Name: Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Impara l'imaging cronico della corteccia visiva nei topi utilizzando una preparazione con teschio assottigliato. Questo metodo consente di osservare la dinamica delle spine dendritiche e la plasticità corticale nel tempo.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Career Award Burroughs Wellcome nel Scienze Biomediche (AKM), The Whitehall Research Foundation Grant (AKM), Sloan Foundation Fellowship (AKM), NIH EY019277 (AKM), e un NEI finanziato, Vision Training Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Per visualizzare i neuroni nel cervello intatto utilizzando la microscopia a due fotoni, una preparazione in cui i neuroni sono etichettati con marcatori fluorescenti viene utilizzato. Negli esperimenti qui presentati usiamo la GFP-M linea di topi transgenici che le etichette strato di 5 cellule piramidali 1. Layer 5 cellule piramidali progetto processi dendritiche in strati superficiali, permettendo la visualizzazione dei dendriti e spine dendritiche fino ad una profondità di 300 micron al di sotto del livello della pia. Un approccio alternativo è quello di cellule etichetta utilizzando marcatori virali (vedi Lowery et al. Sottoposti a Giove). </li><li> Sterilizzare l'area di lavoro utilizzando etanolo al 70% e gli strumenti in autoclave per la chirurgia asettica. Coprire le superficie con medicazione pulita. </li><li> Anestetizzare topi con un cocktail di fentanyl (fentanil 0,05 mg / kg; midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) seguita da una dose quarto di Avertin (0,0075 mg / ml) utilizzando IACUC procedure approvate. Pretrattare i topi con l'analgesico, buprenorfina (0,5 mg / kg) somministrato per via sottocutanea (SQ). Monitorare il livello del piano anestetico per reazione test di coda / tep pizzico. </li><li> Mantenere animale a 37,5 ° C con coperta termica con annesso termometro rettale. </li><li> Applicare una pomata oftalmica per gli occhi per evitare che gli occhi si secchi. Cappuccio con gli occhi piccolo foglio di carta per proteggere gli occhi dalla fonte di luce durante l'intervento. </li><li> Utilizzando le forbici, eliminare i peli dalla parte posteriore della testa (dietro le orecchie) per gli occhi. </li><li> Pulire la parte superiore della testa dell'animale con l'applicazione sequenziale del 70% di etanolo, seguito da macchia betadine e Betadine soluzione. </li><li> Fare un L-cut incisione dietro le orecchie e lungo sia il lato destro o sinistro della linea mediana (a seconda di quale emisfero sarà ripreso) per gli occhi. Piegare la pelle sopra e lontano dal sito chirurgico. Non rimuovere la pelle come la pelle sarà suturato dopo la sessione di imaging. </li><li> Utilizzando una pinza sottile estrarre delicatamente la pelle in alto e lontano dalla propria area di interesse. </li><li> Raschiare delicatamente via il periostio dalla zona esposta del cranio con una pinza pulita o lama microchirurgica. Utilizzando tampone di cotone, applicare una piccola quantità del 10% di cloruro ferrico al cranio per asciugare completamente la membrana periostio e assicurarsi che sia stato completamente rimosso. E 'importante che il teschio sia completamente asciutta per garantire la corretta adesione del collante (vedi 11). Uso di pinze o lama di microchirurgia, raschiare delicatamente via periostio membrana secca. </li><li> Applicare uno strato sottile di collante cianoacrilato attorno alla finestra di imaging della piastra in acciaio inox testa (vedi Figura 1) e apporre la targa al cranio. </li><li> Utilizzando la fine di legno di un bastoncino di cotone-tampone, applicare la colla per le cuciture all'interno della finestra di imaging, avendo cura di riempire tutti gli spazi vuoti tra la piastra di imaging e la curvatura del cranio. </li><li> Mettere una goccia di colla acceleratore nella finestra. Rapidamente togliere acceleratore colla in eccesso con un batuffolo di cotone o di kim pulire. La colla deve essere completamente solidificato prima foratura. </li><li> Inizia a fluidificare il cranio nella finestra immagine che utilizzano un trapano dentistico munito di un 0,7 millimetri in acciaio inox bava. Foratura si alternano con l'applicazione occasionale dello 0,9% soluzione salina sterile per evitare di