aprire il software Analyze (v4.20.01), con il modulo di NIS-N-SIM Analisi installato e selezionare &quot;Applicazioni&quot; -&gt; &#39;Mostra finestra N-SIM&#39;. </li><li> Con il contrasto di modulazione illuminazione (IMC) e la soppressione del rumore ad alta risoluzione (HRNS) impostato a 1 per dataset TIRF-SIM (figura 2), ricostruire uno (o più utilizzando lo strumento di batch) File SIM prima per produrre una immagine ricostruita SIM. </li><li> Confermare il file ricostruita ha una dimensione dei pixel di 30 nm, indicato nellaimmagine barra di stato. Nota: Dimensione pixel non influisce analisi STICS ma dovrebbe essere almeno 2 più piccolo nella dimensione della risoluzione spaziale PSF per garantire la correlazione spaziale tra pixel. </li><li> Esportare i dati come file TIFF, pronti per l&#39;analisi STICS. </li></ol> 7. STICS Analisi <ol><li> Scaricare ed estrarre il STIC (C) S pacchetto Matlab software (Wiseman laboratorio, disponibili come informazioni supplementari). Il stics_vectormapping.m script è il cuore di una singola analisi STICS canale e le prime 30 righe di codice vengono utilizzati per definire i parametri di input, come definito nella sezione 2.1 del manuale. Aprire questo script e definire i parametri di input per TIRF-SIM analisi dei dati. Si suggerisce di aggiungere anche la cartella STIC (C) S con sottocartelle alla macchina percorso Matlab locale, come descritto nell&#39;appendice del manuale. <ol><li> Definire i parametri di input per l&#39;analisi dei dati modificando le linee corrispondenti del codice </li><li> Per eseguire analisi dei dati TIRF-SIM per generare 1 mappa vettoriale, impostare i parametri temporali per sottoregione temporale in linea 31 per il numero massimo di fotogrammi e lo spostamento temporale in linea 32 a 1. Per ottenere una serie temporale di mappe vettoriali variare questi parametri . </li><li> Per il filtro di rimozione Immobile, impostare il parametro &#39;filtraggio&#39; (linea 23) per &#39;Moving media&#39; e impostare il parametro &#39;MoveAverage&#39; (linea 24) a 21. Nota: Questa impostazione ha dimostrato di funzionare per movimento lento e grandi segnali di fluorescenza, in quanto si basa su sottraendo trame seriali dal telaio analizzato. </li><li> Modificare le linee 33-38 per impostare il nome del file di output e titoli delle mappe vettoriali in uscita, così come il percorso della directory di output e definire in quale formato devono essere salvate le immagini di mappe vettoriali. </li></ol></li></ol><table><tbody><tr><td> Dimensione del pixel (micron) </td><td> 0.03 micron </td><td> Linea 19 </td></tr><tr><td> Frame rate (sec) </td><td> 1 secondo </td><td> Linea 20 </td></tr><tr><td> Tempo massimo di ritardo (frames) </td><td> 20 fotogrammi </td><td> Linea 21 </td></tr><tr><td> Dimensioni subregione (pixel) </td><td> 8 pixel </td><td> Linea 29 </td></tr><tr><td> Spaziatura subregione (pixel) </td><td> 1 pixel </td><td> Linea 30 </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Aprire le run1ChannelSTICS di script nella finestra Matlab Editor. Caricare la serie di immagini eseguendo linee 1-23 di questo script. Nota: Questo script può essere utilizzato per caricare e pre-processo serie di immagini, tracciare le mappe vettoriali e istogrammi di velocità ed eseguire una elaborazione batch per molti file. Se necessario, ritagliare l&#39;immagine di una regione di interesse utilizzando la linea 24-26 di questo script. <ol><li> Linee Run 29-35 di run1ChannelSTICS per iniziare l&#39;analisi STICS. Quando richiesto, selezionare un poligono per indicare una specifica regione di interesse (ROI), se lo si desidera. Assicurarsi che il ROI non si sovrapponga con il bordo delle cellule, come si verificano artefatti contorno quando STICS analizza questi reregioni. </li><li> Linee Run 38-52 per visualizzare le mappe di vettore. Per tracciare l&#39;istogramma velocità di grandezza, le linee 53-72 eseguire. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questa tecnica permetterà ai ricercatori di immagine e quantificare precedentemente dettagli irrisolvibili in cellule che esprimono fluorescenza. Nei nostri risultati ci mostrano che F-actina scorre in modo simmetrico dalla periferia verso il centro cella di cella nella cella di T IS. Questi risultati sono in linea con le precedenti risultati di linea 1D dati del profilo chimografo 13 ed estendere la capacità di analisi dei dati super-risoluzione 2D e. La tecnica presentata è una ...

