Name: Microscopia a forza protrusione: Un metodo per quantificare le forze sviluppate dalla cella sporgenze (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Scopri la microscopia a forza atomica per quantificare le forze di protrusione esercitate dai podosomi su film flessibili. Questo metodo consente di analizzare la deformazione del film e convertirla in valori di forza mediante un modello meccanico.

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Gli autori sono grati ad Anna Labernadie, Guillaume Charrière e Patrick Delobelle per il loro contributo iniziale di questo lavoro e di Matthieu Sanchez e Françoise Viala per il loro aiuto con riprese video e montaggio. Quest'opera è stata sostenuta dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM piano cancro, Fondation Tolosa e Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).

1. preparazione di griglie rivestite con Formvar
<ol><li>Pulire le griglie di microscopia elettronica con acetone puro e farle asciugare su carta da filtro. Quindi pulire un vetrino da microscopio con etanolo puro, pulire con una carta per lenti e rimuovere la polvere con un soffietto.</li>
	<li>Posto un vetrino pulito etanolo verticalmente nell'imbuto di un dispositivo di fusione pellicola contenente una soluzione di Formvar nella parte inferiore. Coprire la parte superiore dell'imbuto.</li>
	<li>Con la lampadina atomizzatore pompa 100 mL di soluzione di Formvar (0,5%, dicloruro di etilene) fino a quando il livello raggiunge due terzi della diapositiva.</li>
	<li>Mantenere il vetrino nella soluzione per 1 min.</li>
	<li>Aprire la valvola del dispositivo per drenare la soluzione di Formvar in un flusso costante. Una portata di 10 a 15 mL/s produrrà un film Formvar di 30-80 nm. Lo spessore del film è determinato dalla concentrazione della soluzione Formvar e per il tasso di drenaggio. Nota: Il tasso di drenaggio può essere controllata scaricando la pressione tramite la valvola aria aprendo lentamente la valvola. Il più veloce il drenaggio, il più spesso il film. In pratica, perché è difficile da predire lo spessore del film dalla portata Formvar, prepariamo diversi lotti di Formvar film e controllare il loro spessore di AFM (vedi passo 2).</li>
	<li>Rimuovere il vetrino dalla camera e asciugarlo delicatamente su carta da filtro per rimuovere qualsiasi liquido Formvar.</li>
	<li>Tagliare un rettangolo di 20 x 50 mm dal film Formvar con una lama di rasoio.</li>
	<li>Riempire un bicchiere con acqua distillata e immergersi lentamente la diapositiva verticalmente in acqua per galleggiare fuori la pellicola: il film deve galleggiare sulla superficie dell'acqua.</li>
	<li>Luogo asciutto pulito acetone griglie sulla pellicola, splendente verso l'alto.</li>
	<li>Posizionare un coprioggetto in vetro tondo (Ø 12 mm) su alcune delle griglie. Questo vetrino coprioggetti servirà a misurare lo spessore del film (vedi passo 2).</li>
	<li>Coprire un vetrino da microscopio con un adesivo bianco ridimensionato per adattarlo. Immergere la diapositiva verticalmente al bordo del film Formvar galleggiante fino a quando l'intero film aderisce alla diapositiva. Rimuovere l'acqua in eccesso dal vetrino con carta da filtro e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente per una notte.</li>
</ol>2. misurazione dello spessore del Film
<ol><li>Tagliare il Formvar intorno il coprioggetto con pinzette per staccarlo dalla diapositiva.</li>
	<li>Segnare la posizione della griglia sotto il vetrino coprioggetto con una penna.</li>
	<li>Tagliare il Formvar intorno alla griglia contrassegnata per staccarla dal vetrino coprioggetti. Pertanto non vi sarà un buco nello strato Formvar rimanente, che verranno permetterà di misurare lo spessore del film. Coprire il vetrino coprioggetto con PBS e collocarla su un vetrino sul microscopio.</li>