generare troppo calore sul cranio. </li><li> Sottile una finestra 4x4 mm sul cranio con piccoli colpi su tutta la superficie del cranio con il trapano odontoiatrico. Provare la magrezza del cranio con una pinza punta smussata. La superficie del cranio trattino leggermente con una leggera pressione. Lo spessore cranio ottimale per l'imaging è compresa tra 10 e 30 micron. </li><li> Quando il cranio è sottile e la finestra pulita di tutti i detriti, luogo salina sul cranio. Fotografare la finestra di imaging con una fotocamera digitale montata su un campo di applicazione dissezione. La fotografia e l'uso del sistema vascolare cerebrale aiuterà a localizzare la posizione per posizionare il piatto di imaging per le sessioni di imaging successive. </li><li> Trasporto l'animale al 2-fotone rig. L'animale deve rimanere sulla coperta di riscaldamento (con sonda rettale) durante l'intera sessione di imaging. Nota: mentre sotto sedazione, dell'animale temperatura corporea sarà soggetto a forti fluttuazioni in assenza di una unità di riscaldamento con conseguente danno corticale o forse la morte. </li><li> Un microscopio a due fotoni con un laser Mai Tai, una pompa da 10 W a stato solido per la massima potenza e una modificata Olympus Fluoview unità confocale viene utilizzato. Il sistema è ottimizzato per l'imaging dei tessuti profondi e rilevatori esterni sono installati il ​​più vicino all'obiettivo possibile per consentire il rilevamento massimo di fluorescenza dal cervello. Un Olympus LUMPlan fl / IR lente dell'obiettivo 20X/0.95NA viene utilizzato. 0,9% soluzione salina viene utilizzato durante l'imaging per immersione obiettivo. </li><li> Utilizzando questo microscopio, e bassa zoom digitale (x1) identificano un'area contenente i neuroni vivaci etichettati. </li><li> Utilizzando una fotocamera digitale apposta sul oculare microscopio, scatta una fotografia della zona di imaging. In alternativa, delineare il modello di vasi sanguigni. Ciò è necessario per rivolta la posizione di imaging stesso tempo in un punto successivo. </li><li> Ottenere una pila a basso ingrandimento (obiettivo x20, 512x512 pixel, 5 passo micron) attraverso l'intera estensione visibile del cervello (di solito si estende ~ 200 micron) che mostra l'entità della ramificazione dendritica. Nota: questa immagine bassi ingrandimenti saranno utilizzati per individuare l'area di esposizione in momenti successivi sia come vasi sanguigni e dendriti mantengono la loro struttura in animali giovani e adulti. </li><li> Utilizzando software di imaging (Fluoview, v. 5.0, FV300), aumentare l'ingrandimento digitale di 8 volte. Regolare l'coordinate X, Y (pan coordinate), se necessario, e raccogliere una pila alta ingrandimento che mostrerà dettagliata morfologia dendritica compresi i luoghi e la struttura delle spine dendritiche. Prendere appunti dettagliate su ogni raccolta di stack, cioè pan coordinate, la gamma della collezione, il z-passo le dimensioni e il numero di passaggi nel vostro stack. Tali schede saranno utilizzate quando tornare in questo dendrite o assone in un punto temporale successivo. </li><li> A seguito di imaging, rimuovere la piastra di testa con delicatezza separando placca dalla superficie del cranio. Utilizzando pinze, rimuovere eventuali residui di colla rimanente sul cranio e pulire superficie cranio con soluzione salina sterile allo 0,9%. Sutura la pelle sopra il cranio insieme usando # 6 filo di sutura. Pulire area con etanolo al 70%. Per alleviare il dolore durante il recupero post-operatorio, somministrare 0,1 mg / kg analgesico buprenorfina, SQ. </li><li> Luogo animale in gabbia pulita sotto una lampada di calore fino a quando non si sveglia ed è mobile. Ritorna animale alla gabbia originale. </li><li> Per animali re-imaging in un punto secondo momento (i nostri punti di imaging in tempo può essere ovunque da 2 giorni a molti mesi di distanza), rimuovere punti di sutura o riaprire la pelle sulla testa utilizzando metodi asettica come sopra. Utilizzare l'immagine digitale del sistema vascolare cerebrale (preso in data primo intervento) per individuare la posizione originale delle immagini. Riapporre acciaio inox headplate (punti 10-12). Utilizzare una lama sottile delicatamente microchirurgico per via qualsiasi osso che potrebbe