Name: Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Impara a misurare il modulo elastico di cellule viventi mediante microscopia a forza atomica e spettroscopia di forza. Questo metodo consente di generare mappe 2D della rigidità cellulare per studi di biomeccanica.

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Gli autori ringraziano il Dott. Paolo Janmey presso l&#39;Università della Pennsylvania per la fornitura di linee cellulari utilizzate in questo documento. QW anche riconoscere JF Byfield e Evan Anderson per le loro discussioni penetranti sulle tecniche di AFM.

1. Calibrare la Costante molla di sbalzo <ol><li> Caricare il cantilever in AFM in base alle istruzioni del produttore. È necessario pulire il supporto a sbalzo con etanolo prima di qualsiasi esperimenti. Ciò contribuirà a limitare la contaminazione batterica di cultura durante le misurazioni AFM. </li><li> Calibrare InvOLS (Inverse Leva Sensibilità ottica). Questo parametro indica la quantità di risposta fotodiodo (Volt) per nanometro di sbalzo deflessione. </li><li> Caricare un vetrino pulito sul palco del campione, quindi installare la testa AFM e regolare il raggio laser e l&#39;allineamento in base alle istruzioni del produttore. Inserire la punta AFM sul vetrino. </li><li> Con il piezo ritirata, riallineare lo specchio di una lettura fotodiodo di -2 V. Eseguire una misurazione spettroscopia forza con un trigger point (risposta massima fotodiodo) di 2 V. </li><li> Con il piezo ritirata, riallineare lo specchio di una lettura fotodiodo di -2 V. Effettuare un foRCE misura spettroscopia con un trigger point (risposta massima fotodiodo) di 2 V. Nota: I valori di tensione qui sono specifici per l&#39;asilo AFM. Questo valore deve essere impostato in base alle specifiche fornite dal produttore. Dopo l&#39;acquisizione dei dati è completa, lo zoom alla regione ferma-contatto della curva di forza. Eseguire un adattamento lineare a questa regione per trovare la pendenza, che sarà in V / nm. Il reciproco di questo valore descrive la sensibilità ottica dell&#39;insieme cantilever-fotodiodo. </li><li> Ripristinare l&#39;allineamento specchio per una deviazione libero di 0 V. </li><li> Calibrare la costante della molla a sbalzo. Un metodo termico-tune viene utilizzato per determinare la costante di molla a sbalzo 28. </li><li> Dopo aver calibrato i InvOLS, sollevare lo scanner lontano dal palco campione tale che non ci sono interazioni tra la punta e il campione. </li><li> Iniziare l&#39;acquisizione di dati termici. Durante questo processo, la vibrazione termica della trave a sbalzo è Recorded. Il software AFM analizza uno spettro di potenza di un tale vibrazione termica e trame in una finestra di dati. </li><li> Dopo alcuni secondi di acquisizione dati, eseguire un adattamento per il segmento di dati centrata alla frequenza fondamentale più bassa (risonanza fondamentale) picco per determinare la costante della molla. </li></ol> 2. Caricamento del campione <ol><li> Installare il riscaldatore accessorio Piatto sul palco AFM, se non è già dotato. </li><li> Impostare la temperatura a 37 ° C, e attendere 20 min per il sistema di raggiungere un equilibrio termico stabile. </li><li> Posizionare il piatto cultura sul palcoscenico AFM e fissarlo utilizzando il morsetto con il riscaldatore piatto. È importante minimizzare il tempo tra la rimozione del piatto dall&#39;incubatore e posizionandolo sulla scena, per evitare traumi alle cellule. Per misurazioni più lunghi di 30 min, CO 2 medi indipendente dovrebbe essere usato per sostituire il normale mezzo di coltura. </li><li> Applicare una piccola goccia di 37 ° C terreno di coltura alla punta di tegli cantilever AFM, e abbassare la testa AFM finché la punta è appena immerso in un liquido. </li><li> Utilizzo della fotocamera top-view CCD, riallineare il fascio laser sul cantilever (l&#39;allineamento nel liquido sarà diversa in aria, a causa della variazione dell&#39;indice di rifrazione del mezzo). </li><li> Inserire la punta AFM in una zona pulita del piatto cultura. </li><li> Eseguire la calibrazione dei InvOLS come descritto sopra, per la sensibilità cantilever nell&#39;ambiente liquido. </li></ol> Nota: a) Se le cellule sono coltivate su idrogel, la calibrazione di InvOLS dovrebbe essere eseguita in anticipo contro la superficie inferiore di una piastra di coltura riempito di mezzi di coltura cellulare. Quando si passa a campioni di cellule, una particolare attenzione deve essere pagato per non modificare l&#39;allineamento del fascio laser con il cantilever. b) InvOLS deve essere ricalibrato ogni volta che c&#39;è un cambiamento nella allineamento laser. c) Si raccomanda inoltre di prendere InvOLS come media di valore da diverse curve di calibrazione, since ogni calibrazione genera un diverso InvOLS. La variazione InvOLS è, tuttavia, piccolo rispetto al valore medio. Ad esempio, la calibrazione di un Bruker