Sviluppo di un Rat modello Alfa-sinucleina per la malattia di Parkinson mediante iniezione stereotassica di un ricombinante vettore virale adeno-associato

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare un modello animale basato su vettori virali per la malattia di Parkinson tramite iniezione stereotassica nel sistema nervoso centrale. Questo metodo può essere utilizzato per sviluppare modelli animali normali che consentono test preclinici sui farmaci e possono essere utili nello studio del meccanismo molecolare del morbo di Parkinson e di molti altri disturbi neurodegenerativi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per il targeting specifico delle regioni del cervello.

È possibile ottenere un'elevata espressione cerebrale di trincea e utilizzarla per creare modelli animali in specifici ceppi e specie animali. Sono stati sviluppati i diversi sistemi vettoriali finali. La scelta del sistema vettoriale dipende dalle dimensioni del trenching che si desidera esprimere, dalla durata dell'espressione genica, dai suoni che si desidera colpire e dai problemi di biosicurezza.

A dimostrare la procedura sarà Annelies Aertgeerts, un tecnico del nostro laboratorio. Inizia anestetizzando adeguatamente una femmina di ratto Wistar di otto settimane secondo i protocolli approvati. Verificare che sia stato raggiunto un piano chirurgico di anestesia stringendo ciascuna zampa e notando l'assenza del riflesso di ritiro.

Quindi, usa un impiantatore MicroTransponder per posizionare un MicroTransponder sul dorso del ratto. Verificare che il MicroTransponder sia posizionato correttamente e che sia possibile ottenere una lettura. Ora taglia i capelli sul cuoio capelluto del ratto e applica l'anestetico locale sul cuoio capelluto e sulle orecchie.

Trasferire il ratto in una cappa a flusso laminare ed eseguire il resto della procedura utilizzando una tecnica asettica. Posiziona il ratto nel telaio stereotassico, fissando le barre auricolari, seguite dalla barra della bocca e del naso. Copri il corpo del ratto con una coperta di carta per evitare un calo della temperatura corporea.

Applicare un lubrificante oculare per evitare che gli occhi si secchino. Quindi, disinfettare il cuoio capelluto secondo le procedure approvate. Qui viene utilizzato l'uno per cento di iodio al 70% di isopropile.

Dopo aver praticato una piccola incisione nella linea mediana del cuoio capelluto, raschiare delicatamente le membrane del cranio e risciacquare con soluzione fisiologica. Dopo aver lasciato asciugare il cranio, assicurati che bregma e lambda possano essere visti chiaramente. Ora, riempire una siringa per microiniezione da 10 microlitri, 30 gauge 20 milometri con AAV ricombinante e posizionarla sulla pompa di microiniezione motorizzata collegata allo strumento stereotassico.

Per la transazione specifica dei neuroni dopaminergici della substantia nigra, i vettori AV ricombinanti sono la prima scelta a causa dei loro alti titoli e dell'efficienza nella trasduzione dei neuroni dopaminergici. Testare il flusso, rilasciando una goccia di AAV. Smaltire l'AAV rilasciato in un detergente polivalente.

Controllare visivamente che la testa sia fissata diritta nel telaio della testa. Quindi controlla che il cranio sia piatto, spostando prima la punta dell'ago verso il bregma e misurando l'altezza in questo punto, abbassando la punta dell'ago in direzione dorso-ventrale fino a toccare il cranio. Ripetere la procedura in lambda.

Dopo aver riportato l'ago a bregma, spostare l'ago in direzione anteriore, posteriore e laterale mediale fino alle coordinate stereotassiche per la microiniezione. Annota le coordinate. Nel sito di iniezione, misurare l'altezza del cranio come prima e assicurarsi che non differisca da più di 0,3 mm dall'altezza del bregma.

Quindi praticare con cura un foro di due millimetri nel cranio. Una volta praticato il foro, misurare l'altezza della dura madre per determinare il riferimento da cui applicare la coordinata dorso-ventrale. Penetrare la dura madre utilizzando un ago calibro 26.