avere nuovamente cresciuto tra i punti di tempo di imaging. Se necessario, diluire con trapano dentistico. Finestra trasparente immagini di detriti e applicare una goccia di soluzione salina sterile allo 0,9%. </li><li> Trasportare animali a microscopio a due fotoni e individuare campo originale di imaging. Utilizza la fotografia digitali scattate durante la sessione di imaging prima assistenza. </li><li> Aprire il programma Fluoview e aprire l'immagine originale basso ingrandimento. Apporre un foglio trasparente allo schermo del computer e disegnare il principale modello di vaso sanguigno con una penna trasparenza. </li><li> Aprite l'immagine dal vivo e riallineare il sistema vascolare sanguigno al modello delineato sulla pellicola trasparente. </li><li> Per il re-imaging 8x zoom in strutture, aprire lo stack desiderato raccolti dalla sessione di imaging precedente. Disegnare la struttura (cioè assonale, dendritiche, gliali) su pellicola trasparente, apposto allo schermo del computer. </li><li> Zoom 8x dalle immagini live e impostare il pan coordinate per i primi parametri di imaging giorno. A seconda della precisione di allineare la posizione a basso ingrandimento, può essere necessario regolare anche l'angolo delle immagini leggermente. Una volta che la struttura desiderata viene trovato, all'altezza della struttura al modello delineato alto ingrandimento. Raccogliere lo z-stack con il passo identico e il numero di Z-Stack immagini per successive analisi. </li><li> Ripetere i passaggi 29 e 30 fino a quando tutte le immagini ad alto ingrandimento sono ri-raccolta. </li><li> Quando l'imaging è completa, ripetere i passaggi 22-24. Re-imaging può essere ripetuta fino a 2 punti di tempo separati. </li><li> Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal Vivarium e Divisione di Medicina degli animali da laboratorio della University of Rochester School of Medicine and Dentistry, nel pieno riconoscimento da parte dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio, International (AAALAC) e sono in conformità con legge statale, statuto federale e la politica NIH. </li></ol> Rappresentante Risultati In GFP-M topi che esprimono, un sottoinsieme di strato di 5 cellule piramidali e corrispondenti processi dendritiche possono essere facilmente visualizzati utilizzando 2-fotone microscopia a scansione laser (2PLSM) 1. Qui abbiamo dimostrato un assottigliato-teschio di preparazione in cui è assottigliato il cranio sulla posizione desiderata per l'imaging ~ 10-30 micron. Eseguita correttamente, il nostro protocollo ci ha permesso di visualizzare chiaramente dendriti corticale e spine nella corteccia visiva intatta per l'analisi acuta o cronica (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Testa su ordinazione e la piastra di base. (A) Vista dall'alto della testa fatta su misura e la piastra di base utilizzato per la preparazione diluito cranio-chirurgia. (B) Vista laterale della misura della testa e piastra di base. (C, D) schema dettagliato e l'immagine della piastra di testa. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> in vivo nella corteccia visiva di un transgenici GFP-M mouse usando la microscopia a due fotoni. L'immagine è una proiezione della singola immagine ottenuti ogni 5 micron dal pia ad una profondità finale di 175 micron. L'area in scatola in A rappresenta l'area ingrandita in (B) e (C), ripreso il giorno 0 (D0) e quattro giorni più tardi (D4). (D, E) ingrandimento superiore della filiale dendritiche scatola in B e C dimostrando spine stabile (teste di freccia bianca), persi / spine scomparsa (teste di freccia rossa) e nuove spine (teste di freccia verde). Barre di scala = A. 200 micron, B, C. 20 micron, D, E. 5 micron.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Immagini cronico usando la microscopia a due fotoni sta diventando una tecnica sempre più popolare per studiare i cambiamenti morfologici sono innescate durante 2-5 plasticità. Qui dimostrare un assottigliato-teschio preparazione da seguire identificato spine dendritiche nel cervello di topo intatto nei giorni di imaging diverse. In questo protocollo, il cranio è lasciato intatto, causando danni minimi alla corteccia e conseguente livelli molto bassi di neuroinfiammazione che possono alterare la funzione del ...