L&#39;obiettivo di questo esperimento è all&#39;immagine e caratterizzare il flusso molecolare di filamentous- (F-) actina in cellule viventi T, oltre il limite di diffrazione per stabilire la direzione del flusso e della portata durante sinapsi immunologica (IS) formazione. Questa tecnica sarà effettuata utilizzando un microscopio illuminazione strutturata (SIM) in modalità riflessione totale fluorescenza interna (TIRF), l&#39;imaging Jurkat cellule T costituiscono sinapsi artificiale sull&#39;attivazione vetrini rivestiti di anti-CD3- ed anticorpi anti-CD28. Le forme si trova tra una cellula T e il suo obiettivo; una cellula che presenta l&#39;antigene (APC) sul recettore delle cellule T (TCR) di attivazione 1,2. Poiché questo è il primo passo per determinare se il sistema immunitario adattativo genera una risposta immunitaria ad una infezione, le conseguenze di risposta agli stimoli non corretto può causare una serie di malattie. L&#39;importanza dell&#39;interazione cellule T-APC è ben documentata, tuttavia, il ruolo (s) del maturo è dopo TCR si inizialeinternalizzazione de segnal devono ancora essere pienamente compreso. Poiché il citoscheletro è pensato per aiutare due processi legati all&#39;attivazione TCR (il movimento delle molecole sulla membrana plasmatica ed il controllo di molecole di segnalazione dipendenti dal citoscheletro actina 3,4), comprendere come il citoscheletro riorganizza spazialmente e temporalmente delucideranno gradini di riorganizzazione molecolare durante la formazione delle sinapsi. Il flusso retrogrado di F-actina è pensato per corral cluster TCR verso il centro della sinapsi immunologica, questa traslocazione si crede di essere di vitale importanza per la cessazione del segnale e il riciclaggio; favorendo il delicato equilibrio di attivazione delle cellule T 5. Mentre un microscopio a fluorescenza è uno strumento flessibile che continua a fornire indicazioni su molti eventi biologici comprese le interazioni cellula-cellula, è limitata dalla capacità del sistema di risolvere con precisione più fluorofori che risiedono vicino di quanto il diffrLimite di azione (≈200 nm) l&#39;uno dall&#39;altro. Come molti eventi molecolari all&#39;interno delle cellule coinvolgono popolazioni dense di molecole e mostrano riassetto dinamico sia in quiescenza o in seguito a stimolazione specifica, microscopia ottica convenzionale non fornisce il quadro completo. L&#39;uso di super risoluzione delle immagini ha permesso ai ricercatori di aggirare il limite di diffrazione usando una varietà di tecniche. Microscopia localizzazione molecola singola (SMLM) come Palm e STORM 6,7 ha la capacità di risolvere la posizione di molecole fino a una precisione di circa 20 nm, tuttavia, queste tecniche contare su lunghi tempi di acquisizione, costruire un&#39;immagine di numerose cornici . In genere questo richiede campioni da fisso o per le strutture di esporre scarsa mobilità in modo singole fluorofori non sono male interpretato come più punti. Mentre esaurimento emissione stimolata (STED) di imaging consente super-risoluzione attraverso molto selettivo confocale eccitazione 8, la scansione richiestaapproccio può essere lento su campi di cellule intere di vista. STED dimostra anche fototossicità significativo per risoluzioni più elevate a causa dell&#39;aumento della potenza del fascio esaurimento. Structured microscopia illuminazione (SIM 9) fornisce un&#39;alternativa a questi metodi, in grado di raddoppiare la risoluzione di un microscopio a fluorescenza standard ed è più compatibile con cellule vive rispetto alle tecniche attuali SMLM. Esso utilizza potenze laser inferiori, in un sistema a grande campo per i campi di cellule intere di vista; fornire una maggiore velocità di acquisizione, ed è compatibile con l&#39;etichettatura fluoroforo standard. La natura a grande campo di SIM permette anche l&#39;utilizzo di totale fluorescenza riflessione interna (TIRF) per l&#39;eccitazione altamente selettiva, con profondità di penetrazione nella dimensione assiale di &lt;100 nm. Spettroscopia di correlazione immagine (ICS) è un metodo di correlare fluttuazioni di intensità di fluorescenza. Un&#39;evoluzione di ICS; Im spazio-temporalespettroscopia di correlazione età (STIC 10) correla segnali fluorescenti intracellulari nel tempo e nello spazio. Correlando intensità dei pixel con pixel circostanti in cornici in ritardo di sviluppo tramite una funzione di correlazione, le informazioni si ottiene quanto concerne la velocità di flusso e direzionalità. Per assicurare oggetti statici non interferiscono con l&#39;analisi STICS, un filtro oggetto immobile viene implementato, che funziona sottraendo una media mobile delle intensità dei pixel. La tecnica qui presentata si crede di essere la prima dimostrazione della spettroscopia di correlazione immagine che viene applicata ai dati microscopia super-risoluzione per quantificare il flusso molecolare in cellule vive 11. Questo metodo migliora sull&#39;imaging diffrazione limitata di flusso F-actina tramite STICS analisi 12 e sarebbe adatto ricercatori che desiderano per determinare il flusso molecolare bidimensionale in cellule vive, dai dati acquisiti a risoluzioni spaziali oltre il limite di diffrazione della luce.