	<li>Montare un cantilever di nitruro di silicio sul mattone di vetro AFM, assicurandosi che la striscia dorata non è coperto dalla punta della molla. Nota: La sensibilità e la costante elastica del cantilever dovrebbe avere precedentemente stati calibrati in PBS.</li>
	<li>Montare il blocco di vetro sul modulo del AFM e quindi posizionare il modulo sul microscopio.</li>
	<li>Collocare il vetrino coprioggetto rivestite con Formvar sulla camera di osservazione e coprirlo con 500 µ l di PBS.</li>
	<li>Il bordo del foro nel foglio Formvar utilizzando AFM in modalità di contatto e un punto di regolazione forza di 0,5 nN la scansione.</li>
	<li>Utilizzare la superficie del vetrino coprioggetti di vetro come il riferimento per misure di altezza e valutare lo spessore di Formvar come l'altezza della sezione trasversale (eseguire almeno 10 misurazioni per ogni batch di Formvar).</li>
</ol>3. cellule su griglie di semina
<ol><li>Sotto una cappa sterile, mettere una striscia (12 x 3 mm) del nastro bi adesivo su un vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Tagliare una griglia Formvar-rivestito con pinzette e metterlo a testa in giù sulla striscia adesiva (solo il bordo della griglia deve essere attaccata al nastro). Il film di Formvar deve affrontare il vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Mettere il dispositivo in una cultura ben.</li>
	<li>Mettere una goccia di 10 µ l di RPMI senza FCS contenente 104 macrofagi differenziati da monociti umani16. Nota: Assicurarsi di non toccare la griglia con la punta della pipetta per evitare di danneggiare il rivestimento di Formvar.</li>
	<li>Incubare per 30 min (37 ° C, 5% CO2) che le cellule aderiscono.</li>
	<li>Riempire il pozzo con 2 mL di RPMI contenente 10% FCS.</li>
	<li>Incubare il dispositivo per 2 ore a 37 ° C e 5% di CO2 di lasciare le cellule aderiscono prima osservazione AFM.</li>
</ol>4. topografia misure delle deformazioni indotte da Podosome
<ol><li>Attaccare due strisce di raddoppiato-nastro biadesivo su un fondo di vetro capsula di Petri. Nota: La distanza tra le due strisce dovrebbe essere inferiore al diametro di griglia.</li>
	<li>Staccare con cura la griglia placcata con macrofagi dal nastro adesivo.</li>
	<li>Capovolgere la griglia al fine di avere le cellule rivolto verso il vetro e la griglia tra le due strisce adesive di bastone.</li>
	<li>Correzione della griglia con due nuove strisce di adesivo raddoppiato: la griglia sarà così essere intramezzata fra due strisce adesive, lasciando l'area centrale della griglia accessibile a punta dell'AFM. Nota: Assicurarsi che la griglia è ben fissata e non attorcigliata; altrimenti il cantilever AFM potrebbe non essere in grado di avvicinarsi alla superficie di Formvar.</li>
	<li>Riempire la capsula di Petri con 2 mL di terreno di coltura pre-riscaldata 37 ° C (RPMI con 10% FCS) completati con 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	<li>Posizionare la piastra di coltura su un riscaldatore di piatto di 37 ° C.</li>
	<li>Installare il riscaldatore di piatto sul palco AFM.</li>
	<li>Lasciare che il sistema si stabilizza a 37 ° C.</li>
	<li>In modalità a contatto con una forza di 0,5 nN, fare una prima immagine globale per individuare podosomes e poi la scansione la topografia di Formvar a 3 Hz con un circa 20 nm-grande pixel. Nota: Evitare l'analisi vicino ai bordi della griglia.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
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<li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory%2FEffector+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li>
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<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