DNP-10 a sbalzo con la costante 0,06 N / m di liquido da 100 volte primavera produrre un valore medio InvOLS di 66,3 nm / V, con deviazione standard di soli 0,5 nm / V. 3. Raccolta Forza Curve di cellulare indentazione <ol><li> Selezionare una cella per il rientro. Con l&#39;ausilio del microscopio ottico, spostare la fase di posizionare il cantilever sopra la cella in modo che la punta si trova nella regione peri-nuclei. Regolazione precisa della posizione a sbalzo può essere realizzato mediante l&#39;applicazione di offset per il scanner X e Y. Nota: Il cantilever AFM deve essere ritirato dalla superficie del campione, mentre spostando la fase di campionamento per selezionare una cella di destinazione. Questo protegge il cantilever urti tra il campione, poiché la superficie del campione non può essere piatta. </li><li> Passare a forzare la modalità Spettroscopia. Impostare il rientrotasso nell&#39;intervallo di 1-10 micron / sec, sufficientemente basso da evitare effetti idrodinamici. </li><li> Impostare il punto di innesco di deflessione, che limita la forza massima indentazione per evitare danni alle cellule. Selezionare l&#39;opzione triggering relativa, che correggerà eventuali derive nel segnale di deflessione. Una forza massima di 2 nn è un buon punto di partenza per la maggior parte dei campioni. Questo valore, tuttavia, dovrebbe essere regolata in base alla rigidità del campione. Per campioni morbidi un valore inferiore deve essere utilizzato per evitare un eccesso di indentazioni al campione. Per campioni rigidi un valore elevato dovrebbero essere utilizzati per generare indentazione misurabili. </li><li> Impostare la distanza forza sufficientemente grande da garantire che la punta sarà completamente staccato dalla cella tra le misurazioni di forza. Solitamente, la distanza di forza è fissato a 5 micron. </li><li> Comandare l&#39;AFM per prendere una singola curva forza. </li><li> Raccogliere almeno tre curve di forza in diverse località della regione peri-nuclei di ogni cellula. Anche se è utile per prendere multiplacurve su ogni cella di dati statistici affidabili, prendendo troppe curve di forza possono portare a cambiamenti nella rigidità delle cellule a causa di stress dalla sonda AFM. </li><li> Quando la raccolta dei dati è completa, ritirare la punta, e ripetere i passaggi 3,1-3,6 per le celle come necessario per i buoni dati statistici sulla rigidità delle cellule in una determinata condizione di esempio. Solitamente, 30 celle sono misurati per ogni condizione. </li></ol> Per caratterizzare la distribuzione di rigidezza all&#39;interno di una singola cellula, viene applicata la modalità forza-map. Nella modalità Forza-mappa, impostare un formato di scansione per includere la regione di interesse; impostare una risoluzione appropriata, impostare i parametri di rientro di quelli selezionati per curve di spinta singoli; l&#39;AFM sarà poi raster in tutta l&#39;area del campione definito e prendere curve di spinta singoli ad ogni pixel nella regione campione. 4. Analisi dei dati Le curve di forza registrati vengono analizzati utilizzando una procedura MATLAB personalizzato per calcolare la rigidezza cella. Quello che segue è una breve descrizione del procedimento MATLAB: <ol><li> Il programma MATLAB identifica il punto di contatto e coordinate z0 d0 (vedi Figura 1) usando un algoritmo adottato da un metodo pubblicato da Lin et al 29.: </li><li> Per ciascun punto di dati nella curva di forza, eseguire un adattamento lineare dei dati alla sinistra del punto di interesse, e un modello Hertz adatta a destra (utilizzando il punto selezionato come punto iniziale di contatto), fino al set massima indentazione (200-300 nm consigliati). </li><li> Per ogni punto, calcolare l&#39;errore relativo RMS di entrambi convulsioni ed sommare questi valori. </li><li> Il punto che raggiunge l&#39;errore totale minimo raccordo viene selezionata come punto iniziale di contatto. Nota: il tempo di calcolo può essere ridotto mediante l&#39;attuazione di una ricerca d&#39;oro-sezione piuttosto che la scansione lineare tutta la curva forza. </li><li> Esempio di deformazione δ e rientro forza F sono calcolate come: <img alt="Equazione 1"fo: contenuti-width = &quot;3.073in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li> Un raccordo minimi quadrati viene applicato per adattarsi alla F vs dati δ nella regione post-contatto, z ≥ z 0, al modello Hertz per estrarre il modulo di Young, E della cella: <img alt="Equazione 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> , Dove v è il modulo di Poisson. Nota: Quando δ è superiore al 10% dello spessore del campione (altezza cella), la rigidezza cella misurata viene influenzato dalla rigidità del substrato. Lo spessore della regione peri-nucleare è solitamente dell&#39;ordine di pochi micrometri. Pertanto, solo i primi 200-300 nm di F-δ curva si adattano al modello di Hertz. </li></ol>

