Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

Le spine dendritiche sono sporgenze di membrana dal dendrite di un neurone che ricevono input sinaptici. L'allungamento, il restringimento dell'aspetto o la scomparsa delle spine si verificano in risposta a cambiamenti nella funzione della rete neurale che derivano da specifici modelli di attività neurale. Questo fenomeno è noto come plasticità corticale per osservare i cambiamenti morfologici nelle spine dendritiche.

Negli animali vivi, una piastra ai fosfori viene applicata al cranio di un topo. Un'area del cranio viene assottigliata chirurgicamente e sono necessarie immagini a basso e alto ingrandimento. Le aree vengono quindi ri-visualizzate in punti temporali successivi.

I risultati ottenuti mostrano che la morfologia della spina dendritica può essere chiaramente visualizzata utilizzando una preparazione sottile del cranio su più punti temporali. E che la morfologia delle spine è altamente plastica, mostra cambiamenti nella struttura e anche la comparsa e la scomparsa delle spine dendritiche. Ciao, sono Emily Kelly nel laboratorio di Anaya Maka nel Dipartimento di Neurobiologia e Anatomia dell'Università di Rochester.

Oggi vi mostreremo la procedura per l'imaging cronico della corteccia della fiala di topo seguendo una pinna chiamata preparazione. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il turnover della spina dendritica. Quindi iniziamo.

Iniziare la procedura sterilizzando gli strumenti per la chirurgia asettica. Quindi sterilizzare l'area di lavoro utilizzando etanolo al 70% e coprire la superficie operativa con una medicazione pulita. Monitorare la profondità dell'anestesia in un topo anestetizzato con cocktail di fentanil testando la sua risposta a un pizzico di dito del piede il topo mostrato qui è un topo transgenico A-G-F-P-M in cui è espressa la GFP.

Nel quinto strato cellule parametalliche che proiettano i processi dendritici in strati superficiali. Per mantenere una temperatura corporea di 37,5 gradi Celsius, posizionare l'animale su una coperta riscaldante e monitorarlo con un termometro rettale collegato. Quindi applicare un unguento oftalmico sugli occhi per evitare che si secchino con le forbici.

Rimuovi i peli dalla parte posteriore della testa del topo, da dietro le orecchie agli occhi. Quindi pulire la parte superiore della testa dell'animale con un'applicazione di etanolo al 70%, seguita dallo scrub Betadine e dalla soluzione Betadine. Praticare un'incisione LCU dietro le orecchie e verso l'alto lungo il lato destro o sinistro della linea mediana, a seconda dell'emisfero che verrà visualizzato agli occhi, piegare la pelle sopra e lontano dal sito dell'intervento chirurgico.

Non rimuovere la pelle poiché verrà suturata in seguito utilizzando una pinza sottile. Tirare delicatamente la pelle verso l'alto e allontanarla dall'area di interesse. Usando una pinza pulita, raschiare delicatamente il periostio dall'area esposta del cranio.

Applicare una piccola quantità di cloruro al 10% sul cranio per asciugare completamente la membrana del periostio e assicurarsi che sia stata rimossa completamente. È importante che il cranio sia completamente asciutto. Per garantire la corretta adesione della colla, raschiare delicatamente la membrana del periostio essiccata con una lama microchirurgica.

Quindi, applicare uno strato sottile di colla acrilica Sano attorno alla finestra di imaging della piastra di testa in acciaio inossidabile e fissare la piastra al cranio. Con l'estremità di legno di un bastoncino di cotone, applicare la colla sulle cuciture interne della finestra di imaging, assicurandosi di riempire tutti gli spazi tra la piastra di imaging e la curvatura del cranio. Metti una goccia dell'acceleratore di colla nella finestra.

Quindi rimuovere rapidamente l'eccesso. Lasciare asciugare la colla una volta che la colla si è completamente asciugata. Utilizzando un trapano dentale fissato con una fresa in acciaio inossidabile da 0,7 millimetri, iniziare ad assottigliare il cranio nella finestra di imaging.

Foratura alternata con applicazione occasionale di soluzione fisiologica sterile allo 0,9%. Per evitare di generare troppo calore sul cranio. Assottiglia una finestra di quattro per quattro millimetri sul cranio usando piccoli tratti sulla superficie del cranio.

Con il trapano dentale. Metti alla prova la sottigliezza del cranio con una pinza smussata. La superficie del cranio si rientrerà leggermente con una leggera pressione.

Lo spessore ottimale del cranio per l'imaging è compreso tra 10 e 30 micron. Una volta che il cranio è assottigliato, pulisci la finestra da tutti i detriti e posiziona la soluzione salina sul cranio. Fotografare la finestra di imaging con una fotocamera digitale montata su un cannocchiale da dissezione.

La vascolarizzazione cerebrale in questa fotografia aiuterà a localizzare la posizione in cui posizionare la piastra di imaging per le successive sessioni di imaging. Trasporta l'animale al rig a due fotoni. L'animale deve rimanere sulla coperta riscaldante e la temperatura corporea deve essere monitorata continuamente durante la sessione di imaging.

