Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica

Lo studio della risposta cellulare in tempo reale alla stimolazione meccanica viene effettuato coltivando prima le cellule che esprimono le proteine di fusione GFP su piastre con fondo di vetro per 24 ore. Il secondo passo consiste nel rivestire la punta A FM con fibronectina biotinilata. Quindi la punta FM funzionalizzata viene portata a contatto con la superficie cellulare per consentire la formazione di una forte adesione focale attorno alla punta A FM, consentendo la manipolazione diretta del citoscheletro act attraverso un legame di integrina actina della matrice tra la punta rivestita di fibronectina e la cellula.

Il passaggio finale consiste nello stimolare meccanicamente la cellula viva con un movimento controllato verso l'alto della punta A FM, in modo tale che la forza verticale venga applicata nel punto di contatto della cellula senza interrompere la forte adesione focale. In definitiva, i risultati mostrano che le cellule rispondono alla stimolazione meccanica rafforzando il loro attaccamento al substrato e inducendo la riorganizzazione del citoscheletro di actina come registrato con l'imaging ottico a fluorescenza in tempo reale. Ciao, sono Andrea Trake, assistente professore presso il Dipartimento di Biologia dei Sistemi e Medicina Traslazionale presso il Texas a and m Health Science Center.

Ciao, sono Sum Lim. Sono borsista post-dottorato presso il Dipartimento di Biologia dei Sistemi e Medicina Traslazionale presso il Texas a and m Health Science Center. Oggi ti mostreremo una procedura per studiare il rimodellamento cellulare adattivo alla stimolazione meccanica.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il rimodellamento citoscheletrico in tempo reale nelle cellule muscolari lisce vascolari vive. Quindi iniziamo. Per questi studi, viene utilizzato un microscopio Olympus IX 81 invertito con fluorescenza a riflessione interna totale o attacco per tappeto erboso combinato con una testa di scansione CSU 22 Yokogawa.

Un microscopio a forza atomica bioscopio SZ è montato sopra il microscopio ottico invertito. L'intero sistema è montato su un tavolo ottico di ricerca ed è stato precedentemente descritto in dettaglio. Questo microscopio integrato utilizza due dispositivi quantistici EM per moltiplicazione di carica ad accoppiamento di carica o telecamere E-M-C-C-D.

Uno è per l'imaging del tappeto erboso e l'altro per l'imaging confocale. Il gruppo confocale, composto dalla ruota portafiltri esterna dello scanner a disco rotante e da una fotocamera E-M-C-C-D, è montato su una piastra di base in alluminio posta sopra un cuscinetto in silicone necessario per lo smorzamento delle vibrazioni. L'intero gruppo confocale si collega al microscopio attraverso una flangia con un collare filettato.

Pertanto, il gruppo può essere disaccoppiato dal microscopio durante la microscopia a forza atomica o le misurazioni FM per evitare vibrazioni dallo scanner a disco rotante. Un laser argon krypton viene utilizzato come fonte di eccitazione sia per la modalità di imaging del tappeto erboso che per quella confocale. Il laser può essere accoppiato a una delle due fibre ottiche, che forniscono il laser all'attacco del tappeto erboso o alla testa di scansione confocale.

Due, i computer controllano il sistema. Uno utilizza il software del libro delle diapositive, che controlla l'imaging ottico e l'altro il software del nanoscopio, che controlla l'A FM 24 ore prima dell'esperimento di stimolazione meccanica, ha posizionato cellule vive che esprimono costrutti GFP mirati contro proteine specifiche in un piatto di coltura cellulare con fondo di vetro. Il giorno dell'esperimento, sostituire il terreno di coltura cellulare con un terreno privo di rosso fenolo.

Poiché l'esperimento FM è molto sensibile al rumore, evitare di parlare o toccare il tavolo ottico o il microscopio durante l'esperimento per ridurre al minimo il rumore. Nelle misure FM a, disaccoppiare il confocale a disco rotante dal microscopio. L'esperimento inizia montando la piastra di coltura cellulare su uno stadio FM con un collare magnetico per fissare la piastra al tavolino del microscopio magnetico.

Il cantilever a forma di V sulla sonda A FM è personalizzato con la perla di vetro biotinilato da due micron. Il cantilever può essere facilmente visto con il microscopio. Il cordone è incollato all'estremità del cantilever, ed è qui che la soluzione di rivestimento deve essere applicata a goccia.

