Name: Microscopia a forza protrusione: Un metodo per quantificare le forze sviluppate dalla cella sporgenze (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Scopri la microscopia a forza atomica per quantificare le forze di protrusione esercitate dai podosomi su film flessibili. Questo metodo consente di analizzare la deformazione del film e convertirla in valori di forza mediante un modello meccanico.

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Gli autori sono grati ad Anna Labernadie, Guillaume Charrière e Patrick Delobelle per il loro contributo iniziale di questo lavoro e di Matthieu Sanchez e Françoise Viala per il loro aiuto con riprese video e montaggio. Quest'opera è stata sostenuta dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM piano cancro, Fondation Tolosa e Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).

1. preparazione di griglie rivestite con Formvar
<ol><li>Pulire le griglie di microscopia elettronica con acetone puro e farle asciugare su carta da filtro. Quindi pulire un vetrino da microscopio con etanolo puro, pulire con una carta per lenti e rimuovere la polvere con un soffietto.</li>
	<li>Posto un vetrino pulito etanolo verticalmente nell'imbuto di un dispositivo di fusione pellicola contenente una soluzione di Formvar nella parte inferiore. Coprire la parte superiore dell'imbuto.</li>
	<li>Con la lampadina atomizzatore pompa 100 mL di soluzione di Formvar (0,5%, dicloruro di etilene) fino a quando il livello raggiunge due terzi della diapositiva.</li>
	<li>Mantenere il vetrino nella soluzione per 1 min.</li>
	<li>Aprire la valvola del dispositivo per drenare la soluzione di Formvar in un flusso costante. Una portata di 10 a 15 mL/s produrrà un film Formvar di 30-80 nm. Lo spessore del film è determinato dalla concentrazione della soluzione Formvar e per il tasso di drenaggio. Nota: Il tasso di drenaggio può essere controllata scaricando la pressione tramite la valvola aria aprendo lentamente la valvola. Il più veloce il drenaggio, il più spesso il film. In pratica, perché è difficile da predire lo spessore del film dalla portata Formvar, prepariamo diversi lotti di Formvar film e controllare il loro spessore di AFM (vedi passo 2).</li>
	<li>Rimuovere il vetrino dalla camera e asciugarlo delicatamente su carta da filtro per rimuovere qualsiasi liquido Formvar.</li>
	<li>Tagliare un rettangolo di 20 x 50 mm dal film Formvar con una lama di rasoio.</li>
	<li>Riempire un bicchiere con acqua distillata e immergersi lentamente la diapositiva verticalmente in acqua per galleggiare fuori la pellicola: il film deve galleggiare sulla superficie dell'acqua.</li>
	<li>Luogo asciutto pulito acetone griglie sulla pellicola, splendente verso l'alto.</li>
	<li>Posizionare un coprioggetto in vetro tondo (Ø 12 mm) su alcune delle griglie. Questo vetrino coprioggetti servirà a misurare lo spessore del film (vedi passo 2).</li>
	<li>Coprire un vetrino da microscopio con un adesivo bianco ridimensionato per adattarlo. Immergere la diapositiva verticalmente al bordo del film Formvar galleggiante fino a quando l'intero film aderisce alla diapositiva. Rimuovere l'acqua in eccesso dal vetrino con carta da filtro e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente per una notte.</li>
</ol>2. misurazione dello spessore del Film
<ol><li>Tagliare il Formvar intorno il coprioggetto con pinzette per staccarlo dalla diapositiva.</li>
	<li>Segnare la posizione della griglia sotto il vetrino coprioggetto con una penna.</li>
	<li>Tagliare il Formvar intorno alla griglia contrassegnata per staccarla dal vetrino coprioggetti. Pertanto non vi sarà un buco nello strato Formvar rimanente, che verranno permetterà di misurare lo spessore del film. Coprire il vetrino coprioggetto con PBS e collocarla su un vetrino sul microscopio.</li>
	<li>Montare un cantilever di nitruro di silicio sul mattone di vetro AFM, assicurandosi che la striscia dorata non è coperto dalla punta della molla. Nota: La sensibilità e la costante elastica del cantilever dovrebbe avere precedentemente stati calibrati in PBS.</li>
	<li>Montare il blocco di vetro sul modulo del AFM e quindi posizionare il modulo sul microscopio.</li>
	<li>Collocare il vetrino coprioggetto rivestite con Formvar sulla camera di osservazione e coprirlo con 500 µ l di PBS.</li>
	<li>Il bordo del foro nel foglio Formvar utilizzando AFM in modalità di contatto e un punto di regolazione forza di 0,5 nN la scansione.</li>
	<li>Utilizzare la superficie del vetrino coprioggetti di vetro come il riferimento per misure di altezza e valutare lo spessore di Formvar come l'altezza della sezione trasversale (eseguire almeno 10 misurazioni per ogni batch di Formvar).</li>
</ol>3. cellule su griglie di semina