<table><tbody><tr><td>Materiali di consumo:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jurkat E6.1 celle</td><td>APCC</td><td>ATTC TIB-152</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Strepromicina&nbsp;</td><td>Tecnologie di vita</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td> Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Vetrini coprioggetti Labtek a 8 pozzetti</td><td>NUNC, Labtek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>LifeAct GFP construct</td><td>Ibidi</td><td>60101</td><td></td></tr><tr><td>OptiMem</td><td>Life Technologies</td><td>51985-042</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD28</td><td>BD Bioscience / Insight Biotechnology</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>Olio</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>per lentiName</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Attrezzatura:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulsar Xcell System</td><td>BioRad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta (0,4 cm)</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga (5810R)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5805 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga (Heraeus)</td><td>Biofuga pico</td><td>75003235</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore da palco</td><td>Tokai Hit</td><td>INUH-TIZSH</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Microscopio N-SIM Nikon</td><td>Contatta l'azienda</td><td></td><td>Nikon</td></tr><tr><td>Software di analisi</td><td>Nikon</td><td>Contatta l'azienda</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore ( 190D)</td><td>LEEC</td><td>Contatta l'azienda</td><td></td></tr></tbody></table>

corticale actina di flusso in cellule t quantificati da spazio-temporale correlazione immagine spettroscopia di structured illuminazione microscopia dati

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentosa-actina gioca un ruolo cruciale nella maggioranza dei processi cellulari tra cui motilità e, in cellule immunitarie, la formazione di una interazione cellula-cellula chiave noto come sinapsi immunologica. F-actina è anche ipotizzato a svolgere un ruolo nella regolazione distribuzioni molecolari alla membrana delle cellule tra cui dinamiche vescicole sub-membranoso e proteine ​​clustering. Mentre le tecniche microscopio ottico standard, consentono osservazioni generalizzate e diffrazione limitata da apportare, molti eventi cellulari e molecolari, tra cui il clustering e il flusso molecolare si verificano in popolazioni a lunghezza scale molto al di sotto del potere risolutivo di microscopia ottica standard. Combinando riflessione interna totale fluorescenza con la super Resolution Imaging metodo strutturato illuminazione microscopia, il flusso molecolare bidimensionale di F-actina alla sinapsi immune delle cellule T è stato registrato. Spettroscopia spazio-temporale dell&#39;immagine correlazione (STIC) è stato poi applicato, che genera Resul quantificabilits in forma di istogrammi di velocità e mappe vettoriali rappresentanti direzionalità del flusso e la grandezza. Questo protocollo descrive la combinazione di tecniche di imaging e racchette super-risoluzione per generare vettori di flusso a livello sub-diffrazione di dettaglio. Questa tecnica è stata utilizzata per confermare un flusso actina che è simmetricamente retrogrado e centripeta tutta la periferia delle cellule T sulla formazione di sinapsi.