Conflitti di interesse non dichiarati.

Proprietà del materiale
La scelta del materiale per la membrana deformabile, nel nostro caso Formvar, deve soddisfare alcuni requisiti. Il materiale deve essere trasparente alla luce visibile e presentano fluorescenza auto limitato per consentire osservazioni in campo chiaro e microscopia a fluorescenza. La rugosità del film sottile deve essere ben di sotto di 10 nm per evitare qualsiasi effetto topografica su adesione delle cellule e per consentire la chiara osservazione dell...

Cellule animali interagiscono fisicamente con la matrice e le altre cellule che costituiscono il loro ambiente1. Ciò è necessario per loro di migrare, interiorizzare corpi, acquisire informazioni esterne o differenziare. In tali processi, la cella deve generare forze meccaniche e, come numerosi studi hanno dimostrato negli ultimi anni, la capacità di una cellula di generare forze e sonda ambiente influenza il comportamento biologico, dirigendo per esempio proliferazione o differenziazione2,3. A sua volta, la misurazione delle forze cellulare è un aiuto importante per studiare la regolazione della forza di generazione e capire la sua implicazione nella cella comportamento e tessuto destino4,5.
Ultimi anni hanno visto lo sviluppo di numerose tecniche per misurare le forze che una cella può esercitare sul suo ambiente6. La maggior parte di questi è stati strumentale nel rivelare che la trazione delle forze che cellule esercitano come si tirano su sonde mobili o un substrato deformabile. Tuttavia, le forze meccaniche coinvolte in protrusione nell'ambiente extracellulare soffrono di una mancanza di tecniche di misurazione e sono fino ad oggi non è ben caratterizzato.
Per ovviare a questa limitazione, presentiamo un metodo per misurare forze esercitate ortogonalmente al substrato. Essa consiste nella placcatura cellule viventi in un sottile foglio elastico che può deformare in direzione ortogonale, che permette di misurare la deformazione di substrato dalle cellule e dedurre le forze coinvolte. Topografia di substrato è misurata con risoluzione nanometrica mediante microscopia a forza atomica e la valutazione delle forze di deformazione si basa sulla conoscenza della geometria delle strutture cellulari protrusiva7,8, 9.
Qui, descriviamo l'installazione e la sua applicazione per misurare le forze generate dal podosomes, strutture di adesione protrusiva formate dai macrofagi per la loro migrazione mesenchimale in ambienti tridimensionali10,11, 12,13,14,15,16,17. Noi crediamo che questa tecnica avanzerà la comprensione della creazione delle forze e la sua regolamentazione in molti processi cellulari che coinvolgono la protrusione.

<table><tbody><tr><td>Griglie in nichel da 200 mesh Microscopia</td><td>elettronica Sciences</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>Adesivi bianchi 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di colata di film con valvola in uscita</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Razorblades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 0,5% soluzione in dicloruro di etilene</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 mm vetrini coprioggetti</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Microscopio a forza atomica Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Porta campioni a temperatura controllata&nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever in nitruro di silicio con una costante nominale della molla di 0,01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Nastro biadesivo</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Petri con fondo in vetro da 35 mm</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia a forza protrusione: un metodo per quantificare le forze sviluppate dalla cella sporgenze

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerosi contesti biologici, cellule animali hanno bisogno di interagire fisicamente con il loro ambiente attraverso lo sviluppo di forze meccaniche. Tra questi, le forze di trazione sono stati ben caratterizzate, ma c'è una mancanza di tecniche che permettono la misurazione delle forze protrusione esercitata dalle cellule ortogonalmente al loro substrato. Abbiamo progettato un setup sperimentale per misurare le forze di protrusione esercitate dalle cellule aderenti il loro substrato. Cellule piastrate su un foglio di Formvar compatibile con questo substrato di deformazione e la topografia risultante è mappata per microscopia a forza atomica (AFM) su scala nanometrica. I valori di forza vengono quindi estratti da un'analisi del profilo deformazione basato sulla geometria delle strutture cellulari protrusive. Quindi, le forze esercitate dalle singole unità sporgente di una cellula vivente possono essere misurate nel tempo. Questa tecnica consentirà lo studio della generazione di forza e la sua regolamentazione in molti processi cellulari che coinvolgono la protrusione. Qui, descriviamo la sua applicazione per misurare le forze protrusive generate da podosomes formata dai macrofagi umani.

Il protocollo di cui sopra viene descritto come preparare la messa a punto sperimentale di quantificare le forze di protrusione applicate dal macrofago podosomes su un substrato di Formvar. Questa operazione viene eseguita mediante AFM ed è illustrata nella Figura 1.
Quando si analizza un'immagine topografica di rigonfiamenti sotto podosomes utilizzando il software di elaborazione dati JPK, un polin...

Qui, abbiamo dettaglio le tecniche sperimentali utilizzate per valutare le forze di protrusione che podosomes si applicano su una pellicola compatibile, dalla preparazione del film per l'analisi automatizzata delle immagini topografiche.

Microscopia a forza protrusione: Un metodo per quantificare le forze sviluppate dalla cella sporgenze