<ol><li>Sotto una cappa sterile, mettere una striscia (12 x 3 mm) del nastro bi adesivo su un vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Tagliare una griglia Formvar-rivestito con pinzette e metterlo a testa in giù sulla striscia adesiva (solo il bordo della griglia deve essere attaccata al nastro). Il film di Formvar deve affrontare il vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Mettere il dispositivo in una cultura ben.</li>
	<li>Mettere una goccia di 10 µ l di RPMI senza FCS contenente 104 macrofagi differenziati da monociti umani16. Nota: Assicurarsi di non toccare la griglia con la punta della pipetta per evitare di danneggiare il rivestimento di Formvar.</li>
	<li>Incubare per 30 min (37 ° C, 5% CO2) che le cellule aderiscono.</li>
	<li>Riempire il pozzo con 2 mL di RPMI contenente 10% FCS.</li>
	<li>Incubare il dispositivo per 2 ore a 37 ° C e 5% di CO2 di lasciare le cellule aderiscono prima osservazione AFM.</li>
</ol>4. topografia misure delle deformazioni indotte da Podosome
<ol><li>Attaccare due strisce di raddoppiato-nastro biadesivo su un fondo di vetro capsula di Petri. Nota: La distanza tra le due strisce dovrebbe essere inferiore al diametro di griglia.</li>
	<li>Staccare con cura la griglia placcata con macrofagi dal nastro adesivo.</li>
	<li>Capovolgere la griglia al fine di avere le cellule rivolto verso il vetro e la griglia tra le due strisce adesive di bastone.</li>
	<li>Correzione della griglia con due nuove strisce di adesivo raddoppiato: la griglia sarà così essere intramezzata fra due strisce adesive, lasciando l'area centrale della griglia accessibile a punta dell'AFM. Nota: Assicurarsi che la griglia è ben fissata e non attorcigliata; altrimenti il cantilever AFM potrebbe non essere in grado di avvicinarsi alla superficie di Formvar.</li>
	<li>Riempire la capsula di Petri con 2 mL di terreno di coltura pre-riscaldata 37 ° C (RPMI con 10% FCS) completati con 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	<li>Posizionare la piastra di coltura su un riscaldatore di piatto di 37 ° C.</li>
	<li>Installare il riscaldatore di piatto sul palco AFM.</li>
	<li>Lasciare che il sistema si stabilizza a 37 ° C.</li>
	<li>In modalità a contatto con una forza di 0,5 nN, fare una prima immagine globale per individuare podosomes e poi la scansione la topografia di Formvar a 3 Hz con un circa 20 nm-grande pixel. Nota: Evitare l'analisi vicino ai bordi della griglia.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Forces+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li>
<li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343(2014).</li>
<li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+Together%3A+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li>
<li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Leukocytes+and+Macrophages+of+Various+Phenotypes+Have+Distinct+Abilities+to+Form+Podosomes+and+to+Migrate+in+3d+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments.</a> European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).</li>
<li>Guiet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Mesenchymal+Migration+Requires+Podosome+Stabilization+by+Filamin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).</li>
<li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Macrophage+3d+Migration%3A+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Review%22%5BJournal%5D)">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+Phosphorylation+of+Wiskott-Aldrich+Syndrome+Protein+%28Wasp%29+by+Hck+Regulates+Macrophage+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).</li>
<li>Van Goethem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Podosomes+Go+3d%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Podosomes Go 3d.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).</li>
<li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages%3A+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li>
<li>Verollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiv-1+Reprograms+the+Migration+of+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages.</a> Blood. 125, 1611-1622 (2015).</li>
<li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podosome+Force+Generation+Machinery%3A+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li>
<li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory%2FEffector+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li>
<li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li>
<li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li>
<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

Conflitti di interesse non dichiarati.

Proprietà del materiale
La scelta del materiale per la membrana deformabile, nel nostro caso Formvar, deve soddisfare alcuni requisiti. Il materiale deve essere trasparente alla luce visibile e presentano fluorescenza auto limitato per consentire osservazioni in campo chiaro e microscopia a fluorescenza. La rugosità del film sottile deve essere ben di sotto di 10 nm per evitare qualsiasi effetto topografica su adesione delle cellule e per consentire la chiara osservazione dell...