Impostazioni del microscopio Dopo aver raggiunto con successo tutte le fasi del ricercatore avrà illuminazione strutturata compiuto (SIM) di imaging del flusso F-actina in una sinapsi delle cellule T (Video 1), e quantificato questo flusso molecolare mediante spettroscopia immagine correlazione spazio-temporale (Figura 4 11). Prima di registrare immagini, garantire l&#39;illuminazione del campione è...

Per studiare le velocità di flusso e la direzionalità dell'actina filamentosa nella sinapsi immunologica delle cellule T, l'imaging a super-risoluzione su cellule vive è combinato con la fluorescenza a riflessione interna totale e quantificato con la spettroscopia di correlazione delle immagini spazio-temporali.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quantificare la dinamica dell'actina corticale mediante spettroscopia di correlazione delle immagini, dopo l'acquisizione tramite riflessione totale interna, microscopia a illuminazione strutturata o turf sim. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biofisica, ad esempio quale ruolo svolge il flusso dell'actina corticale nella regolazione delle interazioni alla sinapsi immunologica. Il principale vantaggio della tecnica è che combina una risoluzione su scala nanometrica con compatibilità con lo stato vitale, consentendo di osservare e analizzare processi su scala più piccola rispetto alle tecniche convenzionali di microscopia a singola istanza.Dimostrerà questa tecnica George Ashdown, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per un campione di prova, aggiungere cinque microlitri di una soluzione madre di microsfere fluorescenti sottodiffrazionali con diametro di 100 nanometri sulla superficie di un'oggettino nuovo non rivestito. Quindi distribuire la soluzione di microsfere sull'oggettino con la punta di una pipetta e lasciarla asciugare.Aggiungere 200 microlitri di mezzo di montaggio sul vetrino da test per prepararsi all'acquisizione delle immagini; accendere l'incubatore per il riscaldatore del palco del sistema turf SIM e riempire il serbatoio con acqua distillata in modo da coprire completamente la base dell'elemento riscaldante. Lasciare che l'acqua raggiunga l'equilibrio a 37 gradi Celsius. Collegare il collare riscaldante all'obiettivo e impostarlo a 37 gradi Celsius.Quindi fissare il blocco graduato compatibile con turf 4 88 nel percorso ottico del microscopio per assicurare che sia attivato il corretto percorso ottico. Impostare la modalità del canale sul letto laser sulla posizione singola. Ripetere questa operazione per il cavo in fibra sulla piastra del microscopio.Si prevede che appaia un errore nella finestra del software se questi passaggi non vengono eseguiti. Dopo aver impostato la modalità, abbassare l'obiettivo al piano Z più basso e posizionare una goccia di olio su di esso. Posizionare il vetrino del campione di prova con le microsfere fluorescenti sul portacampioni del microscopio.Quindi selezionare il sistema di fuoco perfetto o la funzione PFS sul corpo del microscopio. Spostare gradualmente l'obiettivo verso l'alto attraverso il piano Z e fermarsi quando il pulsante PFS smette di lampeggiare, indicando che il piano di fuoco è stato raggiunto nel software di controllo. Passare alla visualizzazione in tempo reale per osservare sullo schermo i microsfera.Eseguire regolazioni fini del fuoco utilizzando la manopola micromanipolatrice PFS. Osservare un'illuminazione uniforme senza emissioni fluorescenti fuori fuoco al di sopra della lunghezza d'onda di 75 nanometri. Infine, verificare che sia stata ottenuta un'illuminazione strutturata osservando un modello di illuminazione fluttuante nel campione di microsfera fluorescente per la stimolazione delle cellule T che copre le camere di un otto.Coprire il vetrino con 200 microlitri di miscela di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 e incubare il vetrino per due ore a 37 gradi Celsius. Dopo aver lavato il vetrino come descritto nel protocollo testuale, posizionarlo sul piano del microscopio e quindi individuare il piano focale del campo. Successivamente, pipettare delicatamente 200 microlitri di linfociti T trasfettati in una delle pozzette sul vetrino.Utilizzare la fluorescenza episcopica per seguire le cellule trasfettate con GFP-actina mentre si depositano sul vetrino. Una volta che le cellule si sono assestate, passare alla modalità live utilizzando il N SimPad e verificare che le cellule sul monitor siano a fuoco. Per registrare un corso temporale, aprire la finestra di acquisizione ND e selezionare la scheda temporale.Quindi fare clic su aggiungi e impostare l'intervallo su nessun ritardo. Impostare la durata su 10 minuti. Infine, avviare la registrazione dei dati selezionando Esegui ora nella finestra di acquisizione ND.Per ricostruire le immagini, aprire innanzitutto