Name: Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantificazione di Th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Scopri come rilevare le risposte delle cellule T agli antigeni microbici mediante l'assay ELISPOT. Questa tecnica consente di quantificare le citochine Th-1 e identificare bersagli microbici nelle malattie idiopatiche.

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Sostenuto in parte da Vanderbilt CTSA sovvenzione 1 UL1 RR024975 dal Centro nazionale per le risorse di ricerca, National Institutes of Health. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH R01 HL 83839; R01 AI 65744.

Per il seguente protocollo, usiamo le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) come le cellule di interesse. Tuttavia, questo protocollo può essere usato con altri tipi di cellule. Eseguire il test in una cappa coltura di tessuti con tecnica sterile. Giorno 1: Preparazione della piastra e celle <ol><li> Estrarre una piastra ELISPOT e aprirlo nel cappuccio. </li><li> Lavare la piastra 3 volte con 150 ml di PBS 1X utilizzando una pipetta multicanale, se disponibile, altrimenti solo pipettaggio bene è accettabile. </li><li> Prendete un pacchetto di serbatoi e aprirlo nel cofano. </li><li> Aggiungere 2 mg / mL di anticorpo di cattura, anti-umano interferone-γ, a 11 ml di PBS 1X. Vortex bene. Trasferimento mix di anticorpi ad un serbatoio. </li><li> Mettere 100 microlitri della soluzione del rivestimento in ciascun pozzetto utilizzando il multicanale. </li><li> Avvolgere la piastra in parafilm. </li><li> Porre la piastra in frigorifero per una notte. Le piastre sono buone per settimane. La regola generale è che se c'è ancora lasciato liquido nei pozzi, la lastra può essere utilizzato. </li></ol> Preparazione delle cellule Se i PBMC sono freschi poi contare le cellule e incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. Per PBMC conservati in azoto liquido, scongelamento delle cellule è necessaria. Il protocollo è il seguente: <ol><li> Scongelare la provetta Microbank ™ di cellule in bagno d'acqua a 37 ° C fino quasi completamente scongelati. </li><li> Immediatamente risospendere in 5 ml di R10 media. </li><li> Spin per 5 minuti a 225 x g. </li><li> Risospendere nuovamente in 5 ml di R10 media e contare le cellule vitali con trypan blu. </li><li> Portare la concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml in R10 media. </li><li> Riposo durante la notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> Giorno 2: Configurare la piastra <ol><li> Etichetta coperchio piatto con il numero del campione di identificazione, le condizioni bene, e la data. </li><li> Lavare la piastra 6 volte con 150 ml di PBS sterile 1x con la discarica e il metodo di macchia. Fare attenzione a non bagnare il piatto mentre dumping. Questo potrebbe causare la pozzetti della piastra a diventare viola. </li><li> Aggiungere 100 ml di R20 in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Mentre la piastra è in incubazione, contare le cellule che sono state riposato durante la notte. </li><li> Gira la sospensione cellulare a 1500 rpm per 5 minuti. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in modo da avere una concentrazione finale di 1x10 6 cellule per 1 ml a R10 media. </li><li> Dopo l'incubazione 1 ora, togliere la R20 con la discarica e il metodo di macchia. Fare attenzione a non bagnare il piatto mentre dumping. