Sviluppo di un Rat modello Alfa-sinucleina per la malattia di Parkinson mediante iniezione stereotassica di un ricombinante vettore virale adeno-associato

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un modello animale di malattia di Parkinson basato su vettori virali mediante iniezione stereotassica nel sistema nervoso centrale. Questo metodo può essere utilizzato per sviluppare modelli animali normali che permettono test preclinici di farmaci e possono essere utili nello studio dei meccanismi molecolari della malattia di Parkinson, nonché di molte altre patologie neurodegenerative. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere impiegata per il targeting specifico di regioni cerebrali.

È possibile ottenere un'elevata espressione genica nel cervello e utilizzarla per creare modelli animali in specifici ceppi e specie animali. Sono stati sviluppati diversi sistemi vettoriali finali. La scelta del sistema vettoriale dipende dalle dimensioni del transgene che si desidera esprimere, dalla durata dell'espressione genica, dalle cellule o regioni che si vogliono indirizzare e da considerazioni di biosicurezza.

La procedura sarà dimostrata da Annelies Aertgeerts, una tecnica del nostro laboratorio. Iniziare anestetizzando correttamente un ratto Wistar femmina di otto settimane secondo protocolli approvati. Verificare che sia stato raggiunto un livello chirurgico di anestesia stringendo ciascuna zampa e osservando l'assenza del riflesso di ritrazione.

Successivamente, utilizzare un impiantatore MicroTransponder per posizionare un MicroTransponder sulla schiena del ratto. Verificare che il MicroTransponder sia posizionato correttamente e che sia possibile ottenere una lettura. A questo punto, tagliare i peli sul cuoio capelluto del ratto e applicare un anestetico locale sul cuoio capelluto e sulle orecchie.

Trasferire il ratto in una cappa a flusso laminare ed eseguire il resto della procedura utilizzando una tecnica asettica. Posizionare il ratto nel telaio stereotassico fissando prima le barre auricolari, seguite dalla barra per bocca e naso. Coprire il corpo del ratto con una coperta di carta per evitare un calo della temperatura corporea.

Applicare un lubrificante oculare per prevenire l'essiccamento degli occhi. Successivamente, disinfettare il cuoio capelluto secondo procedure approvate. In questo caso si utilizza iodio all'1% in isopropilico al 70%.

Dopo aver praticato una piccola incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto, rimuovere delicatamente le membrane dal cranio e risciacquare con soluzione fisiologica. Dopo aver lasciato asciugare il cranio, verificare che bregma e lambda siano chiaramente visibili. A questo punto, riempire una siringa micro-iniettiva da 10 microlitri, con ago da 30 gauge e lunghezza di 20 millimetri, con AAV ricombinante e posizionarla sulla pompa micro-iniettiva motorizzata collegata allo strumento stereotassico.

Per un trasferimento specifico dei neuroni dopaminergici della sostanza nera, i vettori AV ricombinanti sono la prima scelta grazie ai loro alti titoli e all'elevata efficienza nel trasdurre i neuroni dopaminergici. Verificare il flusso rilasciando una goccia di AAV. Smaltire qualsiasi AAV rilasciato in un detergente pulente polivalente.

Verificare visivamente che la testa sia fissata in posizione verticale nel telaio cranico. Successivamente, verificare che il cranio sia piano, spostando innanzitutto la punta dell'ago in corrispondenza del bregma e misurando l'altezza in questo punto, abbassando la punta dell'ago nella direzione dorso-ventrale fino a quando tocca il cranio. Ripetere la procedura in corrispondenza del lambda.

Dopo aver riportato l'ago al bregma, spostare l'ago nelle direzioni antero-posteriore e mediale-laterale fino alle coordinate stereotassiche per la microiniezione. Registrare le coordinate. Sul sito di iniezione, misurare l'altezza del cranio come in precedenza, e assicurarsi che non differisca di più di 0,3 mm rispetto all'altezza del bregma.

Quindi praticare con attenzione un foro di due millimetri nel cranio. Una volta praticato il foro, misurare l'altezza della dura per determinare il riferimento dal quale applicare la coordinata dorso-ventrale. Penetrare la dura utilizzando un ago da 26 gauge.