Cellule animali interagiscono fisicamente con la matrice e le altre cellule che costituiscono il loro ambiente1. Ciò è necessario per loro di migrare, interiorizzare corpi, acquisire informazioni esterne o differenziare. In tali processi, la cella deve generare forze meccaniche e, come numerosi studi hanno dimostrato negli ultimi anni, la capacità di una cellula di generare forze e sonda ambiente influenza il comportamento biologico, dirigendo per esempio proliferazione o differenziazione2,3. A sua volta, la misurazione delle forze cellulare è un aiuto importante per studiare la regolazione della forza di generazione e capire la sua implicazione nella cella comportamento e tessuto destino4,5.
Ultimi anni hanno visto lo sviluppo di numerose tecniche per misurare le forze che una cella può esercitare sul suo ambiente6. La maggior parte di questi è stati strumentale nel rivelare che la trazione delle forze che cellule esercitano come si tirano su sonde mobili o un substrato deformabile. Tuttavia, le forze meccaniche coinvolte in protrusione nell'ambiente extracellulare soffrono di una mancanza di tecniche di misurazione e sono fino ad oggi non è ben caratterizzato.
Per ovviare a questa limitazione, presentiamo un metodo per misurare forze esercitate ortogonalmente al substrato. Essa consiste nella placcatura cellule viventi in un sottile foglio elastico che può deformare in direzione ortogonale, che permette di misurare la deformazione di substrato dalle cellule e dedurre le forze coinvolte. Topografia di substrato è misurata con risoluzione nanometrica mediante microscopia a forza atomica e la valutazione delle forze di deformazione si basa sulla conoscenza della geometria delle strutture cellulari protrusiva7,8, 9.
Qui, descriviamo l'installazione e la sua applicazione per misurare le forze generate dal podosomes, strutture di adesione protrusiva formate dai macrofagi per la loro migrazione mesenchimale in ambienti tridimensionali10,11, 12,13,14,15,16,17. Noi crediamo che questa tecnica avanzerà la comprensione della creazione delle forze e la sua regolamentazione in molti processi cellulari che coinvolgono la protrusione.

<table><tbody><tr><td>Griglie in nichel da 200 mesh Microscopia</td><td>elettronica Sciences</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>Adesivi bianchi 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di colata di film con valvola in uscita</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Razorblades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 0,5% soluzione in dicloruro di etilene</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 mm vetrini coprioggetti</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Microscopio a forza atomica Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Porta campioni a temperatura controllata&nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever in nitruro di silicio con una costante nominale della molla di 0,01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Nastro biadesivo</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Petri con fondo in vetro da 35 mm</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia a forza protrusione: un metodo per quantificare le forze sviluppate dalla cella sporgenze

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerosi contesti biologici, cellule animali hanno bisogno di interagire fisicamente con il loro ambiente attraverso lo sviluppo di forze meccaniche. Tra questi, le forze di trazione sono stati ben caratterizzate, ma c'è una mancanza di tecniche che permettono la misurazione delle forze protrusione esercitata dalle cellule ortogonalmente al loro substrato. Abbiamo progettato un setup sperimentale per misurare le forze di protrusione esercitate dalle cellule aderenti il loro substrato. Cellule piastrate su un foglio di Formvar compatibile con questo substrato di deformazione e la topografia risultante è mappata per microscopia a forza atomica (AFM) su scala nanometrica. I valori di forza vengono quindi estratti da un'analisi del profilo deformazione basato sulla geometria delle strutture cellulari protrusive. Quindi, le forze esercitate dalle singole unità sporgente di una cellula vivente possono essere misurate nel tempo. Questa tecnica consentirà lo studio della generazione di forza e la sua regolamentazione in molti processi cellulari che coinvolgono la protrusione. Qui, descriviamo la sua applicazione per misurare le forze protrusive generate da podosomes formata dai macrofagi umani.

Il protocollo di cui sopra viene descritto come preparare la messa a punto sperimentale di quantificare le forze di protrusione applicate dal macrofago podosomes su un substrato di Formvar. Questa operazione viene eseguita mediante AFM ed è illustrata nella Figura 1.
Quando si analizza un'immagine topografica di rigonfiamenti sotto podosomes utilizzando il software di elaborazione dati JPK, un polin...

Qui, abbiamo dettaglio le tecniche sperimentali utilizzate per valutare le forze di protrusione che podosomes si applicano su una pellicola compatibile, dalla preparazione del film per l'analisi automatizzata delle immagini topografiche.