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione delle cellule (10 5 cellule) in ogni pozzetto. Aggiungi peptidi appropriati e / o antigeni nei pozzetti corrispondenti in duplice copia. Usare un puntale nuovo ogni volta che vai nella soluzione di peptide di lavoro. Concentrazione di peptide normale è 10-40 mg / ml. Dal peptidi variano, ogni investigatore dovrebbe titolare peptidi per ottenere risultati ottimali. </li><li> Nei pozzetti di controllo negativo, solo aggiungere le celle (non peptidi) </li><li> Nei pozzetti di controllo positivo, aggiungere fitoemoagglutinina (PHA, 10 mg / ml; Sigma). </li><li> Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2 (~ 18 ore). </li></ol> Giorno 3: Sviluppare la piastra <ol><li> Lavare la piastra 6 volte con 150 microlitri 1xPBS con la discarica e il metodo di macchia. </li><li> Aggiungere 100 l di PBS in ciascun pozzetto della piastra utilizzando il pipettatore multicanale. </li><li> Mettete la placca in frigorifero per 15 minuti. </li><li> Prendete il piatto dal frigorifero e posizionarlo nel cappuccio coltura di tessuti. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpi biotina <ul><li> Aggiungere 0,5 mg / mL di anticorpi biotina (mAb 7-B6-1) a 11ml di PBS. </li><li> Vortex la soluzione a mescolare bene. </li><li> Se il programma di aggiungere la soluzione con un multicanale, versatelo in un serbatoio. </li></ul></li><li> Eliminare il PBS da sfogliando in cestino. Fare attenzione a non bagnare il piatto mentre dumping. </li><li> Mettere 100 microlitri della soluzione in ogni pozzetto. </li><li> Incubare la piastra nel cofano di coltura tissutale a temperatura ambiente per un'ora. </li><li> Lavare piastra 6 volte con 150μL 1xPBS con la discarica e il metodo di macchia. Sul lavare 6 °, lasciare la PBS nel piatto prima di aver preparato l'anticorpo Streptavidina. </li><li> Preparare l'anticorpo Streptavidina. <ul><li> Aggiungere 5,5 μ l Streptavidina anticorpi (streptavidina-ALP) a 11ml di PBS (diluizione 1:2000). </li><li> Vortex la soluzione a mescolare bene. </li><li> Se il programma di aggiungere la soluzione con un multicanale, versatelo in un serbatoio. </li></ul></li><li> Gettare la PBS rimanenti nei pozzetti e asciugare la piastra. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di soluzione di streptavidina in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare la piastra nel cofano di coltura tissutale a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare le piastre 6 volte con PBS usando la discarica e il metodo di macchia. Sul lavare 6 °, lasciare la PBS sul piatto fino a quando non hanno fatto la soluzione del colore. </li><li> Lavorare al buio. Preparare la soluzione di substrato per la fosfatasi alcalina (fosfatasi alcalina substrato Kit IV BCIP / NBT): <ul><li> Aggiungere 4 gocce di reagente substrato 1-11 ml Tampone Tris, vortice bene. Aggiungere 4 gocce di reagente substrato da 2 a tampone Tris, vortice bene. Aggiungere 4 gocce di reagente substrato 3 a tampone Tris, vortice bene. </li></ul></li><li> Eliminare le rimanenti PBS e asciugare la piastra. </li><li> Aggiungere 100 microlitri della soluzione del colore a ciascun pozzetto della piastra con il multicanale. </li><li> Accendere la luce, dopo 5 a 10 minuti di colore via di sviluppo. </li><li> Lasciare i reagenti colore di rimanere sul piatto fino a quando i punti cominciano a diventare viola e sono abbastanza scure. Questo dovrebbe richiedere da 5 a 20 minuti. Fare attenzione a non lasciare la soluzione substrato troppo a lungo, perché ciò potrebbe causare fondo elevato. </li><li> Lavare la piastra ELISPOT 3 volte con l'acqua del rubinetto. </li><li> Lasciare asciugare per circa un'ora o durante la notte. </li><li> Leggere la piastra manualmente o con lettore di piastre ELISPOT. </li><li> Conservare la piastra in una scatola lontano da esposizione alla luce. </li></ol> Rappresentante dei risultati: ELISPOT è stato progettato per quantificare la risposta immunitaria contro gli antigeni microbici. Ogni spot indica una singola cellula di risposta, che esprime la citochina di interesse. Gli spot possono essere contati manualmente o tramite un lettore di piastre ELISPOT. Valutazione che il ELISPOT è stato eseguito correttamente dovrebbe iniziare con un'indagine del controllo negativo per la produzione sfondo della