<table><tbody><tr><td>Citrato di fentanil</td><td></td><td>In sede</td><td></td><td>Cocktail di Fentanil: Cocktail anestetico;&lt;br/&gt;Dose IP: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentrazione finale del cocktail: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Cloridrato di medetomidina</td><td></td><td>In sede</td><td></td><td>Cocktail di Fentanil: Cocktail anestetico;&lt;br/&gt;Dose IP: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentrazione finale del cocktail: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Midazolam HCl</td><td></td><td>In sede</td><td></td><td>Cocktail di Fentanil: Cocktail anestetico&lt;br/&gt;Dose IP: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentrazione finale del cocktail: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;etanolo </td><td></td><td></td><td></td><td>Cocktail Avertin: Anestetico;&lt;br/&gt;Dose IP: 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentrazione finale del cocktail: 1%</td></tr><tr><td>2-metil-2-butanol (Concentrazione finale: 0,775%)</td><td></td><td></td><td></td><td>Cocktail Avertin: Anestetico;&lt;br/&gt;Dose IP: 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentrazione finale del cocktail: 0,775%</td></tr><tr><td>Sistema di Controllo della Temperatura TC-1000 per Topi</td><td></td><td>CWE, Inc.</td><td>TC-1000 Mouse</td><td>Regolazione della Temperatura Corporea</td></tr><tr><td>Toberadex</td><td></td><td>In sede</td><td></td><td>Unguento oculare</td></tr><tr><td>Cloruro ferrico al 10%</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>Preparazione a cranio sottile</td></tr><tr><td>Lama microchirurgica</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>Preparazione a cranio sottile</td></tr><tr><td>Cianoacrilato 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 46551</td><td>Preparazione a cranio sottile</td></tr><tr><td>Cianoacrilato 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 40140</td><td>Preparazione a cranio sottile</td></tr><tr><td>Zip Kicker Glue Accelerator</td><td></td><td>Pacer Technology</td><td>PT-29</td><td>Preparazione a cranio sottile</td></tr><tr><td>Micro frese in acciaio con punta di diametro 0,7 mm</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>Preparazione a cranio sottile</td></tr><tr><td>Microtorque Control Box e manipolo Tech2000</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ACCESO/SPENTO</td><td>Preparazione a cranio sottile</td></tr><tr><td>#6-0 (0,7 metrico) sutura in seta</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>Taper C-1</td></tr><tr><td>Pinzette per medicazione oculare, 10 cm, larghezza della punta 0,5 mm, curve</td><td>Strumenti chirurgici</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Extra Fine Bonn, 8,5 cm, punta dritta, lama di taglio da 13 mm</td><td>Strumenti chirurgici</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette standard a punta dritta, 2,5 mm x 1,35 mm, 12 cm</td><td>Strumenti chirurgici</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cronica di mouse corteccia visiva utilizzando un assottigliato-teschio di preparazione

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Imaging in vivo con due fotoni microscopia a scansione laser (2PLSM) permette lo studio delle cellule viventi e dei processi neuronali nel cervello intatto. La tecnica qui presentata permette l&#39;imaging della stessa area del cervello, in momenti diversi (cronica imaging) con risoluzione microscopica che permette il tracciamento delle spine dendritiche, che sono le strutture di piccole dimensioni che rappresentano la maggioranza dei siti post-sinaptici eccitatori nel SNC. La capacità di risolvere in modo chiaro multa strutture corticali sui punti più volte ha molti vantaggi, in particolare nello studio della plasticità del cervello in cui i cambiamenti morfologici a sinapsi e rimodellamento del circuito può contribuire a spiegare i meccanismi sottostanti. In questo materiale video e complementari, mostriamo un protocollo per la cronica imaging in vivo del cervello intatto con un assottigliato-teschio di preparazione. Il diradamento-cranio preparazione è un approccio mini-invasivo che evita potenziali danni per la durata e / o corteccia, riducendo così l&#39;insorgenza di una risposta infiammatoria. Quando questo protocollo è eseguita correttamente, è possibile monitorare in modo chiaro i cambiamenti nelle caratteristiche spine dendritiche nel cervello intatto per un periodo prolungato di tempo.

