Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantificazione di Th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare le risposte delle cellule T agli antigeni di interesse. Ciò si ottiene codificando prima con gli anticorpi di cattura. Il secondo passo della procedura consiste nell'aggiungere cellule e antigeni di interesse e quindi incubare durante la notte.

Il terzo passo della procedura consiste nell'aggiungere gli anticorpi di rilevamento. La fase finale della procedura consiste nello sviluppo della piastra con i reagenti del substrato e nell'analisi dei punti. In definitiva, è possibile ottenere risultati che hanno scelto le citochine di interesse attraverso l'analisi delle unità di formazione spot.

Ciao, mi chiamo Dr.Ki Richter e sono un istruttore di ricerca presso il laboratorio del Dr.Wonder Drake presso la Vanderbilt University nella divisione di Malattie Infettive. Oggi dimostriamo la tecnica Ellie Spot, nota anche come test immuno spot enzimatico. Il Dr.Isfahan Chambers e Tiffany Cone dimostreranno la tecnica per te oggi.

Al fine di mantenere gli standard di coltura cellulare, eseguire manipolazioni in condizioni sterili nella cappa, aprire una piastra spot alleata e lavare tre volte con PBS. Preparare una soluzione di rivestimento dell'anticorpo di cattura in PBS. Mescolare bene a vortice per comodità.

Trasferire la soluzione di anticorpi in un serbatoio per il multicanale, pipettatore e aliquotare 100 microlitri di soluzione di rivestimento in ciascuno. Sigillare bene il piatto con perfil e metterlo in frigorifero per una notte. Queste piastre rivestite di anticorpi sono buone per settimane.

La regola empirica impone che una piastra possa essere utilizzata se c'è ancora del liquido rimasto nei pozzetti. Per preparare le cellule per questo test, colorare le cellule mononucleate del sangue periferico appena isolate con blu trien per verificarne la vitalità e contarle: Placcare il pbmc a 2 milioni di cellule per millilitro nei nostri 10 terreni e incubare per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Per tenere traccia dell'esperimento, etichettare il coperchio della piastra spot Ali con il numero di identificazione del campione, le condizioni del pozzetto e la data.

Lavare la piastra sei volte con PBS sterile utilizzando il metodo dump and blot. Fare attenzione a non schizzare la piastra durante lo scarico, in quanto ciò potrebbe causare la colorazione viola dei pozzetti della piastra. Aggiungere i nostri 20 terreni in ogni pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.

Mentre la piastra è in incubazione, contare le cellule che sono state fatte riposare durante la notte. Raccogliere il pbmc mediante centrifugazione. Decantare il surnatante e risospendere il pellet nei nostri 10 terreni a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro.

Dopo un'ora di incubazione della piastra spot dell'alleato, rimuovere il terreno R 20 utilizzando il metodo dump and blot. Fare attenzione a non schizzare la piastra durante lo scarico. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare a ciascuno.

Seguire il disegno sperimentale con l'aggiunta di peptidi e antigeni ai pozzetti di test corrispondenti. Includere sempre un controllo negativo delle cellule senza peptidi e anche pozzetti di controllo positivi con aggiunta di fitoemoagglutinina. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Lavare la piastra sei volte con 150 microlitri di un XPBS utilizzando il metodo dump and blot. Aggiungere 100 microlitri di PBS in ogni pozzetto del piatto e riporre il piatto in frigorifero o a temperatura ambiente per 15 minuti. Nel frattempo, preparare la soluzione di anticorpi alla biotina in PBS.

Estrarre la piastra spot ALI dal frigorifero e gettare il PBS gettandolo nel cestello dei rifiuti. Fare attenzione a non spruzzare la piastra mentre si versa un'aliquota della soluzione di anticorpi della biotina in ciascun pozzetto e incubare la piastra nella cappa di coltura tissutale a temperatura ambiente per un'ora. Lavare il piatto sei volte con PBS utilizzando il metodo dump and blot nell'ultimo lavaggio.

Lascia il PBS sul piatto ora. Preparare la soluzione di anticorpi STREPTAVIDIN in PBS, assicurandosi di agitare la soluzione per mescolarla. Scartare bene l'ultimo lavaggio PBS dai pozzetti e tracciare la piastra spot ALI.

Aggiungere la soluzione di anticorpi streptavidina a ciascun pozzetto e incubare la piastra nella cappa di coltura tissutale a temperatura ambiente per un'ora. Per rimuovere l'eccesso di anticorpi trevain, lavare la piastra sei volte con PBS utilizzando il metodo dump and blot all'ultimo lavaggio, portare il PBS sulla piastra. Data la sensibilità alla luce della soluzione di substrato di fosfatasi alcalina B-C-I-P-M-B-T.

Lavorare al buio durante la preparazione della soluzione del gambo, come descritto dai produttori nelle istruzioni del kit del substrato della fosfatasi alcalina, scartare il PBS rimanente dai pozzetti e tamponare la piastra a punti. Aggiungere la soluzione di substrato a ciascun pozzetto e accendere la luce. Dopo 5-10 minuti di sviluppo del colore, lasciare che i reagenti rimangano sulla piastra fino a quando le macchie iniziano a diventare viola e sono piuttosto scure.

Questa operazione richiede fino a 20 minuti. Lavare la piastra spot Ali tre volte con acqua di rubinetto e lasciarla asciugare all'aria. Ogni piastra contiene un controllo positivo, un controllo negativo e un peptide di interesse condotti almeno in duplicato.

I pozzetti di controllo positivo sono di un colore viola intenso che riflette uno strato confluente di cellule e quasi nessuno sfondo bianco. I pozzetti di controllo negativo non hanno sfondo viola e non hanno macchie come previsto. I pozzetti del campione di prova illustrano qui le risposte cellulari ai peptidi microbici.

Le macchie viola rappresentano una singola cellula responsiva che esprime la citochina di interesse quando si esegue la tecnica dello spot LA. Fare attenzione a non forare la membrana con i puntali delle pipette o a lasciare asciugare la piastra perché ciò porterà a un fondo elevato.