Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantificazione di Th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare le risposte dei linfociti T agli antigeni di interesse. Questo viene ottenuto innanzitutto mediante codifica con anticorpi di cattura. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere cellule e antigeni di interesse e quindi incubare per tutta la notte.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere gli anticorpi di rilevamento. L'ultimo passaggio della procedura è lo sviluppo della piastra con reagenti substrato e l'analisi delle macchie. Alla fine, è possibile ottenere risultati che identificano le citochine di interesse attraverso l'analisi delle unità formanti macchie.

Ciao, mi chiamo dott.ssa Ki Richter e sono un'istruttore di ricerca nel laboratorio del dott. Wonder Drake presso la Vanderbilt University, nella divisione di Malattie Infettive. Oggi illustreremo la tecnica Ellie Spot, nota anche come saggio immunoenzimatico su membrana (ELISPOT). I dott.ssa Isfahan Chambers e Tiffany Cone vi mostreranno la tecnica oggi.

Per mantenere gli standard della coltura cellulare, eseguire le manipolazioni in condizioni sterili all'interno della cappa, aprire una piastra con pozzetti allineati e lavarla tre volte con PBS. Preparare una soluzione di rivestimento dell'anticorpo di cattura in PBS. Mescolare accuratamente mediante vortex per comodità.

Trasferire la soluzione di anticorpo in un serbatoio per la pipetta multicanale ed aliquotare 100 microlitri di soluzione di rivestimento in ciascun pozzetto. Sigillare bene la piastra con perfil e collocarla in frigorifero per tutta la notte. Queste piastre rivestite con anticorpo sono stabili per settimane.

La regola pratica stabilisce che una piastra può essere utilizzata se nei pozzetti è ancora presente del liquido. Per preparare le cellule per questo saggio, colorare le cellule mononucleate del sangue periferico appena isolate con trien blu per verificarne la vitalità e contarle. Seminare i PBMC a 2 milioni di cellule per millilitro nel nostro mezzo 10 e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Per tenere traccia dell'esperimento, etichettare il coperchio della piastra Ali spot con il numero di identificazione del campione, le condizioni dei pozzetti e la data.

Lavare la piastra sei volte con PBS sterile utilizzando il metodo di svuotamento e asciugatura. Prestare attenzione a non provocare schizzi durante lo svuotamento, poiché ciò potrebbe causare l'insorgenza di un colore viola nei pozzetti della piastra. Aggiungere il nostro mezzo 20 in ogni pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.

Mentre la piastra è in incubazione, conta le cellule che sono state lasciate in riposo durante la notte. Raccogli i PBMC mediante centrifugazione. Decanta il soprannatante e risospendi il pellet nel nostro mezzo 10 a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro.

Dopo l'incubazione di un'ora della piastra con i punti di alleli, rimuovere il mezzo R 20 utilizzando il metodo di rovesciamento e asciugatura. Fare attenzione a non provocare schizzi durante lo svuotamento. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare a ciascuno.

Seguire il disegno sperimentale aggiungendo i peptidi e gli antigeni nei pozzetti di prova corrispondenti. Includere sempre un controllo negativo con cellule senza peptidi e anche dei pozzetti di controllo positivo con fitoemagglutinina aggiunta. Incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Lavare la piastra sei volte con 150 microlitri di XPBS utilizzando il metodo di svuotamento e asciugatura. Aggiungere 100 microlitri di PBS in ogni pozzetto della piastra e collocare la piastra in frigorifero o a temperatura ambiente per 15 minuti. Nel frattempo, preparare la soluzione di anticorpo biotinilato in PBS.

Prendere la piastra ALI dal frigorifero e scartare il PBS agitandolo nel cestino dei rifiuti. Fare attenzione a non schizzare la piastra durante il travaso di un aliquota della soluzione di anticorpo biotinilato in ogni pozzetto e incubare la piastra nell'incubatore per colture cellulari a temperatura ambiente per un'ora. Lavare la piastra sei volte con PBS utilizzando il metodo di svuotamento e asciugatura con carta da filtro nell'ultimo lavaggio.

Lasciare ora il PBS sulla piastra. Preparare la soluzione dell'anticorpo STREPTAVIDINA in PBS, assicurandosi di vortexare la soluzione per miscelarla. Rimuovere l'ultimo lavaggio con PBS dai pozzetti e posizionare la piastra con i punti ALI.

Aggiungere la soluzione di anticorpo streptavidina in ogni pozzetto e incubare la piastra nell'incubatore per colture cellulari a temperatura ambiente per un'ora. Per rimuovere l'eccesso di anticorpo trevain, lavare la piastra sei volte con PBS utilizzando il metodo di svuotamento e asciugatura nell'ultimo lavaggio, lasciando il PBS sulla piastra. Considerata la sensibilità alla luce della soluzione del substrato fosfatasi alcalina B-C-I-P-M-B-T.

Procedere al buio durante la preparazione della soluzione del substrato, come descritto dal produttore nel kit del substrato per fosfatasi alcalina; eliminare il PBS rimanente dai pozzetti e asciugare delicatamente la piastra. Aggiungere la soluzione del substrato in ciascun pozzetto e accendere la luce. Dopo un tempo di sviluppo del colore compreso tra cinque e dieci minuti, lasciare i reagenti sulla piastra finché le macchie iniziano a diventare viola e risultano ben scure.

Ciò richiede fino a 20 minuti. Lavare la piastra Ali spot tre volte con acqua del rubinetto e lasciare asciugare all'aria. Ogni piastra contiene un controllo positivo, un controllo negativo e il peptide di interesse, eseguiti al minimo in duplicato.

Le pozzette del controllo positivo presentano un colore viola scuro che riflette uno strato confluenziale di cellule e quasi nessuno sfondo bianco. Le pozzette del controllo negativo non presentano sfondo viola né macchie, come previsto. Le pozzette del campione in prova illustrano le risposte cellulari ai peptidi microbici in questo caso.

Le macchie viola rappresentano una singola cellula responsiva che esprime la citochina di interesse durante l'esecuzione della tecnica LA spot. Prestare attenzione a non forare la membrana con le punte della pipetta né permettere al piatto di asciugarsi, poiché ciò comporterebbe un fondo elevato.