In questo materiale video e supplementare, mostriamo un protocollo per la cronica<em&gt; In vivo</emL&#39;imaging&gt; del cervello intatto con un assottigliato-teschio di preparazione.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

L'imaging in vivo mediante microscopia laser a scansione a due fotoni (2PLSM) consente lo studio di cellule vive e processi neuronali nel cervello intatto. Il ...

Le spine dendritiche sono protrusioni della membrana del dendrite di un neurone che ricevono input sinaptici. L'allungamento, la riduzione, la comparsa o la scomparsa delle spine si verificano in risposta a cambiamenti nella funzione della rete neurale causati da specifici schemi di attività neurale. Questo fenomeno è noto come plasticità corticale per osservare i cambiamenti morfologici nelle spine dendritiche.In animali vivi, una piastra per imaging viene fissata al cranio di un topo. Un'area del cranio viene assottigliata chirurgicamente e vengono acquisite immagini a bassa e alta ingrandimento. Le stesse aree vengono quindi reimagingate in successivi punti temporali.I risultati ottenuti mostrano che la morfologia delle spine dendritiche può essere chiaramente visualizzata mediante una preparazione a cranio sottile in diversi punti temporali. Inoltre, la morfologia delle spine è altamente plastica, mostrando cambiamenti strutturali e anche la comparsa e la scomparsa di spine dendritiche. Ciao, sono Emily Kelly nel laboratorio di Anaya Maka del Dipartimento di Neurobiologia e Anatomia dell'Università di Rochester.Oggi vi mostreremo la procedura per l'imaging cronico della corteccia vial del topo, successiva a una preparazione chiamata finestra. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il ricambio delle spine dendritiche. Cominciamo dunque.Iniziare la procedura sterilizzando gli strumenti per un intervento chirurgico asettico. Successivamente, sterilizzare l'area di lavoro utilizzando etanolo al 70% e coprire la superficie operatoria con un campo sterile. Monitorare la profondità dell'anestesia in un topo anestetizzato con un cocktail di fentanil verificando la risposta a una leggera pressione sul dito del piede; il topo mostrato qui è un topo transgenico A-G-F-P-M in cui viene espressa la GFP.Nelle cellule parametali dello strato cinque che proiettano processi dendritici negli strati superficiali. Per mantenere una temperatura corporea di 37,5 gradi Celsius, posizionare l'animale su una coperta riscaldante e monitorarlo con un termometro rettale collegato. Quindi applicare un unguento oftalmico agli occhi per evitarne l'essiccamento, utilizzando delle forbici.Rimuovere i peli dalla parte posteriore della testa del topo, dalla zona dietro le orecchie fino agli occhi. Quindi pulire la sommità della testa dell'animale applicando prima il 70%ethanol, seguito da un'accurata detersione con Betadine e soluzione di Betadine. Eseguire un'incisione LCU dietro le orecchie e lungo il lato destro o sinistro della linea mediana, a seconda dell'emisfero da sottoporre a imaging fino agli occhi, quindi ripiegare la pelle lontano dal sito chirurgico.Non rimuovere la cute poiché verrà suturata in seguito utilizzando pinzette fini. Sollevare delicatamente la cute verso l'alto e lontano dall'area di interesse. Utilizzando pinzette pulite, raschiare delicatamente il periostio dalla zona esposta del cranio.Applicare una piccola quantità di cloruro ferrico al 10% sul cranio per asciugare completamente la membrana periostea ed assicurarsi che sia stata rimossa interamente. È importante che il cranio sia completamente asciutto. Per garantire un'adeguata adesione della colla, rimuovere delicatamente con una lama microchirurgica il periostio essiccato.Successivamente, applicare uno strato sottile di colla acrilica Sano attorno alla finestra di imaging della piastra