Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare il modulo elastico di cellule vive utilizzando un microscopio a forza atomica. Questo viene ottenuto innanzitutto eseguendo misurazioni di spettroscopia di forza in modalità FM in diverse posizioni sulla cellula. Come secondo passaggio, ogni curva forza-distanza viene analizzata per determinare il punto in cui la punta in modalità FM entra inizialmente in contatto con la cellula.

Successivamente, a partire dal punto di contatto, i primi 200-300 nanometri di dati di indentazione vengono adattati al modello di Hertz. Per estrarre il modulo elastico, i risultati forniscono una mappa 2D della rigidità cellulare ottenuta mediante la modalità di mappatura della forza, in cui ogni pixel rappresenta una singola curva forza-distanza. A dimostrare la procedura sarà Guen Thomas, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, pulire il portacantilever con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare.

Quindi caricare una mensola bru DNP 10 nell'A FM seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, calibrare la sensibilità del leva ottica inversa. Questo parametro descrive l'entità della risposta del fotodiodo in volt per nanometro di deflessione della mensola.

Per eseguire questa operazione, posizionare innanzitutto un vetrino pulito sullo stage del campione. Installare la testina AFM e regolare il fascio laser e l'allineamento secondo le istruzioni del produttore. Una volta completato l'allineamento, portare la punta AFM a contatto con il vetrino con il P eight O ritratto.

Riposizionare lo specchio in modo da ottenere una lettura del fotodiodo di meno due volt. Quindi eseguire una misurazione di spettroscopia a forza con una risposta massima del fotodiodo o punto di attivazione di più due volt. Al termine dell'acquisizione dei dati, eseguire uno zoom sulla regione di contatto stabile della curva di forza ed effettuare un adattamento lineare a questa regione.

Per trovare la pendenza in volt per nanometro, quindi ripristinare l'allineamento dello specchio a una deflessione libera di zero volt. Successivamente, calibrare la costante elastica della mensola utilizzando il metodo di taratura termica descritto da Levy e Malam. Per iniziare, sollevare lo scanner lontano dallo stadio del campione in modo che non vi siano interazioni tra la punta e il campione.

Quindi acquisire i dati termici registrando la vibrazione termica della trave in cantilever. Il software AFM analizza lo spettro di potenza di tale vibrazione termica e lo rappresenta in una finestra di dati. Successivamente, eseguire un adattamento del segmento di dati centrato alla frequenza più bassa, nota anche come picco di risonanza fondamentale, per determinare la costante elastica.

Per preparare un microscopio a forza atomica (FM) per le piastre di coltura, installare un accessorio riscaldante per piastre sulla piattaforma del FM e impostare la temperatura a 37 gradi Celsius. Attendere 20 minuti affinché il sistema raggiunga un equilibrio termico stabile. Una volta preriscaldato, posizionare una piastra di coltura sulla piattaforma del FM e fissarla utilizzando la pinza fornita con il riscaldatore per piastre; per misurazioni di durata superiore a 30 minuti, si dovrebbe utilizzare un mezzo indipendente dal biossido di carbonio al posto del mezzo di coltura normale.

Successivamente, applicare una piccola goccia di mezzo di coltura a 37 gradi Celsius sulla punta del cantilever AFM e abbassare la testa AFM fino a quando la punta è appena immersa nel liquido. Utilizzando una telecamera CCD con vista dall'alto, riallineare il fascio laser sul cantilever. L'allineamento nel liquido sarà diverso rispetto all'aria a causa del cambiamento dell'indice di rifrazione del mezzo.

Dopo l'allineamento, posizionare la punta AFM su un'area della piastra di coltura priva di cellule ed eseguire la calibrazione della sensibilità del leva ottica inversa nell'ambiente liquido. Per iniziare le misurazioni delle proprietà meccaniche delle cellule, posizionare la punta della mensola sopra la regione dell'occhio perlaceo di una cellula con l'aiuto di un microscopio ottico. Regolazioni precise della posizione della mensola si ottengono applicando offset ai scanner X e Y.

Quindi passare l'AFM alla modalità di spettroscopia in forza e impostare la velocità di indentazione a cinque micrometri al secondo, un valore sufficientemente basso da evitare effetti idrodinamici. Successivamente, impostare il punto di attivazione della deflessione a due nano newton. Per evitare di danneggiare le cellule, regolare questo valore in base alla rigidità del campione.