citochina di interesse. Nei pozzetti di controllo negativo ci si aspetterebbe di vedere nessuna macchia, anche se un po 'di storia (colore viola) possono essere presenti. Tipicamente, ci deve essere inferiore a una media di cinque punti per bene. I pozzi di controllo positivi confermano che la reazione è stata eseguita correttamente e che le cellule sono sensibili alla stimolazione antigenica. Nei pozzetti di controllo positivo che ci si aspetterebbe di vedere uno sfondo viola scuro a causa di una confluenza di macchie (Fig. 1). Ci dovrebbe essere poco o nessun sfondo bianco. Se il controllo positivo e negativo sono campioni di controllo adeguati, si può poi contare i pozzetti contenenti l'antigene di interesse. Un risultato "non ottimale" sarebbe riflessa dal fondo alto (i pozzi sono viola), senza punti o macchie molto pochi, il centro vuoto, macchie mal definiti o macchie confluenti. Una lista di suggerimenti per la risoluzione è previsto (tabella 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un rappresentante della piastra ELISPOT. Ogni piastra deve contenere un controllo positivo, controllo negativo e peptidi di interesse condotto presso il minimo di due pozzi. C9, C10, D9 e D10 sono i pozzetti di controllo positivi, come potete vedere c'è un colore rosso porpora, le cellule confluenti e quasi nessuno sfondo bianco. I pozzi di controllo negativo sono G11, G12, H11 e H12. Questi pozzi non hanno sfondo viola e senza punti come previsto. I punti del G7, G8, H7 e H8, illustrare le risposte cellulari ai peptidi microbici; i punti viola rappresentano una singola cellula di risposta che esprime la citochina di interesse. Tabella 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Osservazione </td><td> Problema Possibile </td><td> Soluzione possibile </td></tr><tr><td> Sfondo ad alta </td><td> 1. Entrambi i lati della membrana non lavate correttamente 2. Troppe cellule secernenti citochine 3. Piastra non secchi correttamente 4. Sulla piastra sviluppato </td><td> 1. Lavare entrambi i lati della membrana con acqua distillata prima e dopo lo sviluppo del colore. Reagenti può fuoriuscire attraverso la membrana nella base del piatto, e questi possono causare elevato background se non lavato via. 2. Ridurre il numero di cellule per pozzetto, questo richiederà l'ottimizzazione 3. Secco il piatto più a lungo prima lettura 4. Ridurre i tempi di sviluppo </td></tr><tr><td> Senza punti / Spot Pochissime </td><td> 1. Non abbastanza cellule secernenti citochine / proteine ​​di interesse 2. Assicurarsi che le cellule vengono stimolate correttamente 3. Cellule non incubate per long abbastanza o potrebbe richiedere del tempo per rispondere alla stimolante 4. Colore sviluppo inadeguato 5. Anticorpi non abbastanza primaria o secondaria </td><td> 1. Aumentare il numero di cellule. Ciò richiederà l'ottimizzazione 2. Inoltre possibile utilizzare un controllo positivo stimolo - uno stimolante che sapete che inducono l'espressione di citochine vostro / proteine ​​di interesse 3. Aumentare il tempo di incubazione di cellule o di utilizzare il metodo indiretto (pre-trattamento di cellule con stimolanti) 4. Monitorare lo sviluppo del colore con un microscopio in testa e assicurarsi che i reagenti di sviluppo sono stati conservati correttamente e non hanno perso l'attività 5. Concentrazione dell'anticorpo primario e / o secondaria dovrà essere aumentato. Ciò richiede l'ottimizzazione. </td></tr><tr><td> Aree vuoto </td><td> 1. Membrana non pre-trattati 2. Membrana si è asciugata in qualche fase 3. Cellule irregolarmente distribuite </td><td> 1. Garantire membrana è adeguatamente pretrattati con etanolo al 70% (tutte le membrane non hanno bisogno di questo in modo da verificare con il fornitore). Lavare bene con PBS 3X dopo 2. Garantire membrana non si secchi 3. Assicurarsi di mescolare delicatamente le cellule di avere un