cranica in acciaio inossidabile e fissare la piastra al cranio. Con l'estremità di legno di un bastoncino di ovatta, applicare la colla lungo le giunzioni interne della finestra di imaging, assicurandosi di riempire tutti gli spazi tra la piastra di imaging e la curvatura del cranio. Aggiungere una goccia di acceleratore di colla all'interno della finestra.Quindi rimuovere rapidamente l'eccesso. Lasciare asciugare la colla finché non sarà completamente secca. Utilizzando un trapano dentale dotato di una fresa in acciaio inossidabile da 0,7 millimetri, iniziare ad assottigliare il cranio nella finestra di imaging.Alternare la perforazione con applicazioni occasionali di soluzione salina sterile allo 0,9% per evitare di generare troppo calore sul cranio. Assottigliare una finestra di quattro per quattro millimetri sul cranio utilizzando piccoli movimenti sulla superficie cranica.Con il trapano dentale. Verificare lo spessore del cranio utilizzando pinze con estremità smussata. La superficie cranica si ammorbidirà leggermente applicando una pressione delicata.Lo spessore ottimale del cranio per l'acquisizione di immagini è compreso tra 10 e 30 micron. Una volta assottigliato il cranio, pulire la finestra da tutti i detriti e applicare soluzione salina sul cranio. Fotografare la finestra di acquisizione con una fotocamera digitale montata su un microscopio stereoscopico.La vascolarizzazione cerebrale in questa fotografia aiuterà a individuare la posizione in cui posizionare la piastra di imaging per le successive sessioni di acquisizione. Trasportare l'animale al microscopio a due fotoni. L'animale deve rimanere sulla coperta riscaldata e la temperatura corporea deve essere monitorata continuamente durante tutta la sessione di imaging.Un microscopio a due fotoni con un laser mi tai. Si utilizza una pompa allo stato solido da 10 watt per una potenza massima e un'unità confocale Olympus Flow View modificata. Il sistema è ottimizzato per l'imaging di tessuti profondi e i rivelatori esterni sono installati il più vicino possibile all'obiettivo per consentire una massima rilevazione della fluorescenza proveniente dal cervello; aggiungere una goccia di soluzione salina sulla finestra di imaging utilizzando uno zoom digitale basso.Individuare un'area contenente neuroni intensamente marcati utilizzando una fotocamera digitale fissata al microscopio. Successivamente, scattare una fotografia dell'area di imaging. Questo passaggio è necessario per tornare alla stessa posizione di imaging in un momento successivo.Acquisire uno stack a basso ingrandimento attraverso tutta l'estensione visibile del cervello, mostrando l'estensione della ramificazione dendritica. Questo sarà utilizzato per localizzare l'area di imaging in successivi punti temporali, sia per i vasi sanguigni che per i dendriti. Mantenere la loro struttura in animali giovani e adulti mediante l'uso di software di imaging.Aumentare l'ingrandimento digitale di otto volte, regolare le coordinate XY se necessario e acquisire uno stack ad alto ingrandimento, che mostrerà la morfologia dendritica dettagliata, inclusa la localizzazione e la struttura delle spine dendritiche. Prendere appunti dettagliati per ogni acquisizione dello stack, indicando le coordinate del campo, l'intervallo di acquisizione, l'incremento Z e il numero di passi nello stack. Questi appunti verranno utilizzati quando si tornerà a esaminare questo dendrite o assone in un momento successivo.Dopo l'acquisizione delle immagini, rimuovere la piastra cranica staccandola delicatamente dalla superficie del cranio. Utilizzando pinzette, rimuovere eventuali residui di colla e pulire il cranio con soluzione fisiologica sterile allo 0,9%.Chiudere la pelle sopra il cranio utilizzando un filo di sutura numero sei. Pulire l'area con etanolo al 