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<li>Wen, Q., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+physics+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Solid+State+%26+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Polymer physics of the cytoskeleton.</a> Current Opinion in Solid State & Materials Science. 15, 177-182 (2011).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (44), e2072(2010).</li>
<li>Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di indentazione AFM ha vantaggi per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi. Seppur meno sensibile della citometria a torsione magnetica e pinzette ottiche, in grado di misurare le forze a livello piconewton 32, l&#39;AFM in grado di rilevare la forza di resistenza da campioni che vanno da decine di pico-Newton a centinaia di nano-Newton, paragonabili a spaziare di forza che può essere applicato a cellule usando una micropipetta 19. Questo intervallo di forza adatta alle...

Proprietà meccaniche, in particolare rigidità, di singole cellule e loro matrici extracellulari circostanti (ECM) sono fondamentali per molti processi biologici che comprendono la crescita cellulare, la motilità, divisione, differenziazione e omeostasi tissutale. 1 È stato dimostrato che cellule rigidità meccanica è determinata principalmente dalla il citoscheletro, specialmente le reti di actina e filamenti intermedi e altre proteine ​​ad essi associati. 2 risultati di prove meccaniche su reti in vitro di actina e filamenti intermedi suggeriscono che la meccanica delle cellule dipende in gran parte la struttura del citoscheletro e la pre-stress in il citoscheletro. 3-5 Rigidità di cellule vive è quindi considerato come un indice per valutare la struttura del citoscheletro 6, 7 attività miosina e molti altri processi cellulari. Ancora più importante, i cambiamenti nelle proprietà meccaniche delle cellule sono spesso trovati ad essere strettamente associatiato con diverse condizioni di malattia come la formazione di tumori e metastasi 8-10 Monitoraggio della rigidità meccanica delle cellule viventi può quindi fornire un nuovo modo di monitorare la fisiologia cellulare,. di rilevare e diagnosticare le malattie 8;. ed a valutare l&#39;efficacia dei trattamenti farmacologici 11 , 12 Metodi multipli comprese microrheology particella-tracking, 13-16 torsione magnetica citometria, 17 micropipetta aspirazione 18,19 e micropenetrazione 20-22 sono stati sviluppati per misurare l&#39;elasticità delle cellule. Particella di monitoraggio microrheology ripercorre le vibrazioni termiche di entrambi particelle fluorescenti inferiori al micron iniettati in cellule o marcatori fiduciali all&#39;interno del citoscheletro delle cellule. 23 proprietà elastiche e viscose di cellule sono calcolati gli spostamenti delle particelle misurate usando il teorema di fluttuazione-dissipazione. 14,23 Questo metodo permette di misurazioni simultanee di localeproprietà meccaniche con alta risoluzione spaziale in luoghi diversi in una cella. Tuttavia, l&#39;iniezione di particelle fluorescenti in cellule può portare a cambiamenti nella funzione cellulare, la struttura del citoscheletro, e quindi la meccanica delle cellule. Il metodo di aspirazione micropipetta applica pressione negativa in una micropipetta di diametro compreso tra 1 e 5 um succhiare un piccolo pezzo di membrana cellulare nella pipetta. Cella rigidezza viene calcolata dalla pressione negativa applicata e deformazione della membrana cellulare. 18 Questo metodo, tuttavia, non può rilevare la distribuzione eterogenea della rigidezza attraverso la cella. Citometria torsione magnetica (MTC) applica campo magnetico per generare coppia sulla super-perline paramagnetiche attaccati alla membrana cellulare. 17 Cella rigidezza è derivato in questo metodo dal rapporto tra la coppia applicata e la deformazione torsione della membrana cellulare. È difficile controllare la posizione di perline magnetiche nel metodo MTC, ed è anche challenging per caratterizzare la deformazione torsione con alta risoluzione. Micropenetrazione applica un penetratore con geometrie ben definite a pugni nella cella. La forza di rientro e il rientro risultato cellule seguono spesso la previsione del modello Hertz. Di Young dei moduli delle celle può essere calcolata dalle curve forza indentazione dotandoli al modello Hertz. Questo metodo è stato ampiamente applicato per testare le proprietà meccaniche del tessuto e di cellule dispetto delle sue limitazioni quali l&#39;incertezza nella determinazione contatto puntiforme, applicabilità del modello Hertz, e il potenziale di danneggiare fisicamente le cellule. Tra i molti dispositivi per microindentaion 20, il microscopio a forza atomica (AFM) è disponibile in commercio ed è stato ampiamente applicato per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule e tessuti viventi 21,24-27. Questo documento dimostra la procedura di utilizzo di un asilo MFP3D-Bio AFM per la caratterizzazione meccanica delle cellule. AFM non suly fornisce topografia ad alta risoluzione di cellule, ma anche è stato ampiamente applicato per caratterizzare le proprietà meccaniche delle cellule dei tessuti. Il principio della AFM indentazione è illustrato in Figura 1. Il cantilever AFM avvicina alla cella da pochi micrometri sopra; fa contatto con la cellula; trattini la cella in modo che la flessione della leva raggiunge un punto di regolazione preselezionata; e tira via dalla cella. Durante questo processo la flessione della leva viene registrata come funzione della sua posizione come mostrato nella Figura 1. Prima di prendere contatto con la cellula, il cantilever muove nel medio senza alcuna deviazione apparente. Quando rientro in cella, le curve a sbalzo e di aumento del segnale di deflessione. I cantilever sono modellati come travi elastica in modo che la loro deflessione è proporzionale alla forza applicata alla cella. Impostando la massima flessione della leva, la grandezza massima della forza applicata al campione viene limitata per evitare dAMAGE alle cellule. La porzione della curva di forza dal punto B al punto C in figura 1, dove i trattini punta nella cellula, viene adattata al modello hertz per estrarre la rigidità cella. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> Figura 1. Illustrazione di AFM micropenetrazione e l&#39;interpretazione della curva di forza. Il pannello superiore mostra il movimento del cantilever AFM guidato dallo scanner piezoelettrico. La posizione verticale della mensola z e flessione della leva segnale d viene registrato durante il processo. Il cantilever parte da un punto, di pochi micrometri sopra la cella. Mentre si avvicina la cella, la rientranza δ campione rimane zero fino a raggiungere il punto b, in cui la punta viene a contatto con la cellula. Le coordinate del punto b nel grafico sono valori criticiper l&#39;analisi dei dati, indicato con (z 0, d 0&gt;). Da B a C, i trattini sbalzo nella cella finché flessione della leva raggiunge un punto di regolazione, che è impostato per essere il rapporto tra la forza massima indentazione mirata e la costante elastica cantilever. Una volta che il segnale di deflessione raggiunge il valore massimo prestabilito, il cantilever viene poi ritirato dalla cella a punto d, dove spesso viene tirata verso il basso a causa di punta-campione adesione, stacca dalla cella e ritorna alla sua posizione iniziale a e. Il pannello destro mostra la relazione tra la rientranza e la z registrata e segnale d. In sul pannello di sinistra inferiore è un diagramma di una curva rappresentativa forza, il rientro massimo di un cantilever, la cui costante elastica è misurata essere 0.07N / m, è impostato per essere 17 nm, in modo che la forza massima applicata al rientro campione è 1,2 nN. Le posizioni chiave durante il rientro sono contrassegnati.

