Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

L'obiettivo generale di questo esperimento è quantificare la dinamica dell'actina corticale mediante spettroscopia di correlazione di immagini dopo l'acquisizione mediante riflessione interna totale, imaging di illuminazione strutturata o simulazione del tappeto erboso. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biofisico, come ad esempio quale ruolo ha il flusso corticale di actina nella regolazione delle interazioni alla sinapsi immunologica. Il vantaggio principale della tecnica è che combina la risoluzione su scala nanometrica con la compatibilità con lo stile di vita, consentendo l'osservazione e l'analisi di processi su scala più piccola rispetto alle tecniche di microscopia a istanza convenzionali.

A dimostrare questa tecnica sarà George Ashdown, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per un campione di prova, aggiungere cinque microlitri di una soluzione madre di microsfere fluorescenti sub diffrazione di 100 nanometri di diametro alla superficie di un vetrino coprioggetto fresco non rivestito. Quindi stendere la soluzione di microsfere sul vetrino coprioggetto con un puntale per pipetta e lasciarla asciugare.

Aggiungere 200 microlitri di terreno di montaggio al vetrino di copertura di prova per prepararsi all'inizio dell'imaging, accendere l'incubatrice per il riscaldatore del tavolino del sistema SIM per tappeti erbosi e riempire il serbatoio con acqua distillata per coprire completamente la base dell'elemento riscaldante. Lascia che l'acqua si equilibri a 37 gradi Celsius. Collegare il collare riscaldante alla lente dell'obiettivo e impostarlo a 37 gradi Celsius.

Quindi fissare il blocco di classificazione compatibile TURF 4 88 nel percorso luminoso del microscopio per assicurarsi che sia innestato il percorso ottico corretto. Commutare la modalità del canale sul piano laser in posizione singola. Ripetere questa azione per il cavo in fibra sul tavolino del microscopio.

Se questi passaggi non vengono eseguiti, è possibile visualizzare un errore nella finestra del software. Dopo aver impostato la modalità, abbassare l'obiettivo al piano Z più basso e posizionare una goccia d'olio su di esso. Posizionare il vetrino copricampione con le microsfere fluorescenti sul tavolino del microscopio.

Quindi selezionare il sistema di messa a fuoco perfetto o la funzione PFS sul corpo del microscopio. Spostare gradualmente l'obiettivo verso l'alto attraverso il piano Z e fermarsi quando il pulsante PFS smette di lampeggiare, il che indica che il piano focale è stato raggiunto sul software di controllo. Passa alla visualizzazione live per visualizzare le microsfere sullo schermo.

Effettua regolazioni di precisione della messa a fuoco utilizzando la rotella micromanipolatrice PFS. Osservare un'illuminazione uniforme senza emissione di fluorescenza sfocata al di sopra dell'onda di profumo a 75 nanometri. Infine, confermare che l'illuminazione strutturata si ottiene osservando un modello di illuminazione fluttuante dal campione di microsfere fluorescenti per la stimolazione delle cellule T per far fronte alle camere di un otto.

Bene vetrino coprioggetti con 200 microlitri di miscela di anticorpi anti CD tre e anti CD 28 e incubare il vetrino coprioggetti per due ore a 37 gradi Celsius. Dopo aver lavato il vetrino coprioggetti come descritto nel protocollo di testo, posizionarlo sul tavolino del microscopio e quindi trovare il piano focale del tappeto erboso. Quindi, pipettare delicatamente 200 microlitri di cellule T trasfettate in uno dei pozzetti del vetrino coprioggetti.

Utilizzare l'epifluorescenza per tracciare le cellule trasfettate con actina GFP mentre atterrano sul vetrino coprioggetto. Una volta che le celle si sono stabilizzate, passare alla modalità live utilizzando l'N SimPad e verificare che le celle sul monitor siano a fuoco. Per registrare un andamento temporale, aprire la finestra di acquisizione ND e selezionare la scheda tempo.

Quindi fare clic su aggiungi e impostare l'intervallo su nessun ritardo. Imposta la durata su 10 minuti. Infine, avviare la registrazione dei dati selezionando Esegui ora nella finestra di acquisizione ND.

Per ricostruire le immagini, aprire prima il software di analisi contenente il modulo di analisi corretto. Fare clic su applicazioni e quindi selezionare la finestra mostra fine sim. Imposta l'illuminazione, la modulazione, il contrasto e la soppressione del rumore ad alta risoluzione su uno e ricostruisci il set di dati SIM del tappeto erboso per produrre un'immagine SIM completa dalla barra di stato dell'immagine.

Verificare che la dimensione dei pixel sia di 30 nanometri, quindi esportare i dati come file TIF per l'analisi dello stick. Dopo aver scaricato ed estratto il pacchetto software MATLAB delle chiavette, apri lo script. Definire quindi i parametri di input come indicato nel protocollo di testo per il filtro di rimozione immobile.

Nella riga 23, imposta il parametro di filtraggio su media mobile e nella riga 24, usa 21 come parametro di media di movimento per generare una mappa vettoriale. Impostare la sottoregione temporale nella riga 31 sul numero massimo di fotogrammi, in questo caso 63. Quindi, nella riga 32, imposta lo spostamento temporale a uno nelle righe da 33 a 35.

Immettere i nomi dei file di output, i titoli delle mappe vettoriali di output e il percorso della directory di output. Quindi definisci il formato in cui devono essere salvate le immagini della mappa vettoriale. In questo caso, png.

Nella finestra dell'editor MATLAB, apri lo script. Esegui una chiavetta di canale e carica la serie di immagini eseguendo le righe da uno a 23 dello script. Le linee di esecuzione successive da 29 a 35 dei bastoncini di un canale di esecuzione.

Per avviare l'analisi stick, seguire il prompt e selezionare un poligono per definire una regione di interesse o ROI, se lo si desidera. Per visualizzare le mappe vettoriali, eseguire le righe da 38 a 52. Quindi esegui le linee da 53 a 72 per tracciare l'istogramma dell'ampiezza della velocità, mostrato qui è una cellula T OT che esprime GFP marcata F actina, che è stata ripresa con il protocollo turf sim.

Discusso nel testo cinque minuti dopo che questa cellula è stata introdotta su un vetrino coprioggetti rivestito con anticorpi anti CD tre e anti CD 28 destinati a stimolare la formazione di sinapsi immunologiche. È stato fatto un corso temporale in modo che il flusso molecolare di f actina potesse essere visualizzato. La successiva analisi di questi dati utilizzando questo programma sticks ha permesso la quantificazione del flusso molecolare di actina F come illustrato da questa mappa vettoriale corrispondente alla regione scatolata della cellula a sinistra, che rappresenta una porzione della periferia della sinapsi.

Un ulteriore ingrandimento di questa mappa e della sottoregione delle cellule T chiarisce la direzionalità e la velocità del flusso di actina, che possono essere determinate dalla lunghezza del vettore e dal codice colore I dati sulla velocità possono anche essere tracciati in un istogramma che consente l'analisi statistica. Collettivamente, questi risultati mostrano che nella sinapsi immunologica l'actina F fluisce in modo simmetrico dalla periferia verso il centro cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come acquisire ts nei dati e analizzare la dinamica dell'actina corticale utilizzando la spettroscopia di correlazione delle immagini.

Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per ottenere informazioni sul flusso di actina durante la migrazione delle cellule T, può essere utilizzato anche in altri sistemi in cui si ritiene che il flusso molecolare sia importante, come la migrazione cellulare.