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le forze di protrusione utilizzando la microscopia a forza atomica. Ciò si ottiene preparando prima le griglie rivestite di formula e misurando lo spessore di questo film. La terza fase di questo processo consiste nel posizionare le celle sulle griglie e lasciarle aderire.La fase finale della procedura consiste nell'visualizzare il film di forma sotto le cellule utilizzando la microscopia a forza atomica. Quando aderiscono al substrato, i microfagi formano strutture di adesione submicrometriche chiamate podosomi. In definitiva, la deformazione del film utilizzato dai podosomi sarà quantificata e convertita in forze utilizzando un modello meccanico fatto in casa.Posizionare una luce di vetro pulita con etanolo nel dispositivo di colata del film dell'imbuto e coprire la parte superiore dell'imbuto. Versare la soluzione di fomvar nell'imbuto fino a raggiungere i due terzi del vetrino. Lasciarlo agire per un minuto, quindi scolare la soluzione di formvar in un flusso costante.Si noti che lo spessore del film dipende sia dalla velocità di flusso che dalla concentrazione della soluzione di formvar. Asciuga questa luce in modo scuro e ritaglia dei rettangoli con una lama di rasoio affilata. Immergi il vetrino nel becher riempito di acqua distillata in modo che la pellicola di fomvar galleggi sulla superficie dell'acqua.Posizionare con cura le griglie pulite con acetone sulle pellicole, lucide a faccia in su con un vetrino coprioggetto di 12 millimetri di diametro sopra alcune di esse. Saranno utilizzati per l'esperimento di valutazione dello spessore. Alla fine immergi un vetrino coperto di adesivo per recuperare l'intera pellicola e le griglie.Delineare il vetrino coperto con una pinzetta per tagliare il formvar e staccarlo dal vetrino. Monta la posizione della griglia sotto il vetrino coperto, quindi delinea la griglia con una pinzetta per estrarla. Il foro nel film di fomvar così creato verrà ripreso per misurarne lo spessore.Montare un cont di nitrato di silicio erogato nel blocco di vetro AFM assicurandosi che la striscia dorata non sia sotto la punta della molla. Montare il blocco di vetro sul modulo AFM, quindi posizionare quest'ultimo sul tavolino del microscopio. Posizionare il vetrino coprioggetto rivestito in fomvar sulla camera di osservazione con PBS sulla parte superiore.Scansiona il confine tra fomvar e vetro in modalità contatto e con un punto di 0,5 nano newton. Nel software di elaborazione dati, utilizzare la superficie del vetro come riferimento in altezza e misurare lo spessore della superficie sulla sezione trasversale. Sotto un cappuccio sterile, prendi un vetrino coprioggetto da 12 millimetri e incollaci sopra una striscia di nastro adesivo.Delinea la griglia rivestita in fomavr con una pinzetta e posizionala lucida a faccia in su in modo che solo i lati si attacchino all'adesivo. Questo per evitare che il fomvar venga strappato quando si rimuove la griglia dal nastro. Posizionare la striscia di copertura in una piastra sterile a sei pozzetti e convogliare una goccia di 10 millimetri di terreno di coltura privo di siero.Dovrebbe contenere circa 10 mila cellule e in questo caso si tratta di microfagi differenziati dai monociti umani. Assicurati di non toccare la griglia con la punta del piper durante il processo, in modo da non danneggiare il rivestimento fomvar. Incubare per mezz'ora per far aderire le cellule, quindi riempire il pozzetto con il siero integrato e incubare di nuovo per due ore, prima dell'osservazione AFM.Posiziona due strisce parallele di nastro biadesivo su una capsula di Petri con fondo di vetro, assicurandoti che la larghezza tra di loro sia leggermente inferiore rispetto al diametro della griglia. Quindi staccare la griglia precedentemente seminata con le celle e posizionarla sopra le due strisce di nastro adesivo con le celle rivolte verso il basso. Fissare la griglia posizionando altre due strisce sopra quelle precedenti.Riempire il piatto con terreno di coltura preriscaldato integrato con hepe. Posizionare la pirofila nello scaldapiatti precedentemente impostato a 37 gradi centigradi. Installare il set sul palco AFM.Quando la temperatura del sistema è stabile a 37 gradi centigradi, procedere alla scansione della superficie del fomvar, che deve essere eseguita in modalità di contatto, con un set point di 0,95 nano newton e visualizzare le deformazioni associate ai protozoi sulla finestra di visualizzazione dei dati di deflessione. Ecco i risultati rappresentativi e le fasi di elaborazione per produrre formazioni con AFM per le misurazioni grafiche. Come si può vedere in questa immagine, vengono rilevati rigonfiamenti sulla superficie del fomvar.Per convertire queste informazioni fotografiche in valori di forza è necessario prima avere accesso alla differenza di forza locale. Per fare ciò, un adattamento polinomiale di terzo grado deve essere sottratto alla sua linea di scansione in modo indipendente. Quindi l'uso di un algoritmo di immagini dedicato fatto in casa consente di valutare i valori della forza di protrusione dalla mappa dell'altezza AFM e dal modello meccanico della protrusione mediata dai protozoi.Grazie a questa procedura, siamo in grado di studiare i meccanismi coinvolti nella generazione della forza di protrusione nei protozoi. Grazie per aver guardato e buona fortuna per i tuoi esperimenti.

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