Per preparare una sonda FM per l'esperimento, montare prima la punta nel supporto del vetro e quindi posizionare il supporto del vetro sul supporto da tavolo per rivestire la punta. Lavare la punta gocciolando accuratamente 10 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato docos o DPBS all'estremità della punta, quindi utilizzare una salvietta kim per asciugare la punta. Ripetere questa procedura cinque volte dopo il lavaggio con DPBS alla dose di un milligrammo per millilitro.

Avido di soluzione. Goccia a goccia sopra la punta. Lasciare incubare la punta per cinque minuti dopo il rivestimento con avadon.

Lavare la punta altre cinque volte con DPBS. Quindi reticolare la fibronectina biotinilata sull'avadon aggiungendo una soluzione di un milligrammo per millilitro. Versare goccia a goccia sulla punta e incubare per cinque minuti.

Infine, lavare nuovamente la punta cinque volte con DPBS lasciando l'ultima goccia sulla punta. Una volta preparata la punta, montarla su uno scanner FM. Dopo aver montato la punta FM, posizionare un facciale protettivo in silicone attorno al supporto.

Quindi imposta il microscopio per la visualizzazione di video. Quindi, allineare la punta FM al centro del campo visivo. Impostare la leva ottica posizionando il raggio laser all'estremità del cantilever.

Quindi cambiare l'obiettivo con l'obiettivo ad alto ingrandimento appropriato per l'imaging di singole cellule. Quindi porta la cellula, che verrà stimolata meccanicamente, nel campo visivo e scegli un punto in cui la punta A FM dovrebbe atterrare sulla superficie della cellula. Infine, abbassa la punta FM finché non tocca quella specifica cella.

Dopo aver portato la punta a contatto con la cella, attendere circa 20 minuti. Ciò consente la formazione di una forte adesione focale nel punto di contatto FM sulla superficie cellulare. Dopo il periodo di attesa, la procedura di stimolazione meccanica può iniziare a prepararsi per l'esperimento di stimolazione meccanica.

Passa dalla videocamera alla telecamera E-M-C-C-D per consentire la visualizzazione delle celle fluorescenti per l'imaging. Quindi acquisire un'immagine iniziale della cellula a riposo. Utilizzare il disco rotante e la microscopia vocale per visualizzare l'atto nel citoscheletro in tutto il corpo cellulare.

Al contrario, utilizzare il tappeto erboso per visualizzare le aderenze focali per stimolare la cellula. Utilizzare il cantilever per applicare un movimento controllato verso l'alto a passi discreti ogni tre-cinque minuti. Durante l'acquisizione dei dati A FM, è importante che l'operatore monitori costantemente la tensione della posizione Z piso per determinare la corretta temporizzazione per il polo verticale.

Contemporaneamente a un'acquisizione dati FM, registrare un'immagine confocale o erbosa della cella dopo ogni trazione verticale utilizzando il software del libro di diapositive. Infine, al termine dell'esperimento di stimolazione, prelevare la punta FM dalla cellula. Un trasfetto di cellule muscolari lisce vascolari con actina MRFP e vcul.

La GFP è stata ripresa utilizzando una FM sulla superficie della cellula apicale. La stessa cellula è stata ripresa utilizzando il tappeto erboso sulla superficie della cellula basale. Qui le due immagini sono sovrapposte.

Un'immagine della stessa cellula è stata acquisita utilizzando il disco rotante confocale in tutto il corpo cellulare ed è mostrata come proiezione massima di una pila 3D. Vengono mostrate buone sovrapposizioni tra le immagini confocali A FM e disco rotante. La sua cellula muscolare liscia vascolare trasfettata con actina MRFP è stata stimolata meccanicamente dall'A FM e ripresa mediante microscopia confocale a disco rotante.

Gli errori indicano che le fibre agenti mostrano una notevole ristrutturazione dopo una stimolazione FM. Alcune fibre agiscono polimerizzano mentre altre si depolimerizzano a causa della stimolazione meccanica, altre fibre agenti si raggruppano insieme. A causa della ristrutturazione dell'atto, vi abbiamo appena mostrato come stimolare meccanicamente una cultura di vendita della vita utilizzando EFM e contemporaneamente registrare il riarrangiamento CY utilizzando metodi di imaging ottico.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che l'esperimento FM è estremamente rumoroso, sensibile. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con le tue dichiarazioni.