Name: Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Scopri come stimolare meccanicamente cellule vive utilizzando un microscopio integrato AFM-ottico. Questo metodo permette di osservare in tempo reale la risposta cellulare e il rimodellamento del citoscheletro di actina.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Plasmide vinculina-GFP è stato un dono di Kenneth Yamada, National Institutes of Health, National Institute of Dental Research e craniofacciale, Bethesda, Maryland, e actina-MRFP plasmide era un dono di Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, in Florida. Questo lavoro è stato sostenuto dal premio alla carriera NSF # 0747334 e AHA-Nazionale SDG # 0835205N di Andreea Trache.

1. Panoramica del sistema integrato di microscopio Il sistema di microscopio che viene utilizzato per questi studi è stato descritto in dettaglio 1. In breve, una rovesciata Olympus IX-81 con microscopio TIRF attaccamento (Olympus, Center Valley, PA) è combinata con CSU-22 Yokogawa testa di scansione (Yokogawa Electric Inc, Giappone). Un microscopio SZ Bioscope forza atomica (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) è montato sulla parte superiore del microscopio ottico invertito, e l'intero sistema è collocato su un tavolo grado ricerca ottici (Newport, Irvine, CA). L'assemblea confocale composto da spinning-disk scanner, esterno ruota portafiltri e la sua macchina fotografica EMCCD (scientifico-Roper fotometrici, Tucson, AZ) sono rigidamente collegati con una piastra base in alluminio posta su un blocco di silicio necessario per lo smorzamento delle vibrazioni. Lo scanner confocale si collega con il microscopio attraverso una flangia con un collare ricostruiti che può essere disaccoppiato dal microscopio AFM durante le misurazioni, in modo che nessuna vibrazione dallo scanner spinning-disk influenzerà le misure AFM. Un Argon-laser Krypton (Spectra Physics, Mountain View, CA) è utilizzato come fonte di eccitazione per entrambi TIRF e modalità di imaging confocale, e possono essere accoppiati in alternativa in due fibre ottiche che offrono il laser per l'attaccamento TIRF o la testa di scansione, rispettivamente . Due computer di controllo del sistema: Slidebook software controlla l'imaging ottico e software Nanoscope controlla l'AFM. 2. Colture Cellulari Cellule viventi che esprimono GFP costruisce mirati contro specifiche proteine ​​deve essere posto in un piatto di vetro cultura fondo cellulare 24 ore prima l'esperimento stimolazione meccanica. Il giorno dell'esperimento sostituire il terreno di coltura cellulare con rosso fenolo-free medio. Il piatto di coltura cellulare è montato sul palco AFM con un collare magnetico. 3. AFM Suggerimento Preparazione e Microscopio Set-up La punta AFM personalizzato con un micron 2 biotinilated perle di vetro viene lavato per cinque volte con DPBS e poi incubate 5 min con avidina (1 mg / ml), lavate di nuovo con DPBS cinque volte, e poi incubati 5 minuti con 1 mg / mL biotinilated fibronectina. La punta sarà lavato cinque volte di più alla fine 2, montata sullo scanner AFM, e poi il facciale in silicone di protezione saranno disposte intorno al titolare. Impostare il microscopio per la visualizzazione di video per allineare la punta AFM al centro del campo visivo. Allineare la leva ottica mettendo il raggio laser alla fine del cantilever, e quindi modificare l'obiettivo di un obiettivo ad alto ingrandimento adeguata per l'imaging di singola cellula. La costante elastica della punta deve essere determinato prima di iniziare l'esperimento. Questo parametro verrà misurato con il metodo termico sintonia disponibili nel software Nanoscope. Passare dalla videocamera a fotocamera EMCCD per consentire l'imaging fioritura. Poi, scegliere una cella e portare la punta AFM in contatto con quella cella specifica. Dopo 20 minuti il ​​tempo di attesa, che è necessario per una forte adesione focale per formare nel punto di AFM di contatto con la superficie cellulare, la procedura di stimolazione meccanica si avvia. 4. La stimolazione meccanica del Live Cell TIRF 3-4 di imaging sarà il metodo di scelta per la visualizzazione e la quantificazione adesioni focali, e la filatura del disco di imaging confocale 5 sarà utilizzato per la visualizzazione del citoscheletro di actina in tutto il corpo cellulare. L'AFM 6 sarà utilizzato nella diagnostica per immagini in modalità di contatto del liquido. Un'immagine TIRF o confocale della cellula sarà acquisito prima di iniziare la procedura di stimolazione meccanica. La stimolazione meccanica saranno indotti dalla sonda funzionalizzata AFM che verrà spostato verso l'alto in passi discreti ogni 3-5 minuti per un periodo di tempo (1-1.5 ore). La cellula-reattiva risposta sarà registrata in modo continuo nel software Nanoscope come una serie di immagini di altezza, ogni riga dell'immagine che rappresenta una unità di tempo di 1 sec. Durante l'acquisizione dei dati AFM, l'operatore controlla in ogni momento la posizione z della punta AFM per determinare la tempistica adeguata per la spinta successiva. Dopo ogni stimolazione meccanica è possibile acquisire un'immagine TIRF o confocale della cellula in Slidebook software, mentre continua l'acquisizione di dati AFM. Le immagini ottiche possono essere elaborati off-line per creare filmati che mostrano citoscheletro di actina e focale riorganizzazione aderenze. Inoltre, ogni immagine può essere elaborata quantitativamente per determinare l'area delle cellule, l'area specifica proteina, e analizzare la morfologia generale delle cellule. Alla fine dell'esperimento viene ritirata la punta AFM dalla cella e la sensibilità punta AFM sarà misurata nel software Nanoscope. L'esperimento è molto sensibili al rumore! Qualsiasi parlare o microscopio toccando durante la experiment dovrebbe essere evitato. Per ridurre al minimo il rumore nelle misure AFM, la filatura-disk confocale dovrebbe essere disaccoppiato dal microscopio. Il tempo di attesa per formare una forte adesione focale tra la superficie delle cellule e la punta AFM può variare a seconda del tipo di cellule e la matrice rivestito sulla punta. 5. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Stesso delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) transfettate con l'actina-MRFP e vinculina-GFP è stato ripreso da: (A) AFM sulla superficie cellulare apicale; (B) TIRF sulla superficie delle cellule basali, e (C) spinning-disk microscopia confocale in tutto il corpo cellulare. L'immagine confocale è indicato come proiezione massima di un 3-D stack. Buone le sovrapposizioni tra AFM e TIRF o immagini confocale spinning-disk sono mostrati in (D) e (E), rispettivamente. Dimensione dell'immagine è 64 x 50 micron. <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Un VSMC transfettate con l'actina-MRFP era meccanicamente stimolato dal AFM e ripreso da spinning-disk microscopia confocale Le frecce indicano le fibre di actina che:. (A) polimerizzare / addensare, (b) depolymerize / sparire, o (c) Bundle insieme a causa alla ristrutturazione di actina. Linee bianche tratteggiate rappresentano la punta AFM sopra la cella. Dimensione dell'immagine 91 x 91 micron.