Inoltre, selezionare l'opzione di triggering relativo, che correggerà eventuali deriva del segnale di deflessione. Impostare quindi la distanza di forza a cinque micrometri per garantire che la punta si stacchi completamente dalla cellula tra una misurazione di forza e l'altra. Acquisire tre curve di forza in posizioni diverse nella regione nucleare di almeno 30 cellule per ogni condizione.

Sebbene sia utile acquisire più curve su ciascuna cellula, per ottenere dati statistici affidabili, prelevare un numero eccessivo di curve può indurre variazioni nella rigidità cellulare a causa dello stress provocato dalla sonda AFM. Caratterizzare ulteriormente la distribuzione delle proprietà meccaniche all'interno di una singola cellula utilizzando la modalità mappa di forza.

In modalità mappa di forza, impostare la dimensione della scansione a 30 micrometri, la risoluzione a 32 per 32 e i parametri di indentazione uguali a quelli selezionati per le singole curve di forza. L'AFM acquisirà quindi singole curve di forza in corrispondenza di ciascun pixel della regione del campione e fornirà una mappa di rigidità dell'intera area. Successivamente, analizzare le curve di forza registrate utilizzando MATLAB per calcolare la rigidità cellulare.

Iniziare adottando un algoritmo pubblicato per la prima volta da Lynette Al, che calcola sia un adattamento lineare sia un adattamento di Hertz da ciascun punto utilizzando Matlab. Calcolare l'errore RMS relativo di entrambi gli adattamenti e sommare questi valori in ciascun punto. Il punto che presenta l'errore di adattamento totale minimo viene selezionato come punto iniziale di contatto; individuare questo punto è fondamentale per una misurazione accurata del modulo di Young della cellula.

Successivamente, calcolare la deformazione del campione delta. Utilizzando le seguenti equazioni, la deformazione è pari a zero prima del contatto con la cellula, dove Z è minore di Z zero, ed è uguale alla differenza tra la deflessione della mensola D e la distanza totale Z oltre il punto di contatto. Quindi, calcolare la forza di indentazione F mediante le seguenti equazioni, in cui la forza è pari a zero prima del contatto con la cellula, dove Z è minore di Z zero, ed è uguale alla costante elastica K della mensola moltiplicata per la deflessione della mensola oltre il punto di contatto.

Successivamente, l'adattamento di Elise square viene applicato ai dati di deformazione del campione in funzione della forza di indentazione nella regione post-contatto del modello di Hertz, al fine di ricavare il modulo di Young della cellula in base alla forma della punta utilizzata, mostrata qui. Di seguito sono riportate curve di forza rappresentative ottenute da tre cellule di fibroblasti T3 coltivate su tre superfici diverse. Come si può osservare, superfici diverse possono influenzare notevolmente la rigidità del citoscheletro cellulare.

La deformazione media delle cellule coltivate su una superficie rigida in plastica è mostrata in rosso. Quelle cresciute su un gel di poli acrilammide rigido sono mostrate in viola, e quelle cresciute su un gel di poli acrilammide elastico sono mostrate in blu. Dopo aver identificato con attenzione i punti di contatto nelle curve, le forze di indentazione in funzione della deformazione cellulare possono essere rappresentate con precisione.

Inoltre, il loro modulo di Young può essere calcolato con precisione dai primi 300 nanometri di indentazione dopo il contatto. Qui è mostrato un fibroblasto che è stato trasfettato con la proteina verde fluorescente marcata con la mentonina, un tipo di filamento intermedio. Più luminosa è l'immagine, maggiore è la quantità di mentonina presente in quella regione.

Questo può essere correlato alla rigidità del citoscheletro cellulare. Utilizzando la tecnica di mappatura della forza AFM presentata qui, è possibile ottenere una mappa simile della rigidità di un fibroblasto con una risoluzione di 32 per 32 pixel, in cui ogni pixel rappresenta un'area superficiale cellulare di 2,5 per 2,5 micron. Dopo aver visto questo video, si avrà una buona idea su come utilizzare la microscopia a forza atomica per misurare l'elasticità delle cellule dei tessuti viventi.