La somministrazione orale di Rotenone utilizzando un Gavage e Image Analysis di alfa-sinucleina inclusioni nel sistema nervoso enterico

I sintomi del morbo di Parkinson, tra cui la disfunzione motoria e del linguaggio, derivano da una ridotta attività delle cellule secernenti dopamina nel cervello. Il sistema nervoso enterico e il bulbo olfattivo sono le strutture nervose più esposte e le prime ad essere colpite. Il morbo di Parkinson è stato associato all'esposizione ai pesticidi.

Al fine di analizzare gli effetti dei pesticidi sul sistema nervoso enterico, il pesticida roone viene somministrato ai topi mediante sonda orale. I topi vengono quindi perfusi intracardiaco con paraforma al 4%, cervello aldeide e sistema nervoso enterico. Il tessuto viene estratto, preparato e immunocolorato per le proteine associate al PD.

Le immagini della beta tre tubulina e dell'alfa sinucleina acquisite mediante microscopia confocale dimostrano l'accumulo di alfa sinucleina all'interno dei neuroni del sistema nervoso enterico negli animali esposti ai pesticidi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la somministrazione sistemica di rotenone, è che utilizzando questa tecnica, si garantisce che l'effetto del rotenone sia limitato al sistema nervoso enterico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella malattia di Parkinson, come la sua eziologia e i meccanismi alla base della sua progressione.

Le implicazioni di questa tecnica estendono la terapia di torre e la diagnosi della malattia di Parkinson perché consentiranno lo sviluppo di nuovi bersagli terapeutici e metodi diagnostici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla fisiopatologia della malattia di Parkinson, può essere applicato anche ad altri sistemi, come lo studio dell'effetto di altre tossine ambientali sui sistemi nervosi enterico, simpatico e parasimpatico, nonché sulla parete intestinale. In generale, le persone che non conoscono questi metodi avranno difficoltà perché ci vuole un po' di tempo per padroneggiare il gavage.

Ho avuto l'idea di questi metodi per la prima volta quando ho letto del legame tra pesticidi e morbo di Parkinson. E' stato anche utile vedere la conferenza High CORAs al Congresso Mondiale di Parkinson a Berlino nel 2005. È necessaria una dimostrazione pacifica di questo metodo.

Il metodo per somministrare ol con la sonda sonda è difficile in quanto i topi hanno un'anatomia diversa dagli esseri umani dall'altra parte, l'analisi delle immagini è stata eseguita con passaggi personalizzati per queste immagini. Inizia il protocollo pesando l'animale. Calcolare il volume appropriato di rotenone.

Sono necessari 0,01 millilitri per grammo di peso dell'animale, che corrisponde a una dose di cinque milligrammi per chilogrammo. Caricare una siringa da un millilitro con la soluzione roone, quindi caricare una seconda siringa con la soluzione del veicolo. Prendi il mouse e tieni la coda del mouse con una mano.

Allungare la pelle del collo tirandola con le prime due dita dell'altra mano. Una volta fissata la testa tra le due dita, appoggiatela al palmo della mano e capovolgetela. Aggiusta la coda.

Usando il quarto e il quinto dito, mantenendo la testa verso la parte posteriore, premi il palato per aprire la bocca del topo. Introdurre delicatamente la sonda gastrica in bocca. Muovi lentamente la sonda gastrica in direzione dello stomaco fino a quando non viene inserita per tutta la sua lunghezza.

Per evitare che il materiale penetri nei polmoni, somministrare la soluzione roone o il veicolo premendo delicatamente l'embolo. Al termine, estrarre lentamente il gavage, rimettere l'animale in un'altra gabbia fino a quando tutti gli animali di una gabbia non hanno finito. Dopo il trattamento, i topi vengono profusi intracardiaci con aldeide paraforme al 4%.

Nella PBS, le viscere vengono quindi estratte mediante dissezione e poste nel saccarosio al 15% durante la notte. Il giorno successivo, il tessuto viene trasferito al 30% di saccarosio e incubato nuovamente per una notte a quattro gradi Celsius. Il tessuto viene quindi posto in un congelatore a meno 80 gradi Celsius e conservato fino all'uso utilizzando un criostato intestinale da 20 micron.

Le sezioni trasversali vengono trasferite su vetrini rost, procedure di blocco e immunocolorazione. Vengono quindi eseguiti gli anticorpi anti-beta tre tubulina e antifa sinucleina. Si consiglia a una persona esterna di eseguire un'analisi cieca dei dati.

Per iniziare l'analisi, apri il software Fiji. Aprire il file immagine confocale. Quindi suddivise i canali in modo da lavorare il più possibile su ciascun canale in modo indipendente.

Chiudi i canali che non verranno utilizzati e seleziona, analizza, imposta, ridimensiona e imposta la dimensione dei pixel su uno. Imposta la distanza nota su 0,13 e fai clic su globale. La dimensione dell'immagine verrà ora mostrata in micron.

Selezionare il canale dell'alfa sinucleina e selezionare il ganglio. Facendo in modo che la selezione racchiuda il ganglio in tutte le fette. Duplica l'immagine con il ganglio selezionato, verrà duplicata solo un'immagine delle dimensioni del ganglio.

Premi modifica cancella all'esterno della parte dell'immagine al di fuori della regione selezionata diventerà nera. Duplicare nuovamente l'immagine per determinare l'andamento della procedura. Le immagini con un basso rapporto segnale/rumore di fondo non devono essere utilizzate per l'analisi delle immagini.

Selezionare la soglia di regolazione dell'immagine. Quindi seleziona l'entropia massima. Quindi sposta le sezioni nell'immagine ritagliata e quella originale per assicurarti che la procedura sia andata bene.