<ol><li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).</li>
<li>Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrache%2C+A+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22">Current Protocols in Microbiology</a>. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrache%2C+A+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22">Current Protocols in Microbiology</a>. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).</li>
<li>Inoue, S., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-view+high-speed+confocal+scanner%3A+the+CSU-10%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10.</a> Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope.</a> Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Stamenović, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+mechanics+in+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells.</a> Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).</li>
<li>Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+remodeling+of+the+airway+smooth+muscle+cell%3A+a+mechanism+for+adaptation+to+mechanical+forces+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung.</a> Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).</li>
<li>Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganization+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).</li>
<li>Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+Adhesions%3A+paradigm+for+a+signaling+nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus.</a> Circulation Research. 98, 606-616 (2006).</li>
<li>Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+development+during+contractile+stimulation+of+smooth+muscle+requires+recruitment+of+paxillin+and+vinculin+to+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).</li>
<li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+all+signals+point+to+cytoskeleton%2C+matrix+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Sciences+STKE%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins.</a> Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).</li>
<li>Zamir, E., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+complexity+and+dynamics+of+cell-matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions.</a> J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).</li>
<li>Geiger, B., Bershdsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+mechanosensory+function+of+focal+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly and mechanosensory function of focal contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).</li>
<li>Sastry, S. K., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+Adhesions%3A+a+nexus+for+intracellular+signaling+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics.</a> Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).</li>
<li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Dev Cell. 10, 11-20 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Aderenze citoscheletro 7-10 e 11-16 focali sono strutture dinamiche che assemblano, si disperdono e girare come le cellule migrano o rispondere a forza meccanica 17. Essi hanno funzioni importanti nella regolazione della crescita cellulare, la sopravvivenza, e l&#39;espressione genica. Conoscendo la loro distribuzione e le dinamiche specifiche fornisce una migliore comprensione di come le cellule comunicano con la matrice e tra loro. Questo sistema nuovo micr...