70% al termine della procedura di imaging. Posizionare l'animale in una gabbia pulita sotto una lampada a calore fino a quando non si sveglia e recupera la mobilità.Quindi restituire l'animale alla sua gabbia originale per eseguire nuovamente l'immagine a un tempo successivo, che può variare da due giorni a molti mesi dopo; rimuovere i punti e riaprire la pelle sulla testa. Utilizzando metodi asettici, usare l'immagine digitale della vascolarizzazione cerebrale ottenuta durante l'intervento chirurgico iniziale per localizzare la posizione originale di imaging. Quindi fissare nuovamente la piastra cranica come in precedenza.Utilizzare una lama microchirurgica per rimuovere delicatamente qualsiasi osso che possa essersi rigenerato tra i diversi punti temporali di acquisizione, se necessario. Affinare con un trapano dentale, pulire la finestra di imaging dai detriti e applicare una goccia di soluzione salina sterile allo 0,9%. Trasportare l'animale a un microscopio a due fotoni e individuare l'area di imaging originale utilizzando l'immagine fluorescente digitale acquisita durante la sessione precedente.Avviare il programma di visualizzazione del flusso. Aprire l'immagine originale a basso ingrandimento, fissare un foglio trasparente allo schermo del computer e disegnare il pattern principale dei vasi sanguigni utilizzando una penna per trasparenze. Successivamente, aprire l'immagine in tempo reale e riallineare la vascolarizzazione al pattern disegnato sul film trasparente.Rimuovere la pellicola trasparente per riprendere le strutture ingrandite otto volte. Aprire la serie desiderata raccolta nella sessione di acquisizione precedente. Disegnare la struttura su un film di pellicola trasparente fissato allo schermo del computer.Zoomare di otto volte rispetto all'immagine in tempo reale e allineare l'immagine con la trasparenza. A seconda della precisione con cui si allinea la posizione a basso ingrandimento, potrebbe essere necessario regolare leggermente anche l'angolo dell'immagine; impostare le coordinate di panoramica sui parametri di imaging del primo giorno, inclusi la dimensione del passo e il numero di immagini da acquisire. La reimaging di Zack può essere eseguita due volte. Il numero di volte in cui il cuoio capelluto viene aperto deve essere limitato per evitare di compromettere l'integrità del cranio, il che comporterebbe una scarsa risoluzione di imaging nei topi esprimenti GFP.Un sottoinsieme di cellule parametali dello strato cinque e i corrispondenti processi dendritici sono stati visualizzati mediante microscopia a scansione laser a due fotoni in vivo; qui sono mostrati dendriti della corteccia visiva marcati con GFP. L'immagine è una proiezione di una singola immagine acquisita ogni cinque micron dalla PIA fino a una profondità finale di 175 micron. La regione delimitata dal riquadro è mostrata a ingrandimento maggiore qui al giorno zero e nuovamente al giorno quattro; a destra, ingrandimento maggiore di un'immagine di un ramo dendritico rispettivamente al giorno zero e al giorno quattro, confrontate.Queste immagini mostrano spine stabili, indicate dalle punte di freccia bianche, spine ritratte perse, marcate dalla punta di freccia rossa, e nuove spine indicate dalla punta di freccia verde. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'immagine cronica a due fotoni nella corteccia visiva del mouse utilizzando una preparazione a cranio sottile. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di prestare particolare attenzione durante il processo di assottigliamento per evitare danni al cranio e alla dura madre sottostante, poiché ciò comporterebbe una scarsa risoluzione dell'immagine, e prendere appunti dettagliati.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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