Microscopia a forza protrusione: Un metodo per quantificare le forze sviluppate dalla cella sporgenze

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le forze di protrusione utilizzando la microscopia a forza atomica. Ciò si ottiene preparando prima le griglie rivestite di formula e misurando lo spessore di questo film. La terza fase di questo processo consiste nel posizionare le celle sulle griglie e lasciarle aderire.La fase finale della procedura consiste nell'visualizzare il film di forma sotto le cellule utilizzando la microscopia a forza atomica. Quando aderiscono al substrato, i microfagi formano strutture di adesione submicrometriche chiamate podosomi. In definitiva, la deformazione del film utilizzato dai podosomi sarà quantificata e convertita in forze utilizzando un modello meccanico fatto in casa.Posizionare una luce di vetro pulita con etanolo nel dispositivo di colata del film dell'imbuto e coprire la parte superiore dell'imbuto. Versare la soluzione di fomvar nell'imbuto fino a raggiungere i due terzi del vetrino. Lasciarlo agire per un minuto, quindi scolare la soluzione di formvar in un flusso costante.Si noti che lo spessore del film dipende sia dalla velocità di flusso che dalla concentrazione della soluzione di formvar. Asciuga questa luce in modo scuro

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Studio del citoscheletro di actina in vivo le cellule endoteliali Esprimendo GFP-Actina

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Biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite Connexin 43 Disgregazione strutturale

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'implementazione della litografia multifotone per fabbricare array tridimensionali di marcatori fiduciari fluorescenti incorporati in idrogel a base di poli(etilene glicole) per l'uso come microscopia a forza di trazione senza riferimenti Piattaforme. Utilizzando queste istruzioni, la misurazione della deformazione del materiale 3D e il calcolo delle trazioni cellulari è semplificata per promuovere misurazioni della forza di trazione ad alta...

Fabbricazione e implementazione di una piattaforma di microscopia della forza di trazione senza riferimenti

Qui presentiamo un protocollo utilizzato per eseguire esperimenti di microscopia a forza di trazione su cellule B. Descriviamo la preparazione di gel morbidi in poliacrilammide e la loro funzionalizzazione, nonché l'acquisizione dei dati al microscopio e un riepilogo dell'analisi dei dati.

Microscopia a forza di trazione per studiare l'attivazione dei linfociti B

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le proprietà meccaniche intracellulari di cellule embrionali isolate di zebrafish in confinamento tridimensionale con misurazione della forza diretta mediante una trappola ottica.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

La piattaforma Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) automatizza il processo di misurazione simultanea di un'ampia varietà di segnali chimici e meccanici nelle cellule aderenti. iTACS è progettato per facilitare lo sviluppo guidato dalla comunità e consentire ai ricercatori di utilizzare tutte le funzionalità della piattaforma indipendentemente dal loro background educativo.

Toolkit integrativo per analizzare i segnali cellulari: forze, movimento, morfologia e fluorescenza

Questo protocollo ha lo scopo di misurare i parametri dinamici (protrusioni, retrazioni, volant) delle sporgenze ai margini delle celle di diffusione.

Misurazione della dinamica di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione utilizzando la microscopia a cellule vive

Per avanzare, i coni di crescita devono esercitare forze di trazione contro l'ambiente esterno. La generazione delle forze di trazione dipende dalla dinamica dell'actina e dall'accoppiamento della frizione. Il presente studio descrive i metodi per analizzare la dinamica dell'actina, l'accoppiamento della frizione e le forze di trazione per l'avanzamento del cono di crescita.

Analisi della dinamica dell'actina, dell'accoppiamento della frizione e della forza di trazione per l'avanzamento del cono di crescita

Descriviamo i miglioramenti a un metodo standard per misurare le forze di trazione cellulare, basato sulla stampa di microcontatti con una singola fase di pattern sottrattiva di array di punti di proteine della matrice extracellulare su idrogel morbidi. Questo metodo consente una fabbricazione più semplice e coerente dei modelli a isola, essenziale per controllare la forma del cluster cellulare.

Generazione di modelli per microscopia a trazione micropattern

Scopri la microscopia a forza atomica per quantificare le forze di protrusione esercitate dai podosomi su film flessibili. Questo metodo consente di analizzare la deformazione del film e convertirla in valori di forza mediante un modello meccanico.

Microscopia a forza protrusione: Un metodo per quantificare le forze sviluppate dalla cella sporgenze

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