<table><tbody><tr><td>microscopio a forza atomica </td><td>per la ricerca sull'asilo</td><td>MFP3D-BIO</td><td></td></tr></tbody></table>

misurare le proprietà meccaniche del living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Proprietà meccaniche delle cellule e la matrice extracellulare (ECM) svolgono un ruolo importante in molti processi biologici tra cui la differenziazione di cellule staminali, la formazione del tumore, e la guarigione delle ferite. Cambiamenti nella rigidità delle cellule e ECM sono spesso segni di cambiamenti nella fisiologia o malattie nei tessuti delle cellule. Quindi, rigidità cellula è un indice per valutare lo stato di colture cellulari. Tra la moltitudine di metodi applicati per misurare la rigidità di cellule e tessuti, micro-indentazione usando un microscopio a forza atomica (AFM) fornisce un modo per misurare in modo affidabile la rigidità delle cellule viventi. Questo metodo è stato ampiamente applicato per caratterizzare la rigidezza micro-scala per una varietà di materiali, tra cui superfici metalliche a tessuti biologici molli e cellule. Il principio di base di questo metodo è di rientrare una cella con una punta AFM di geometria selezionata e misurare la forza applicata dalla flessione del cantilever AFM. Montaggio della curva forza-indentazione per la modalità di Hertzl per la corrispondente geometria della punta può dare misure quantitative di rigidezza materiale. Questo documento illustra la procedura per caratterizzare la rigidezza delle cellule viventi mediante AFM. Passaggi chiave, tra cui il processo di AFM calibrazione, acquisizione forza-curva, e l&#39;analisi dei dati utilizzando una routine di MATLAB sono dimostrati. Vengono anche discussi limiti di questo metodo.

La figura 2a mostra tre curve di forza rappresentativi tratti da fibroblasti 3T3 in coltura su superficie di plastica, gel di poliacrilammide di moduli di Young 3.000 Pa e 17.000 Pa, rispettivamente. Dopo aver identificato con attenzione i punti di contatto delle curve, la forza di rientro in funzione della deformazione delle cellule è tracciata in Figura 2b. Sotto una forza di grandezza inferiore a 0,3 nN, una piramide forma della punta del trattini 3 micrometri in una cellula in coltu...