il software di analisi contenente il modulo di analisi corretto. Fare clic su applicazioni e quindi selezionare la finestra mostra end sim. Impostare il contrasto di modulazione dell'illuminazione e la soppressione del rumore ad alta risoluzione su uno e ricostruire il set di dati turf SIM per produrre un'immagine SIM completa dalla barra di stato dell'immagine.Verificare che la dimensione del pixel sia di 30 nanometri, quindi esportare i dati come file TIF per l'analisi dei bastoncelli. Dopo aver scaricato ed estratto il pacchetto software MATLAB sticks, aprire lo script. Quindi definire i parametri di ingresso come indicato nel protocollo testuale per il filtro di rimozione degli immobili.Nella riga 23, impostare il parametro di filtraggio su media mobile e nella riga 24 utilizzare 21 come parametro della media mobile per generare una mappa vettoriale. Impostare la sottoregione temporale nella riga 31 al numero massimo di fotogrammi, in questo caso 63. Successivamente, nella riga 32, impostare lo spostamento temporale a uno nelle righe da 33 a 35.Inserire i nomi dei file di output, i titoli delle mappe vettoriali di output e il percorso della directory di output. Quindi definire il formato in cui salvare le immagini delle mappe vettoriali. In questo caso, png.Nella finestra dell'editor MATLAB, aprire lo script. Eseguire lo script per un canale e caricare la serie di immagini eseguendo le righe da 1 a 23 dello script. Successivamente, eseguire le righe da 29 a 35 dello script per un canale.Per iniziare l'analisi dei tracciati, seguire il messaggio e selezionare un poligono per definire una regione di interesse o ROI, se desiderato. Per visualizzare le mappe vettoriali, eseguire le righe da 38 a 52. Successivamente, eseguire le righe da 53 a 72 per tracciare l'istogramma della magnitudine della velocità mostrato qui, relativo a una cellula T OT che esprime GFP etichettata per l'actina F, immaginata con il protocollo turf sim.Discusso nel testo cinque minuti dopo che questa cellula è stata introdotta su un vetrino ricoperto con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28, finalizzati a stimolare la formazione delle sinapsi immunologiche. È stata effettuata una serie temporale al fine di visualizzare il flusso molecolare dell'actina F. L'analisi successiva di questi dati mediante il programma STICKS ha permesso la quantificazione del flusso molecolare dell'actina F, come rappresentato dalla mappa vettoriale corrispondente alla regione delimitata dal riquadro nella cellula a sinistra, che rappresenta una porzione della periferia della sinapsi.Un'ulteriore ingrandimento di questa mappa e della sottoregione delle cellule T chiarisce la direzionalità e la velocità del flusso di actina, che può essere determinata dalla lunghezza dei vettori nonché dal codice a colori. I dati di velocità possono inoltre essere rappresentati in un istogramma, consentendo un'analisi statistica. Nel complesso, questi risultati mostrano che nella sinapsi immunologica l'actina F scorre in modo simmetrico dalla periferia verso il centro della cellula. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona idea su come acquisire dati ts e analizzare la dinamica dell'actina corticale mediante spettroscopia di correlazione d'immagine.Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per ottenere informazioni sul flusso di actina durante la migrazione delle cellule T, può anche essere impiegato in altri sistemi in cui si ritiene che il flusso molecolare sia importante, come nello studio della migrazione cellulare.

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Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Questo video descrive TIRF, una tecnica basata sulla microscopia a riflessione interna totale per visualizzare le dinamiche di polimerizzazione dell'actina e dei microtubuli. Il metodo consente l'imaging ad alta risoluzione delle dinamiche di accoppiamento tra actina e microtubuli in tempo reale, che è essenziale per comprendere i crosstalk cellulari.

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Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo

Questo protocollo è una guida per la visualizzazione dinamica di actina e microtubuli utilizzando un test di microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF) in vitro .

Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Scopri la quantificazione della dinamica dell'actina corticale nelle cellule T mediante spettroscopia di correlazione spazio-temporale delle immagini. Questa tecnica combina risoluzione nanometrica e imaging in cellule vive per studiare la sinapsi immunologica.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati (Video) | JoVE Journal

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

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