Assorbire il sangue con il fazzoletto sterile e procedere solo dopo che tutto il sanguinamento si è fermato. Ora abbassa lentamente l'ago della siringa per microiniezione precaricata nel cervello fino alla coordinata dorso-ventrale. E fai una pausa di un minuto.

Quindi iniettare tre microlitri di AAV a una velocità di 0,25 microlitri al minuto. Dopo l'iniezione, lasciare che l'ago rimanga in posizione per altri cinque minuti per evitare il riflusso lungo la traccia dell'ago prima di rimuoverlo lentamente. Cucire il cuoio capelluto utilizzando poliestere intrecciato codificato 3.0 e disinfettare la pelle con l'uno per cento di iodio e il 70% di isopropile.

Allentare la barra del naso e della bocca, e poi le due barre auricolari, per rimuovere delicatamente l'animale dallo strumento stereotassico. A questo punto somministrare analgesia e, se necessario, un agente di inversione dell'anestesia. Quindi metti il ratto in una gabbia pulita su una piastra riscaldante impostata a 38 gradi Celsius e monitora attentamente fino a quando non si sveglia.

Dopo l'intervento chirurgico, la cinetica della neurodegenerazione può essere studiata nell'intero animale utilizzando test comportamentali e imaging PET e, dopo il sacrificio, utilizzando tecniche immunoistochimiche. Il test del cilindro, per valutare l'uso spontaneo degli arti anteriori, è stato eseguito in vari momenti dopo la microiniezione di AAV ricombinante che esprime la mutazione A53T alfa sinucleina nella substantia nigra. A partire da tre settimane dopo l'iniezione, la significativa compromissione motoria è stata osservata nei ratti che hanno ricevuto la dose mediana.

A quattro settimane dall'iniezione, è stata osservata una diminuzione del 50% dell'uso spontaneo della zampa anteriore controlaterale. Mentre gli animali iniettati con eGFP di controllo non hanno mostrato asimmetria nell'uso delle zampe anteriori. I ratti che hanno ricevuto una dose più elevata di AAV 2/7A53T alfa sinucleina ricombinante, hanno mostrato una compromissione più pronunciata dell'uso della zampa anteriore a 29 giorni dopo l'iniezione.

Per dimostrare che la compromissione motoria osservata era dipendente dalla dopamina, è stata somministrata una singola dose di L-doba. Quando il test del cilindro è stato ripetuto 45 minuti dopo il trattamento con L-dopa, è stato osservato un recupero completo dell'uso della zampa anteriore negli animali iniettati con alfa sinucleina AAV 2/7A53T ricombinante. Per seguire la cinetica della neurodegenerazione dopaminergica nigrostriatale in modo non invasivo nel tempo, nei singoli animali, il legame trasportato dalla dopamina è stato quantificato utilizzando la tomografia a emissione di positroni su piccoli animali con F-18FECT come radioligando.

Nel corso del tempo, il legame con DAT è diminuito significativamente nel budiman caudato omolaterale di ratti ricombinanti iniettati con AAV 2/7A53T alfa sinucleina. Dopo 32 giorni, è stata osservata una diminuzione del legame DAT fino all'85%. Come controllo positivo, l'iniezione della neurotossina 6 OHDA nel SN ha indotto una perdita del 90% del legame DAT entro sette giorni.

Sezioni cerebrali di ratti microiniettati con AAV 2/7A53T alfa sinucleina ricombinante nel tempo sono state immunocolorate per la tirosina idrossilasi, un marcatore dei neuroni dopaminergici. Questo dato dimostra la progressiva perdita di neuroni dopaminergici in un periodo di 29 giorni dopo la microiniezione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45 minuti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare corrispondenze vettoriali finali di alta qualità. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre tecniche, come l'imaging PET non invasivo, l'analisi del comportamento e l'analisi immunoistochimica per determinare il livello di neurodegenerazione e neuropatologia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come eseguire un'iniezione di vettore virale nella substantia nigra al fine di sviluppare modelli animali basati su vettori virali per il morbo di Parkinson.

Non dimenticare che lavorare con vettori virali può essere pericoloso e che dopo questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare sotto un flusso laminare e un'adeguata decontaminazione dei rifiuti.