Questo documento illustra un protocollo per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi mediante micropenetrazione utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare il modulo elastico di cellule vive utilizzando un microscopio a forza atomica. Questo viene ottenuto innanzitutto eseguendo misurazioni di spettroscopia di forza in modalità FM in diverse posizioni sulla cellula. Come secondo passaggio, ogni curva forza-distanza viene analizzata per determinare il punto in cui la punta in modalità FM entra inizialmente in contatto con la cellula.Successivamente, a partire dal punto di contatto, i primi 200-300 nanometri di dati di indentazione vengono adattati al modello di Hertz. Per estrarre il modulo elastico, i risultati forniscono una mappa 2D della rigidità cellulare ottenuta mediante la modalità di mappatura della forza, in cui ogni pixel rappresenta una singola curva forza-distanza. A dimostrare la procedura sarà Guen Thomas, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, pulire il portacantilever con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare.Quindi caricare una mensola bru DNP 10 nell'A FM seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, calibrare la sensibilità del leva ottica inversa. Questo parametro descrive l'entità della risposta del fotodiodo in volt per nanometro di deflessione della mensola.Per eseguire questa operazione, posizionare innanzitutto un vetrino pulito sullo stage del campione. Installare la testina AFM e regolare il fascio laser e l'allineamento secondo le istruzioni del produttore. Una volta completato l'allineamento, portare la punta AFM a contatto con il vetrino con il P eight O ritratto.Riposizionare lo specchio in modo da ottenere una lettura del fotodiodo di meno due volt. Quindi eseguire una misurazione di spettroscopia a forza con una risposta massima del fotodiodo o punto di attivazione di più due volt. Al termine dell'acquisizione dei dati, eseguire uno zoom sulla regione di contatto stabile della curva di forza ed effettuare un adattamento lineare a questa regione.Per trovare la pendenza in volt per nanometro, quindi ripristinare l'allineamento dello specchio a una deflessione libera di zero volt. Successivamente, calibrare la costante elastica della mensola utilizzando il metodo di taratura termica descritto da Levy e Malam. Per iniziare, sollevare lo scanner lontano dallo stadio del campione in modo che non vi siano interazioni tra la punta e il campione.Quindi acquisire i dati termici registrando la vibrazione termica della trave in cantilever. Il software AFM analizza lo spettro di potenza di tale vibrazione termica e lo rappresenta in una finestra di dati. Successivamente, eseguire un adattamento del segmento di dati centrato alla frequenza più bassa, nota anche come picco di risonanza fondamentale, per determinare la costante elastica.Per preparare un microscopio a forza atomica (FM) per le piastre di coltura, installare un accessorio riscaldante per piastre sulla piattaforma del FM e impostare la temperatura a 37 gradi Celsius. Attendere 20 minuti affinché il sistema raggiunga un equilibrio termico stabile. Una volta preriscaldato, posizionare una piastra di coltura sulla piattaforma del FM e fissarla utilizzando la pinza fornita con il riscaldatore per piastre; per misurazioni di durata superiore a 30 minuti, si dovrebbe utilizzare un mezzo indipendente dal biossido di carbonio al posto del mezzo di coltura normale.Successivamente, applicare una piccola goccia di mezzo di coltura a 37 gradi Celsius sulla punta del cantilever AFM e abbassare la testa AFM fino a quando la punta è appena immersa nel liquido. Utilizzando una telecamera CCD con vista dall'alto, riallineare il fascio laser sul cantilever. L'allineamento nel liquido sarà diverso rispetto all'aria a causa del cambiamento dell'indice di rifrazione del mezzo.Dopo l'allineamento, posizionare la punta AFM su un'area della piastra di coltura priva di cellule ed eseguire la calibrazione della sensibilità del leva ottica inversa nell'ambiente liquido. Per iniziare le misurazioni delle proprietà meccaniche delle cellule, posizionare la punta della mensola sopra la regione dell'occhio perlaceo di una cellula con l'aiuto di un microscopio ottico. Regolazioni precise della posizione della mensola si ottengono applicando offset ai scanner X e Y.Quindi passare l'AFM alla modalità di spettroscopia in forza e impostare la velocità di indentazione a cinque