La soglia tropica seleziona un livello di intensità del segnale in base all'istogramma dell'immagine e solo i pixel con intensità superiori a questa soglia verranno visualizzati in un processo di selezione dell'immagine bianco su nero. Quindi fare clic su liscio. Questo passaggio trasforma i bordi pixelati delle immagini in un processo di selezione dei bordi morbidi.

Quindi fare clic su binario e scegliere Rendi binario. L'immagine verrà visualizzata come immagine duplicata in bianco e nero per eseguire il passaggio successivo sull'immagine duplicata, fare clic su analizza, analizza particelle. Quindi seleziona Mostra contorni e fai clic su Riassumi.

Il resto dell'impostazione dovrebbe essere lasciato predefinito. Questa funzione riconosce il numero totale di pixel con un segnale e quelli che sono raggruppati insieme alla superficie totale dei pixel con segnale. Inoltre sono riportati il numero di gruppi di pixel e la dimensione media.

Confronta e seleziona la sezione con l'area totale più grande che si regola bene. La fetta verrà contrassegnata. Copiare la tabella dei dati con la superficie totale dell'alfa sinucleina, il numero di inclusioni e la dimensione media delle particelle.

Incolla i dati in un foglio di calcolo Excel o annotati altrove. Ritorno alle Figi. Trova la fetta selezionata in precedenza nel canale della tubulina beta e selezionala.

Selezionare l'area gangliare e fare clic su analizza. Quindi selezionare la misura. Apparirà un'altra tabella che mostra la superficie totale del ganglio.

Estrai i dati dalla tabella in un foglio di calcolo Excel vicino alla misurazione dell'alfa sinucleina o copiali altrove utilizzando Excel. Dividi i diversi parametri ottenuti nella misurazione dell'alfa sinucleina per la superficie del ganglio per ottenere la superficie totale dell'alfa-sinucleina e il numero di inclusioni normalizzato in base alla dimensione del ganglio al fine di analizzare gli effetti del roone che agisce localmente sul sistema nervoso enterico, cinque milligrammi per chilogrammo del marciume del pesticida noto è stato somministrato per via orale a topi C 57 neri di 1 anno. Il cromatogramma mostrato qui mostra la presenza di un picco noto di rotan un'ora dopo la somministrazione di controlli sui topi trattati con 20 milligrammi per chilogrammo di rotenone, 10 e cinque milligrammi per chilogrammo di rotenone.

I livelli di rotenone sono stati determinati per le estrazioni di sangue, cervello e tronco encefalico mediante HPLC, come mostrato qui. La somministrazione di cinque milligrammi per chilogrammo di marcio mediante sonda gastrica orale non determina livelli misurabili nel sangue una, due o tre ore dopo il trattamento, come determinato da H plc. Questo grafico mostra i livelli di marciume nel cervello e nel tronco encefalico dei topi trattati.

Un'ora dopo l'estrazione, la somministrazione di 10 milligrammi per chilogrammo o meno di rotenone non mostra livelli di rotone nei campioni di cervello o tronco encefalico. Un'ora dopo la somministrazione del complesso mitocondriale, è stata valutata un'attività in campioni muscolari e cerebrali di topi trattati con 1,5 mesi. Non c'è alcuna differenza significativa tra i gruppi che non mostrano inibizione del complesso mitocondriale, confermando così che non c'era rone in queste regioni.

L'analisi della malattia di Parkinson, componente del corpo di Lewy alfa sinucleina dopo la somministrazione di rone, consente una determinazione affidabile della quantità totale di superficie di alfa sinucleina, della presenza di inclusioni di alfa sinucleina e del modello di alfa sinucleina nella cellula. Questa figura mostra la colorazione anti beta tre tubulina, alfa sinucleina e DAPI nelle sezioni del duodeno e dell'ileo, come si può vedere qui. Il trattamento di 1,5 mesi con scarafaggio ha indotto un aumento del pattern di alfa sinucleina puntata all'interno dei gangli del sistema nervoso enterico, anche uno rispetto ai controlli di tre mesi.

Questo modello può essere visto sia nell'ileo che nel duodeno. Dopo tre mesi di trattamento, si può osservare la formazione di inclusioni di alfa sinucleina più grandi, la colorazione immunofluorescente con anti-alfa sinucleina, theof, flavina e DPI dimostra l'aggregazione di accumuli di alfa sinucleina più grandi solo a tre mesi. Questo esperimento è stato analizzato utilizzando metodi di segmentazione automatica e di soglia basati sull'entropia.

Nel grafico a sinistra, ogni colonna rappresenta la superficie totale dell'alfa sinucleina rispetto alla superficie del ganglione. Nel grafico a destra, ogni colonna rappresenta il numero totale di inclusioni di alfa sinucleina per superficie gangliare prelevata. Insieme, questi dati suggeriscono che la somministrazione locale di rotenone induce fosforilazione, accumulo e aggregazione dell'alfa sinucleina con gliosi nei gangli del sistema nervoso enterico Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un minuto per animale se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante introdurre delicatamente la sonda gastrica e, se si riscontrano ostacoli, è meglio estrarla e reintrodurla seguendo queste procedure. Possono essere eseguiti altri metodi come l'HPLC, l'immunocolorazione e l'analisi delle immagini. Ciò consentirà di analizzare altre regioni, gli effetti della sostanza o persino la presenza della sostanza nel sangue dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai neuroscienziati per studiare gli effetti delle neurotossine ambientali sul sistema nervoso enterico. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di applicare correttamente il calibro e analizzare le immagini che provengono dall'immunochimica. Non dimenticare che lavorare con il marcio può essere estremamente pericoloso.

Pertanto, si consiglia l'uso di guanti e maschere durante l'esecuzione di questa procedura. Le.