Un microscopio a due fotoni con un laser mi tai. Vengono utilizzate una pompa a stato solido da 10 watt per la massima potenza e un'unità confocale Olympus Flow View modificata. Il sistema è ottimizzato per l'imaging dei tessuti profondi e i rivelatori esterni sono installati il più vicino possibile all'obiettivo per consentire il massimo rilevamento della fluorescenza dal cervello, aggiungere una goccia di soluzione salina alla finestra di imaging utilizzando uno zoom digitale basso.

Identifica un'area contenente neuroni marcati in modo brillante utilizzando una fotocamera digitale fissata al microscopio. Ips, scatta una fotografia dell'area di imaging. Ciò è necessario per tornare alla stessa posizione di imaging in un momento successivo.

Ottenere una pila a basso ingrandimento attraverso l'intera estensione visibile del cervello che mostri l'estensione della ramificazione dendritica. Questo verrà utilizzato per localizzare l'area di imaging in punti temporali successivi sia come vasi sanguigni che come dendriti. Mantenere la loro struttura in animali giovani e adulti utilizzando il software di imaging.

Aumenta di otto volte l'ingrandimento digitale, regola le coordinate XY se necessario e raccogli una pila ad alto ingrandimento, che mostrerà una morfologia dendritica dettagliata, comprese le posizioni e la struttura delle spine dendritiche. Prendi appunti dettagliati su ogni raccolta di stack, incluse le coordinate di panoramica, l'intervallo di raccolta, la dimensione del passo Z e il numero di passaggi nello stack. Queste note verranno utilizzate quando si ritorna a questo dendri o assone in un momento successivo.

Dopo l'imaging, rimuovere la piastra della testa separandola delicatamente dalla superficie del cranio. Usando il forcipe. Rimuovere eventuali residui di colla e pulire il cranio con soluzione fisiologica sterile allo 0,9%.

Sutura la pelle sopra il cranio insieme usando il filo di sutura numero sei. Pulire l'area con etanolo al 70% dopo la procedura di imaging. Metti l'animale in una gabbia pulita sotto una lampada termica finché non si sveglia ed è mobile.

Quindi riporta l'animale nella sua gabbia originale per ricreare l'immagine dell'animale in un momento successivo, da due giorni a molti mesi dopo, rimuovere i punti e riaprire la pelle sulla testa. Utilizzando metodi asettici, utilizzare l'immagine digitale del sistema vascolare cerebrale scattata durante il primo intervento chirurgico per individuare la posizione di imaging originale. Quindi rifissare la piastra di testa come prima.

Se necessario, utilizzare una lama microchirurgica per assottigliare delicatamente l'osso che potrebbe essere ricresciuto tra i punti temporali dell'imaging. Diluire con un trapano dentale, liberare la finestra di imaging dai detriti e applicare una goccia di soluzione fisiologica sterile allo 0,9%. Trasporta l'animale su un microscopio a due fotoni e individua l'area di imaging originale utilizzando l'immagine fluorescente digitale scattata durante la sessione precedente.

Avviare il programma di visualizzazione del flusso. Apri l'immagine originale a basso ingrandimento, applica un foglio trasparente sullo schermo del computer e disegna il modello dei vasi sanguigni principali utilizzando una penna trasparente. Quindi, apri l'immagine dal vivo e riallinea il sistema vascolare del sangue al motivo abbozzato sulla pellicola trasparente.

Rimuovi la trasparenza per ri-immaginare le strutture ingrandite otto volte. Aprire lo stack raccolto desiderato dalla sessione di imaging precedente. Disegna la struttura su una pellicola trasparente applicata allo schermo del computer.

Ingrandisci otto volte l'immagine dal vivo e allinea l'immagine con la trasparenza. A seconda della precisione dell'allineamento della posizione a basso ingrandimento, potrebbe essere necessario regolare leggermente anche l'angolo dell'immagine, impostare leggermente le coordinate di panoramica sui parametri di imaging del primo giorno, tra cui la dimensione del passo e il numero di immagini raccolte, la ricreazione dell'imaging di Zack può essere eseguita due volte. Il numero di volte in cui il cuoio capelluto viene aperto deve essere limitato per evitare di interrompere l'integrità del cranio, il che si tradurrà in una scarsa risoluzione dell'imaging nei topi che esprimono GFPM.

Un sottoinsieme di cellule parametalliche di quinto strato e i corrispondenti processi dendritici sono stati visualizzati utilizzando la microscopia a scansione laser a due fotoni in vivo. Questa immagine è una proiezione di una singola immagine ottenuta ogni cinque micron dal PIA fino a una profondità finale di 175 micron. La regione riquadrata è mostrata con un ingrandimento più elevato qui il giorno zero, e di nuovo il quarto giorno qui, un ingrandimento maggiore di un'immagine del ramo dendritico dal giorno zero e dal quarto giorno confrontato.

Queste immagini mostrano spine stabili indicate dalle punte di freccia bianche perse spine retrattili, che sono contrassegnate da una punta di freccia rossa e nuove spine indicate dalla punta di freccia verde. Ti abbiamo appena mostrato come eseguire l'imaging cronico a due fotoni nella corteccia visiva del topo utilizzando una preparazione sottile del cranio. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di prestare particolare attenzione durante il processo di diradamento per evitare danni al cranio e alla dura madre sottostante in quanto ciò si tradurrà in una scarsa risoluzione dell'imaging e prendere appunti dettagliati.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.