Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di misurare il modulo elastico delle cellule viventi utilizzando un microscopio a forza atomica. Ciò si ottiene eseguendo prima una spettroscopia di forza FM in varie posizioni sulla cella. Come secondo passo, ogni curva di distanza forzata viene analizzata per determinare il punto in cui la punta A FM entra inizialmente in contatto con la cella.

Successivamente, a partire dal punto di contatto, i primi 200-300 nanometri di dati di indentazione vengono adattati al modello hertz. Al fine di estrarre il modulo elastico, i risultati producono una mappa 2D della rigidezza cellulare ottenuta utilizzando la modalità di mappatura delle forze in cui ogni pixel rappresenta una singola curva di distanza forzata. A dimostrare la procedura sarà Guen Thomas, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, pulire il supporto a sbalzo con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare.

Quindi caricare un cantilever bru DNP 10 nell'A FM secondo le istruzioni del produttore. Quindi, calibrare la sensibilità della leva ottica inversa. Questo parametro descrive la quantità di risposta del fotodiodo in volt per nanometro di deflessione a sbalzo.

Per fare ciò, caricare prima un vetrino pulito sul tavolino di campionamento. Installare la testa FM e regolare il raggio laser e l'allineamento secondo le istruzioni del produttore. Una volta allineato, innestare la punta A FM sul vetrino con il P otto O ritirato.

Riallineare lo specchio a una lettura del fotodiodo di due volt negativo. Quindi eseguire una misurazione della spettroscopia di forza con una risposta massima del fotodiodo o un punto di trigger di due volt positivi. Al termine dell'acquisizione dei dati, ingrandire la regione di contatto rigido della curva di forza ed eseguire un adattamento lineare a questa regione.

Per trovare la pendenza in volt per nanometro, reimpostare l'allineamento dello specchio su una deflessione libera di zero volt. Quindi, calibrare la costante della molla a sbalzo utilizzando il metodo di regolazione termica descritto da levy e Malam. Per iniziare, sollevare lo scanner dal tavolino del campione in modo che non vi siano interazioni tra la punta e il campione.

Quindi acquisire i dati termici registrando la vibrazione termica della trave a sbalzo. Il software A FM analizza uno spettro di potenza di tale vibrazione termica e lo traccia in una finestra di dati. Quindi, eseguire un adattamento al segmento di dati centrato alla frequenza più bassa, noto anche come picco di risonanza fondamentale per determinare la costante elastica.

Per preparare l'a FM per le piastre di coltura, installare un accessorio scaldapiatti sul palco FM e impostare la temperatura a 37 gradi Celsius. Attendere 20 minuti affinché il sistema raggiunga un equilibrio termico stabile. Una volta preriscaldato, posizionare un piatto di coltura sul palco FM e fissarlo utilizzando il morsetto fornito con il riscaldatore del piatto per misurazioni superiori a 30 minuti, è necessario utilizzare un terreno indipendente dall'anidride carbonica per sostituire il normale terreno di coltura.

Quindi, applicare una piccola goccia di terreno di coltura a 37 gradi Celsius sulla punta del cantilever A FM e abbassare la testa A FM fino a quando la punta non è appena immersa nel liquido. Utilizzando una telecamera CCD con vista dall'alto, riallineare il raggio laser sul cantilever. L'allineamento in un liquido sarà diverso da quello di un'aria a causa della variazione dell'indice di rifrazione del mezzo.

Una volta allineata, innestare la punta A FM su un'area priva di cellule della piastra di coltura ed eseguire la calibrazione della sensibilità della leva ottica inversa nell'ambiente liquido. Per iniziare le misurazioni delle proprietà meccaniche delle cellule, posizionare la punta a sbalzo sopra la regione dell'occhio di perle di una cellula con l'aiuto di un microscopio ottico. Le regolazioni precise della posizione dei cantilever si ottengono applicando offset agli scanner X e Y.

Quindi passare alla modalità a quattro spettroscopie e impostare la velocità di indentazione a cinque micrometri al secondo, che è abbastanza bassa da evitare effetti idrodinamici. Quindi, imposta il punto di innesco della deflessione su due nano newton. Per evitare di danneggiare le celle, regolare questo valore in base alla rigidità del campione.