<table><tbody><tr><td>Punta AFM</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td></td><td>Microsfera di borosilicato da 2 micron, 0,01 N/m, superficie con biotina</td></tr><tr><td>Avidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9275</td><td>1 mg/mL in DPBS</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4759</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-051</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trasfezione Amaxa per cellule muscolari lisce</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPI-1004</td><td></td></tr><tr><td>Piatti MatTek con fondo in vetro</td><td>MatTek Corp.</td><td>P60G-1.5-30-F</td><td>Piatti sterili Falcon da 60 mm con coprivetrino in vetro n. 1.5 sul fondo</td></tr></tbody></table>

risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere studiato da integrated ottica e microscopia a forza atomica

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Per capire il meccanismo con cui le cellule viventi senso forze meccaniche, e come rispondono e si adattano al loro ambiente, una nuova tecnologia in grado di studiare il comportamento delle cellule a livello sub-cellulare di livello ad alta risoluzione spaziale e temporale è stato sviluppato. Così, un microscopio a forza atomica (AFM) è stato integrato con la riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia e in rapida rotazione del disco (FSD) microscopia confocale. Il sistema integrato è ampiamente applicabile per una vasta gamma di studi di dinamica molecolare in alcun cellule aderenti vivere, permettendo diretta imaging ottico delle risposte delle cellule alla stimolazione meccanica in tempo reale. Riorganizzazione significativa dei filamenti di actina e adesioni focali è stato dimostrato a causa di locali stimolazione meccanica sulla superficie cellulare apicale che hanno indotto cambiamenti nella struttura cellulare in tutto il corpo cellulare. Queste tecniche innovative forniranno nuove informazioni per comprendere la ristrutturazione delle cellule vive e dinamiche in risposta alla forza meccanica. Un protocollo dettagliato ed un set di dati rappresentativi che la risposta delle cellule spettacolo dal vivo allo stimolo meccanico sono presentati.

Questo lavoro si propone di istruire il lettore al funzionamento di un sistema integrato di forza atomica-microscopio ottico di imaging per la stimolazione meccanica delle cellule vive nella cultura. Un passo-passo il protocollo viene presentato. Un insieme rappresentativo di dati che mostra dal vivo risposta alla stimolazione meccanica delle cellule è presentato.

Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica

Per comprendere il meccanismo attraverso il quale le cellule viventi percepiscono le forze meccaniche, e come rispondano e si adattino al proprio ambiente, è necessaria una nuova tecnologia in grado di...