buon omologo sospensione cellulare prima di pipettaggio fuori nei pozzetti </td></tr><tr><td> Centro vuoto </td><td> 1. Danni derivanti dal lavaggio </td><td> 1. Portata in lavaggio automatico (o pipette) potrebbe essere troppo alto. Hai bisogno di una procedura di lavaggio più delicato </td></tr><tr><td> Falsi Positivi </td><td> 1. Aggregati anticorpo secondario 2. Cellule ancora sulla membrana 3. Coltura cellulare contaminazione </td><td> 1. Filtrare l'anticorpo secondario 2. Assicurarsi che tutte le cellule sono lavate dalla membrana con PBS Tween 20 prima di incubazione anticorpo secondario. Cellule sinistra sulla membrana darà irregolari macchie a forma di 3. Mantenere i reagenti come sterile e pulito possibile. Garantire la vostra tecnica di coltura cellulare è asettico. Verificare la presenza di falsi positivi eseguendo un controllo negativo dei media. Per i movimenti delle griglie, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">vedere i punti mal definiti</a> </td></tr><tr><td> Spot confluenti </td><td> 1. Povero rivestimento, anticorpi troppo 2. Coltura cellulare prolungato 3. Cellule sovra-stimolata </td><td> 1. Ridurre la concentrazione di anticorpi primari 2. Più a lungo le cellule sono incubate, più citochina / proteine ​​saranno secernono. Questo si tradurrà in grandi macchie che inizierà a fondersi e diventare indistinguibili. 3. Ridurre il tempo di coltura cellulare fase di incubazione. Eccesso di stimolazione si tradurrà in un sacco di citochine / proteine ​​essere secreta dalla cellula. Questo produrrà macchie che inizierà a fondersi e diventare indistinguibili. Ridurre la quantità di stimolanti nei terreni di coltura o di cultura per un periodo di tempo più breve </td></tr><tr><td> Spot mal definiti </td><td> 1. Membrana non pre-trattati (se la membrana lo richiede, verificare con il fornitore) 2. Movimento piastra durante l'incubazione delle cellule </td><td> 1. La membrana deve essere pre-trattati con etanolo o questo può portare a fuzzy, luoghi scarsamente definiti. Sarà difficile per il lettore a distinguere questi 2. Non lasciare che la piastra di muoversi durante l'incubazione delle cellule come le cellule che si sono trasferiti creerà più di un punto. Se possibile utilizzare un apposito incubatore che non sarà aperto durante l'incubazione. Non toccare la piastra dopo aver aggiunto le cellule </td></tr><tr><td> Positivo Pozzetti di controllo è basso </td><td> 1. Sottosviluppo - può essere una conseguenza dell'uso di streptavidina-ALP e / o BCIP / NBT soluzioni che non sono stati portati a temperatura ambiente </td><td> 1. Portare i reagenti a temperatura ambiente prima di aggiungere ai pozzetti </td></tr><tr><td> La densità dei punti rende difficile quantificarli </td><td> 1. Troppe cellule sono stati aggiunti ai pozzetti </td><td> 1. Diluire di cellule (cioè 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 cellule per pozzetto) per determinare il numero ottimale di cellule che si tradurrà in formazione di macchie distinte </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li>
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<li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., Côté, P., Baril, J. G., Thomas, R., Vézina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., Sékaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il saggio ELISPOT è emerso come uno dei saggi più importanti e ampiamente utilizzati per monitorare le risposte immunitarie negli umani e una varietà di altre specie. Con il saggio ELISPOT, frequenze di cellule immunitarie può essere misurata a livello di singola cellula senza espansione o la manipolazione di popolazioni di cellule. Saggio ELISPOT è stato ampiamente applicato per indagare antigene risposta immunitaria specifica in varie malattie tra cui infezioni, tumori, allergie e malattie autoimmuni. L&#39;applicazio...