Assorbire il sangue con il tessuto sterile e procedere solo dopo che l'emorragia si è completamente arrestata. Ora abbassare lentamente l'ago della siringa di microiniezione precaricata nel cervello fino alla coordinata dorso-ventrale. Attendere quindi per un minuto.

Quindi iniettare tre microlitri di AAV a un ritmo di 0,25 microlitri al minuto. Dopo l'iniezione, lasciare l'ago in posizione per altri cinque minuti per prevenire il reflusso lungo il percorso dell'ago, quindi rimuoverlo lentamente. Suturare il cuoio capelluto utilizzando poliestere intrecciato codificato 3,0 e disinfettare la pelle con iodio all'1% e isopropanolo al 70%.

Per allentare la barra nasale e quella orale, quindi le due barre auricolari, per rimuovere delicatamente l'animale dallo strumento stereotassico. In questo momento somministrare un analgesico e, se necessario, un agente antagonista dell'anestesia. Successivamente, posizionare il ratto in una gabbia pulita su una piastra riscaldata regolata a 38 gradi Celsius e monitorarlo attentamente fino al risveglio.

Dopo l'intervento chirurgico, la cinetica della neurodegenerazione può essere studiata nell'animale intero mediante test comportamentali e imaging con PET, e dopo l'eutanasia, mediante tecniche di immunohistochemica. Il test del cilindro per valutare l'uso spontaneo degli arti anteriori è stato eseguito in diversi momenti successivi alla microiniezione di AAV ricombinante che esprime la mutazione A53T dell'alfa-sinucleina nella sostanza nera. A partire da tre settimane dopo l'iniezione, è stato osservato un significativo deficit motorio nei ratti che avevano ricevuto la dose mediana.

A quattro settimane dopo l'iniezione, è stato osservato un calo del 50% nell'uso spontaneo della zampa anteriore controlaterale. Mentre gli animali di controllo iniettati con eGFP non hanno mostrato alcuna asimmetria nell'uso della zampa anteriore. I ratti che hanno ricevuto una dose più elevata di AAV ricombinante 2/7A53T alfa-sinucleina hanno mostrato un deficit più pronunciato nell'uso della zampa anteriore a 29 giorni dall'iniezione.

Per dimostrare che il deficit motorio osservato fosse dipendente dalla dopamina, è stata somministrata una singola dose di L-dopa. Quando il test del cilindro è stato ripetuto 45 minuti dopo il trattamento con L-dopa, si è osservato un completo recupero dell'uso della zampa anteriore negli animali trattati con AAV ricombinante 2/7A53T alfa-sinucleina. Per monitorare in modo non invasivo nel tempo, nei singoli animali, la cinetica della neurodegenerazione dopaminergica nigrostriatale, il legame del trasportatore della dopamina è stato quantificato mediante tomografia a emissione di positroni per piccoli animali, utilizzando F-18FECT come radiolegante.

Il legame al DAT è diminuito significativamente nel corpo caudato controlaterale dei ratti iniettati con AAV ricombinante 2/7A53T alfa-sinucleina nel tempo. Dopo 32 giorni, è stato osservato un calo del legame al DAT fino all'85%. Come controllo positivo, l'iniezione della neurotossina 6-OHDA nella SN ha indotto una perdita del 90% del legame al DAT entro sette giorni.

Sezioni cerebrali di ratti microiniettati con AAV ricombinante 2/7A53T dell'alfa-sinucleina nel tempo sono state immunomarcate per la tirosina idrossilasi, un marcatore dei neuroni dopaminergici. Questa figura mostra la perdita progressiva dei neuroni dopaminergici nel periodo di 29 giorni successivo alla microiniezione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45 minuti.

Quando si esegue questa procedura, è fondamentale utilizzare vettori finali di alta qualità. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile effettuare altre tecniche, come l'imaging PET non invasivo, l'analisi del comportamento e l'analisi immunocitochimica, al fine di determinare il livello di neurodegenerazione e di neuropatologia. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come eseguire un'iniezione di vettore virale nella sostanza nera per sviluppare modelli animali basati su vettori virali per la malattia di Parkinson.

Non dimenticare che lavorare con vettori virali può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come lavorare sotto un flusso laminare e decontaminare correttamente i rifiuti seguendo questa procedura.