Inoltre, selezionare l'opzione di attivazione relativa, che correggerà qualsiasi deviazione nel segnale di deflessione. Quindi impostare la distanza di forza a cinque micrometri per garantire che la punta sia completamente staccata dalla cella tra le misurazioni della forza. Raccogli tre curve di forza in posizioni diverse nella regione dei nuclei di almeno 30 cellule per ogni condizione.

Anche se è utile prendere più curve su ogni cella. Per ottenere dati statistici affidabili, l'assunzione di un numero eccessivo di dati può portare a cambiamenti nella rigidità della cella in sofferenza dalla sonda A FM. Caratterizzare ulteriormente la distribuzione delle proprietà meccaniche in una singola cella utilizzando la modalità force map.

In modalità mappa di forza, impostare la dimensione della scansione su 30 micrometri, la risoluzione su 32 per 32 e i parametri di indentazione sono gli stessi di quelli selezionati per le curve di forza singola. L'A FM prenderà quindi curve di forza singole in ogni pixel nella regione campione e fornirà una mappa di rigidità dell'intera regione. Successivamente, analizza le curve di forza registrate utilizzando MATLAB per calcolare la rigidezza della cella.

Inizia adottando un algoritmo pubblicato per la prima volta da Lynette Al, che calcola sia un adattamento lineare che un adattamento hertz da ciascun punto utilizzando matlab. Calcolare l'errore RMS relativo di entrambi gli accoppiamenti e sommare questi valori in ogni punto. Il punto che raggiunge il minimo errore totale di adattamento viene selezionato come punto di contatto iniziale, l'individuazione di questo punto è fondamentale per una misurazione accurata del modulo di Young delle cellule.

Quindi, calcolare il delta di deformazione del campione. Utilizzando le seguenti equazioni con la deformazione è uguale a zero prima del contatto con la cella dove Z è minore di Z zero ed è uguale alla differenza tra la deflessione a sbalzo D e la distanza totale Z oltre il punto di contatto. Quindi calcola la forza di indentazione F utilizzando le seguenti equazioni in cui la forza è uguale a zero prima del contatto con la cella dove Z è minore di Z zero ed è uguale alla costante elastica K del cantilever moltiplicata per la deflessione del cantilever oltre il punto di contatto.

L'adattamento del quadrato di Elise viene quindi applicato ai dati di deformazione del campione rispetto alla forza di indentazione nella regione del post contatto del modello hertz al fine di estrarre il modulo di Young della cella in base alla forma della punta utilizzata. Ecco le curve di forza rappresentative prese da tre cellule T a tre fibre coltivate su tre diverse superfici. Come puoi vedere qui, diverse superfici possono influenzare notevolmente la rigidità del citoscheletro cellulare.

La deformazione media delle cellule coltivate su una superficie di plastica dura è mostrata in rosso. Quelli cresciuti su un gel di poliacrilammide rigido sono mostrati in viola e quelli cresciuti su un gel di poliacrilammide elastico sono mostrati in blu. Dopo aver identificato attentamente i punti di contatto nelle curve, è possibile mostrare con precisione le forze di indentazione in funzione della deformazione della cella.

Inoltre, il loro modulo di Young, I può essere calcolato con precisione dai primi 300 nanometri di indentazione dopo il contatto. Qui è mostrato un fibroblasto che è stato trasfettato con una proteina fluorescente verde marcata con mentone, un tipo di filamento intermedio. Più luminosa è l'immagine, più Mentone si trova in quella regione.

Questo può essere correlato alla rigidità del citoscheletro cellulare. Utilizzando la tecnica di mappatura della forza A FM qui presentata, è possibile mostrare una mappa di rigidità simile di una fibra di blasto con una risoluzione di 32 x 32 pixel dove ogni pixel rappresenta 2,5 x 2,5 micron di superficie cellulare. Dopo aver visto questo video, avrà una buona idea su come utilizzare la microscopia a forza atomica per misurare l'elasticità delle cellule dei tessuti viventi.