A. Preparazione di Media <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="Materiali A"> B. Preparazione del tampone Tris <ol><li> Aggiungere 800 ml di DDH 2 O a 1 bicchiere L. </li><li> Misura 12 grammi di Tris e aggiungere il bicchiere. </li><li> Aggiungere 0,12 grammi di magnesio cloruro esaidrato (MgCl 2: 6H 2 O) nel becher. </li><li> Mescolare con agitatore magnetico in automatico piatto mescolando. </li><li> Una volta disciolto, il pH della soluzione a 9,5. </li><li> Aggiungere 200 ml di DDH 2 O per il bicchiere, portandolo fino a 1000 ml. </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro di 0,22 micron. </li></ol> Materiali C. necessarie per l'analisi ELISPOT: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="Materiali B">

enzyme-linked immunospot assay (elispot): quantificazione di th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Immunità adattiva è una componente importante della clearance dei patogeni intracellulari. La capacità di rilevare e quantificare queste risposte negli esseri umani è un importante strumento diagnostico. L&#39;analisi enzima-collegata immunospot (ELISPOT) sta guadagnando popolarità per la sua capacità di identificare le risposte immunitarie cellulari contro gli antigeni microbici, comprese le popolazioni immunodepressi, come quelli con infezione da HIV, trapianto e uso di steroidi. Questo test ha la capacità di quantificare le risposte immunitarie contro specifici antigeni microbici, così come distinguere se queste risposte sono Th1 e Th2 nel carattere. ELISPOT non si limita al sito di infiammazione. E &#39;versatile nella sua capacità di valutare per le risposte immunitarie all&#39;interno del sangue periferico, così come i luoghi di coinvolgimento attivo, come lavaggio broncoalveolare, liquido cerebro-spinale, e ascite. Rilevazione delle risposte immunitarie contro una antigeni singoli o multipli è possibile, così come epitopi specifici all&#39;interno di proteine ​​microbiche. Questo saggio facilita la rilevazione di risposte immunitarie nel corso del tempo, così come distinzioni antigeni riconosciuti dalle cellule T ospite. Doppio ELISPOT colori sono disponibili per il rilevamento di espressione simultanea di due citochine. Recenti applicazioni di questa tecnica sono la diagnosi di tubercolosi extrapolmonare, nonché la ricerca del contributo di antigeni infettive alle malattie autoimmuni.