Lo studio della risposta cellulare in tempo reale alla stimolazione meccanica viene effettuato coltivando prima le cellule che esprimono proteine di fusione GFP in piatti con fondo in vetro per 24 ore. Il secondo passaggio consiste nel rivestire la punta A FM con fibronectina biotinilata. Successivamente, la punta A FM funzionalizzata viene messa a contatto con la superficie cellulare per consentire la formazione di una forte adesione focale intorno alla punta A FM, permettendo una manipolazione diretta del citoscheletro di actina attraverso un legame matrice-integrina-actina tra la punta rivestita di fibronectina e la cellula.L'ultimo passaggio consiste nel stimolare meccanicamente la cellula vivente mediante un movimento controllato verso l'alto della punta AFM, in modo che la forza verticale venga applicata nel punto di contatto con la cellula senza rompere l'adesione focale forte. Alla fine, i risultati mostrano che le cellule rispondono alla stimolazione meccanica rafforzando il loro attacco al substrato e inducendo il riorganizzazione del citoscheletro di actina, come registrato mediante imaging ottico fluorescente in tempo reale. Ciao, sono Andrea Trake, professore assistent

live-cell-response-to-mechanical-stimulation-studied-integrated

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l&#39;esempio di bovini cellule endoteliali corneali

Questo documento illustra un protocollo per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi mediante micropenetrazione utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Un nuovo protocollo di imaging è stato sviluppato utilizzando un attuatore meccanico motorizzato personalizzato per consentire la misurazione delle risposte in tempo reale alla deformazione meccanica nelle cellule vive. Rilevante per la meccanobiologia, il sistema può applicare deformazioni fino al 20% consentendo l'imaging quasi in tempo reale con microscopia confocale o a forza atomica.

Imaging Live Cell durante meccanica Stretch

Qui descriviamo i metodi per la valutazione della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta. Nell'analisi della base di microscopia, esaminiamo la localizzazione di biosensori fluorescente etichettati dopo breve stimolazione con flusso di shear. Ci prova anche l'attivazione di varie proteine di interesse in risposta alla stimolazione meccanica acuta biochimicamente.

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Nuovi strumenti per la ricerca di mechanobiology sono necessari per capire lo stress come meccanico attiva vie biochimiche e suscita risposte biologiche. Qui, presenteremo un nuovo metodo per stimolazione meccanica selettiva degli animali immobilizzati con una trappola di microfluidica permettendo di imaging ad alta risoluzione delle risposte cellulari.

Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans

Presentiamo un protocollo per funzionalizzare i cantilever a forza atomica (AFM) con una singola cellula T e particelle di perline per studi immunologici. Vengono mostrate le procedure per sondare il legame di cellula-cellula T a una singola coppia da parte di AFM e per monitorare la risposta cellulare in tempo reale dei macrofagi a una singola particella solida da AFM con imaging a fluorescenza.

Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

Qui è presentato il protocollo della tecnica Conpokal, che combina microscopia a forza confocale e atomica in un'unica piattaforma di strumenti. Conpokal fornisce la stessa cellula, la stessa regione, vicino all'imaging confocale simultaneo e alla caratterizzazione meccanica di campioni biologici vivi.

Microscopia confocale e a forza atomica (Conpokal) quasi simultanea su cellule vive

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le proprietà meccaniche intracellulari di cellule embrionali isolate di zebrafish in confinamento tridimensionale con misurazione della forza diretta mediante una trappola ottica.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

Questo articolo descrive un protocollo per la caratterizzazione meccanica degli sferoidi viventi all'interno di una matrice 3D utilizzando la microspettroscopia di Brillouin. Questo metodo completamente ottico consente la visualizzazione degli sferoidi con risoluzione in scala microscopica e proprietà meccaniche quantitative. Questo approccio ha implicazioni per il fenotiping meccanico; ad esempio, determinare stati patologici degli sferoidi tumorali all'interno di un microambiente 3D.

Mappatura meccanica degli sferoidi tramite spettroscopia di Brillouin

Scopri come stimolare meccanicamente cellule vive utilizzando un microscopio integrato AFM-ottico. Questo metodo permette di osservare in tempo reale la risposta cellulare e il rimodellamento del citoscheletro di actina.

Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica

Esplora altri video