Microscopia a forza protrusione: Un metodo per quantificare le forze sviluppate dalla cella sporgenze

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le forze di protrusione utilizzando la microscopia a forza atomica. Ciò si ottiene preparando prima le griglie rivestite di formula e misurando lo spessore di questo film. La terza fase di questo processo consiste nel posizionare le celle sulle griglie e lasciarle aderire.

La fase finale della procedura consiste nell'visualizzare il film di forma sotto le cellule utilizzando la microscopia a forza atomica. Quando aderiscono al substrato, i microfagi formano strutture di adesione submicrometriche chiamate podosomi. In definitiva, la deformazione del film utilizzato dai podosomi sarà quantificata e convertita in forze utilizzando un modello meccanico fatto in casa.

Posizionare una luce di vetro pulita con etanolo nel dispositivo di colata del film dell'imbuto e coprire la parte superiore dell'imbuto. Versare la soluzione di fomvar nell'imbuto fino a raggiungere i due terzi del vetrino. Lasciarlo agire per un minuto, quindi scolare la soluzione di formvar in un flusso costante.

Si noti che lo spessore del film dipende sia dalla velocità di flusso che dalla concentrazione della soluzione di formvar. Asciuga questa luce in modo scuro e ritaglia dei rettangoli con una lama di rasoio affilata. Immergi il vetrino nel becher riempito di acqua distillata in modo che la pellicola di fomvar galleggi sulla superficie dell'acqua.

Posizionare con cura le griglie pulite con acetone sulle pellicole, lucide a faccia in su con un vetrino coprioggetto di 12 millimetri di diametro sopra alcune di esse. Saranno utilizzati per l'esperimento di valutazione dello spessore. Alla fine immergi un vetrino coperto di adesivo per recuperare l'intera pellicola e le griglie.

Delineare il vetrino coperto con una pinzetta per tagliare il formvar e staccarlo dal vetrino. Monta la posizione della griglia sotto il vetrino coperto, quindi delinea la griglia con una pinzetta per estrarla. Il foro nel film di fomvar così creato verrà ripreso per misurarne lo spessore.

Montare un cont di nitrato di silicio erogato nel blocco di vetro AFM assicurandosi che la striscia dorata non sia sotto la punta della molla. Montare il blocco di vetro sul modulo AFM, quindi posizionare quest'ultimo sul tavolino del microscopio. Posizionare il vetrino coprioggetto rivestito in fomvar sulla camera di osservazione con PBS sulla parte superiore.

Scansiona il confine tra fomvar e vetro in modalità contatto e con un punto di 0,5 nano newton. Nel software di elaborazione dati, utilizzare la superficie del vetro come riferimento in altezza e misurare lo spessore della superficie sulla sezione trasversale. Sotto un cappuccio sterile, prendi un vetrino coprioggetto da 12 millimetri e incollaci sopra una striscia di nastro adesivo.

Delinea la griglia rivestita in fomavr con una pinzetta e posizionala lucida a faccia in su in modo che solo i lati si attacchino all'adesivo. Questo per evitare che il fomvar venga strappato quando si rimuove la griglia dal nastro. Posizionare la striscia di copertura in una piastra sterile a sei pozzetti e convogliare una goccia di 10 millimetri di terreno di coltura privo di siero.

Dovrebbe contenere circa 10 mila cellule e in questo caso si tratta di microfagi differenziati dai monociti umani. Assicurati di non toccare la griglia con la punta del piper durante il processo, in modo da non danneggiare il rivestimento fomvar. Incubare per mezz'ora per far aderire le cellule, quindi riempire il pozzetto con il siero integrato e incubare di nuovo per due ore, prima dell'osservazione AFM.

Posiziona due strisce parallele di nastro biadesivo su una capsula di Petri con fondo di vetro, assicurandoti che la larghezza tra di loro sia leggermente inferiore rispetto al diametro della griglia. Quindi staccare la griglia precedentemente seminata con le celle e posizionarla sopra le due strisce di nastro adesivo con le celle rivolte verso il basso. Fissare la griglia posizionando altre due strisce sopra quelle precedenti.

Riempire il piatto con terreno di coltura preriscaldato integrato con hepe. Posizionare la pirofila nello scaldapiatti precedentemente impostato a 37 gradi centigradi. Installare il set sul palco AFM.

Quando la temperatura del sistema è stabile a 37 gradi centigradi, procedere alla scansione della superficie del fomvar, che deve essere eseguita in modalità di contatto, con un set point di 0,95 nano newton e visualizzare le deformazioni associate ai protozoi sulla finestra di visualizzazione dei dati di deflessione. Ecco i risultati rappresentativi e le fasi di elaborazione per produrre formazioni con AFM per le misurazioni grafiche. Come si può vedere in questa immagine, vengono rilevati rigonfiamenti sulla superficie del fomvar.

Per convertire queste informazioni fotografiche in valori di forza è necessario prima avere accesso alla differenza di forza locale. Per fare ciò, un adattamento polinomiale di terzo grado deve essere sottratto alla sua linea di scansione in modo indipendente. Quindi l'uso di un algoritmo di immagini dedicato fatto in casa consente di valutare i valori della forza di protrusione dalla mappa dell'altezza AFM e dal modello meccanico della protrusione mediata dai protozoi.

Grazie a questa procedura, siamo in grado di studiare i meccanismi coinvolti nella generazione della forza di protrusione nei protozoi. Grazie per aver guardato e buona fortuna per i tuoi esperimenti.