L&#39;identificazione di bersagli microbici di immunità adattativa nelle malattie idiopatica può essere realizzato tramite l&#39;uso delle analisi enzima-collegata immunospot.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantificazione di Th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici

L'immunità adattativa è una componente fondamentale per l'eliminazione dei patogeni intracellulari. La capacità di rilevare e quantificare tali risposte negli esseri umani è un...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare le risposte dei linfociti T agli antigeni di interesse. Questo viene ottenuto innanzitutto mediante codifica con anticorpi di cattura. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere cellule e antigeni di interesse e quindi incubare per tutta la notte.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere gli anticorpi di rilevamento. L'ultimo passaggio della procedura è lo sviluppo della piastra con reagenti substrato e l'analisi delle macchie. Alla fine, è possibile ottenere risultati che identificano le citochine di interesse attraverso l'analisi delle unità formanti macchie.Ciao, mi chiamo dott.ssa Ki Richter e sono un'istruttore di ricerca nel laboratorio del dott. Wonder Drake presso la Vanderbilt University, nella divisione di Malattie Infettive. Oggi illustreremo la tecnica Ellie Spot, nota anche come saggio immunoenzimatico su membrana (ELISPOT). I dott.ssa Isfahan Chambers e Tiffany Cone vi mostreranno la tecnica oggi.Per mantenere gli standard della coltura cellulare, eseguire le manipolazioni in condizioni sterili all'interno della cappa, aprire una piastra con pozzetti allineati e lavarla tre volte con PBS. Preparare una soluzione di rivestimento dell'anticorpo di cattura in PBS. Mescolare accuratamente mediante vortex per comodità.Trasferire la soluzione di anticorpo in un serbatoio per la pipetta multicanale ed aliquotare 100 microlitri di soluzione di rivestimento in ciascun pozzetto. Sigillare bene la piastra con perfil e collocarla in frigorifero per tutta la notte. Queste piastre rivestite con anticorpo sono stabili per settimane.La regola pratica stabilisce che una piastra può essere utilizzata se nei pozzetti è ancora presente del liquido. Per preparare le cellule per questo saggio, colorare le cellule mononucleate del sangue periferico appena isolate con trien blu per verificarne la vitalità e contarle. Seminare i PBMC a 2 milioni di cellule per millilitro nel nostro mezzo 10 e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Per tenere traccia dell'esperimento, etichettare il coperchio della piastra Ali spot con il numero di identificazione del campione, le condizioni dei pozzetti e la data.Lavare la piastra sei volte con PBS sterile utilizzando il metodo di svuotamento e asciugatura. Prestare attenzione a non provocare schizzi durante lo svuotamento, poiché ciò potrebbe causare l'insorgenza di un colore viola nei pozzetti della piastra. Aggiungere il nostro mezzo 20 in ogni pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.Mentre la piastra è in incubazione, conta le cellule che sono state lasciate in riposo durante la notte. Raccogli i PBMC mediante centrifugazione. Decanta il soprannatante e risospendi il pellet nel nostro mezzo 10 a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro.Dopo l'incubazione di un'ora della piastra con i punti di alleli, rimuovere il mezzo R 20 utilizzando il metodo di rovesciamento e asciugatura. Fare attenzione a non provocare schizzi durante lo svuotamento. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare a ciascuno.Seguire il disegno sperimentale aggiungendo i peptidi e gli antigeni nei pozzetti di prova corrispondenti. Includere sempre un controllo negativo con cellule senza peptidi e anche dei pozzetti di controllo positivo con fitoemagglutinina aggiunta. Incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Lavare la piastra sei volte con 150 microlitri di XPBS utilizzando il metodo di svuotamento e asciugatura. Aggiungere 100 microlitri di PBS in ogni pozzetto della piastra e collocare la piastra in frigorifero o a temperatura ambiente per 15 minuti. Nel frattempo, preparare la soluzione di anticorpo biotinilato in PBS.Prendere la piastra ALI dal frigorifero e scartare il PBS agitandolo nel cestino dei rifiuti. Fare attenzione a non schizzare la piastra durante il travaso di un aliquota della soluzione di anticorpo biotinilato in ogni pozzetto e incubare la piastra nell'incubatore per colture cellulari a temperatura ambiente per un'ora. Lavare la piastra sei volte con PBS utilizzando il metodo di svuotamento e asciugatura con carta da filtro nell'ultimo lavaggio.Lasciare ora il PBS sulla piastra. Preparare la soluzione dell'anticorpo STREPTAVIDINA in PBS, assicurandosi di vortexare la soluzione per miscelarla. Rimuovere l'ultimo lavaggio con PBS dai pozzetti e posizionare la piastra con i punti ALI.Aggiungere la soluzione di anticorpo streptavidina in ogni pozzetto e incubare la piastra nell'incubatore per colture cellulari a temperatura ambiente per un'ora. Per rimuovere l'eccesso di anticorpo trevain, lavare la piastra sei volte con PBS utilizzando il metodo di svuotamento e asciugatura nell'ultimo lavaggio, lasciando il PBS sulla piastra. Considerata la sensibilità alla luce della soluzione del substrato fosfatasi alcalina B-C-I-P-M-B-T.Procedere al buio durante la preparazione della soluzione del substrato, come descritto dal produttore nel kit del substrato per fosfatasi alcalina; eliminare il PBS rimanente dai pozzetti e asciugare delicatamente la piastra. Aggiungere la soluzione del substrato in ciascun pozzetto e accendere la luce. Dopo un tempo di sviluppo del colore compreso tra cinque e dieci minuti, lasciare i reagenti sulla piastra finché le macchie iniziano a diventare viola e risultano ben scure.Ciò richiede fino a 20 minuti. Lavare la piastra Ali spot tre volte con acqua del rubinetto e lasciare asciugare all'aria. Ogni piastra contiene un controllo positivo, un controllo negativo e il peptide di interesse, eseguiti al minimo in duplicato.Le pozzette del controllo positivo presentano un colore viola scuro che riflette uno strato confluenziale di cellule e quasi nessuno sfondo bianco. Le pozzette del controllo negativo non presentano sfondo viola né macchie, come previsto. Le pozzette del campione in prova illustrano le risposte cellulari ai peptidi microbici in questo caso.Le macchie viola rappresentano una singola cellula responsiva che esprime la citochina di interesse durante l'esecuzione della tecnica LA spot. Prestare attenzione a non forare la membrana con le punte della pipetta né permettere al piatto di asciugarsi, poiché ciò comporterebbe un fondo elevato.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

La caratterizzazione di epitopi per cellule T di patogeni che causano infezioni localizzate, come il papillomavirus umano, rappresenta una sfida a causa del numero limitato di cellule T in circolo. Viene descritto un metodo mediante il quale cellule T rare sono state isolate e caratterizzate a partire da un numero molto ridotto di cellule.