micrometri al secondo, un valore sufficientemente basso da evitare effetti idrodinamici. Successivamente, impostare il punto di attivazione della deflessione a due nano newton. Per evitare di danneggiare le cellule, regolare questo valore in base alla rigidità del campione.Inoltre, selezionare l'opzione di triggering relativo, che correggerà eventuali deriva del segnale di deflessione. Impostare quindi la distanza di forza a cinque micrometri per garantire che la punta si stacchi completamente dalla cellula tra una misurazione di forza e l'altra. Acquisire tre curve di forza in posizioni diverse nella regione nucleare di almeno 30 cellule per ogni condizione.Sebbene sia utile acquisire più curve su ciascuna cellula, per ottenere dati statistici affidabili, prelevare un numero eccessivo di curve può indurre variazioni nella rigidità cellulare a causa dello stress provocato dalla sonda AFM. Caratterizzare ulteriormente la distribuzione delle proprietà meccaniche all'interno di una singola cellula utilizzando la modalità mappa di forza.In modalità mappa di forza, impostare la dimensione della scansione a 30 micrometri, la risoluzione a 32 per 32 e i parametri di indentazione uguali a quelli selezionati per le singole curve di forza. L'AFM acquisirà quindi singole curve di forza in corrispondenza di ciascun pixel della regione del campione e fornirà una mappa di rigidità dell'intera area. Successivamente, analizzare le curve di forza registrate utilizzando MATLAB per calcolare la rigidità cellulare.Iniziare adottando un algoritmo pubblicato per la prima volta da Lynette Al, che calcola sia un adattamento lineare sia un adattamento di Hertz da ciascun punto utilizzando Matlab. Calcolare l'errore RMS relativo di entrambi gli adattamenti e sommare questi valori in ciascun punto. Il punto che presenta l'errore di adattamento totale minimo viene selezionato come punto iniziale di contatto; individuare questo punto è fondamentale per una misurazione accurata del modulo di Young della cellula.Successivamente, calcolare la deformazione del campione delta. Utilizzando le seguenti equazioni, la deformazione è pari a zero prima del contatto con la cellula, dove Z è minore di Z zero, ed è uguale alla differenza tra la deflessione della mensola D e la distanza totale Z oltre il punto di contatto. Quindi, calcolare la forza di indentazione F mediante le seguenti equazioni, in cui la forza è pari a zero prima del contatto con la cellula, dove Z è minore di Z zero, ed è uguale alla costante elastica K della mensola moltiplicata per la deflessione della mensola oltre il punto di contatto.Successivamente, l'adattamento di Elise square viene applicato ai dati di deformazione del campione in funzione della forza di indentazione nella regione post-contatto del modello di Hertz, al fine di ricavare il modulo di Young della cellula in base alla forma della punta utilizzata, mostrata qui. Di seguito sono riportate curve di forza rappresentative ottenute da tre cellule di fibroblasti T3 coltivate su tre superfici diverse. Come si può osservare, superfici diverse possono influenzare notevolmente la rigidità del citoscheletro cellulare.La deformazione media delle cellule coltivate su una superficie rigida in plastica è mostrata in rosso. Quelle cresciute su un gel di poli acrilammide rigido sono mostrate in viola, e quelle cresciute su un gel di poli acrilammide elastico sono mostrate in blu. Dopo aver identificato con attenzione i punti di contatto nelle curve, le forze di indentazione in funzione della deformazione cellulare possono essere rappresentate con precisione.Inoltre, il loro modulo di Young può essere calcolato con precisione dai primi 300 nanometri di indentazione dopo il contatto. Qui è mostrato un fibroblasto che è stato trasfettato con la proteina verde fluorescente marcata con la mentonina, un tipo di filamento intermedio. Più luminosa è l'immagine, maggiore è la quantità di mentonina presente in quella regione.Questo può essere correlato alla rigidità del citoscheletro cellulare. Utilizzando la tecnica di mappatura della forza AFM presentata qui, è possibile ottenere una mappa simile della rigidità di un fibroblasto con una risoluzione di 32 per 32 pixel, in cui ogni pixel rappresenta un'area superficiale cellulare di 2,5 per 2,5 micron. Dopo aver visto questo video, si avrà una buona idea su come utilizzare la microscopia a forza atomica per misurare l'elasticità delle cellule dei tessuti viventi.