L&#39;uso di interferone-γ Enzyme-linked Assay Immunospot per caratterizzare Nuovi epitopi T-cellulari di Papillomavirus Umano

Questo video dimostra l'uso del test ELISpot per valutare la funzione delle cellule B che secernono anticorpi, ASC. Gli anticorpi secreti dalle ASC interagiscono con i frammenti di anticorpi policlonali legati alla membrana, che vengono rilevati dagli anticorpi IgG o IgM coniugati con enzimi. La macchia colorata prodotta in ogni pozzetto indica la presenza dell'isotipo dell'anticorpo specifico, che è correlato all'attività secretoria delle cellule B.

Valutazione funzionale delle cellule B secernenti anticorpi mediante saggio ELISpot

Generazioni di nuovi saggi funzionali quali interferone gamma (IFN-γ) ELISpot, che rilevano la produzione di citochine a livello di singola cellula e forniscono sia la caratterizzazione quantitativa e qualitativa delle risposte delle cellule T possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria cellulo-mediata contro varicella zoster virus (VZV).

Sviluppo di un Varicella-Zoster immunità cellulo-mediata specifica-Virus-IFN γ ELISpot test per valutare seguito cordone ombelicale trapianto di sangue

A lungo termine colta interferone-γ enzimatico test immunospot viene usato come misura di risposte di memoria centrale e correla con le risposte vaccino anti-micobatteri protettivi. Con questo test, le cellule mononucleari del sangue periferico sono stimolati con antigeni micobatterici e interleuchina-2 per 14 giorni, differenziazione e consentendo l'espansione delle cellule T di memoria centrale.

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

Il sangue periferico umano è comunemente usato per la valutazione della risposta immunitaria umorale. Qui vengono descritti i metodi per isolare le cellule B umane dal sangue periferico, differenziare le cellule B umane in cellule B secernenti anticorpi (ASC) in coltura ed enumerare le IgM- e IgG-ASC totali tramite un test ELISpot.

L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

QA-1 (HLA-E nell'uomo) appartiene ad un gruppo di molecole complesse 1b non classici di istocompatibilità. Immunizzazione con gli epitopi Qa-1-associazione ha dimostrato di aumentare la regolazione immunitaria tessuto-specifici e migliorare diverse malattie autoimmuni. Qui descriviamo una strategia di libreria del peptide sovrapposti per l'identificazione di epitopi di Qa-1 in una proteina.

Libreria del Peptide per mappare gli epitopi di Qa-1 in una proteina di sovrapposizione

In questo articolo, descriviamo un protocollo per caratterizzare le risposte di isotipo dell'immunoglobulina (Ig) T-dipendenti e T-indipendente in topi usando ELISA. Questo metodo usato da solo o in combinazione con flusso cytometry permetterà ai ricercatori di identificare le differenze nelle risposte di isotipo Ig B cellulo-mediata nei topi dopo immunizzazione antigene T-dipendente e T-indipendente.

Caratterizzazione delle risposte di isotipo dell'immunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente

Lo sviluppo del test ELISpot interferone per la cavia PBMCs permette la caratterizzazione delle risposte delle cellule T in questo modello altamente rilevante per lo studio delle malattie infettive. Abbiamo applicato il test per misurare le risposte delle cellule T associate intradermica consegna di vaccini a DNA.

Ottimizzazione del interferone-gamma ELISpot analisi di risposte a cellula T misura nel modello cavia dopo la vaccinazione

Qui, presentiamo un protocollo per l'ex vivo determinazione qualitativa dell'antigene-specifiche CD8+ T cellule. L'analisi è possibile con sospensioni di cellule singole da organi o da piccole quantità di sangue. Una vasta gamma di studi richiedono l'analisi delle risposte a cellula T citotossica (vaccinazione e studi di immunoterapia del cancro).

Determinazione quantitativa simultanea delle anti-vettore e Anti-transgene-Specific CD8+ T cellule tramite MHC I tetramero colorazione dopo la vaccinazione con un vettore virale

Il protocollo presenta metodi dettagliati per valutare se l'adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D promuove risposte immunitarie cellulari efficaci.

In vitro Valutazione dell'attività cellulare del vaccino adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D

Scopri come rilevare le risposte delle cellule T agli antigeni microbici mediante l'assay ELISPOT. Questa tecnica consente di quantificare le citochine Th-1 e identificare bersagli microbici nelle malattie idiopatiche.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantificazione di Th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici

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