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Questo lavoro si propone di istruire il lettore al funzionamento di un sistema integrato di forza atomica-microscopio ottico di imaging per la stimolazione meccanica delle cellule vive nella cultura. Un passo-passo il protocollo viene presentato. Un insieme rappresentativo di dati che mostra dal vivo risposta alla stimolazione meccanica delle cellule è presentato.

Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica

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Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola

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Questo protocollo mira ad automatizzare le misurazioni AFM su centinaia di cellule microbiche. In primo luogo, i microbi vengono immobilizzati nelle microstrutture di francobolli PDMS e quindi le misurazioni della spettroscopia di forza vengono eseguite automaticamente su centinaia di cellule immobilizzate.

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Qui è presentato il protocollo della tecnica Conpokal, che combina microscopia a forza confocale e atomica in un'unica piattaforma di strumenti. Conpokal fornisce la stessa cellula, la stessa regione, vicino all'imaging confocale simultaneo e alla caratterizzazione meccanica di campioni biologici vivi.

Microscopia confocale e a forza atomica (Conpokal) quasi simultanea su cellule vive

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le proprietà meccaniche intracellulari di cellule embrionali isolate di zebrafish in confinamento tridimensionale con misurazione della forza diretta mediante una trappola ottica.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

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Caratterizzazione delle proprietà meccaniche della parete cellulare primaria in organi vegetali viventi mediante microscopia a forza atomica

La quantificazione dell'area di contatto e della forza applicata dalla punta di una sonda a forza atomica (AFM) su una superficie del campione consente la determinazione delle proprietà meccaniche su scala nanometrica. Vengono discusse le migliori pratiche per implementare la nanoindentazione basata su sbalzo AFM in aria o fluido su campioni morbidi e duri per misurare il modulo elastico o altre proprietà nanomeccaniche.

Microscopia a forza atomica Nanoindentazione basata su sbalzo: misure di proprietà meccaniche su scala nanometrica in aria e fluido

Impara a misurare il modulo elastico di cellule viventi mediante microscopia a forza atomica e spettroscopia di forza. Questo metodo consente di generare mappe 2D della rigidità cellulare per studi di biomeccanica.

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

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