Indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella Lino

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo per coltivare una varietà di lino inducibile in condizioni che risultano variazioni genomiche ereditabili. Inoltre, vengono monitorati i cambiamenti genomici e viene osservata la crescita delle piante indotte nelle generazioni successive nei vari ambienti. Per raggiungere questo obiettivo, il lino viene coltivato in una varietà di condizioni induttrici.

Il tessuto fogliare e del fusto di Maris viene poi raccolto in vari momenti durante la crescita delle piante sotto i vari ambienti. Successivamente, il DNA e l'RNA vengono isolati dai campioni di tessuto. La fase finale della procedura consiste nell'eseguire la PCR utilizzando i campioni di DNA e Q-R-T-P-C-R utilizzando l'RNA isolato per identificare i cambiamenti genomici e i cambiamenti di espressione genica derivanti dalla crescita in diverse condizioni ambientali.

In definitiva, si possono ottenere risultati per mostrare la risposta genomica alle condizioni di crescita con la comparsa dell'elemento di inserzione LIS one in un punto specifico del genoma e le differenze di espressione associate alla presenza di quell'elemento come visualizzato mediante PCR e R-T-P-C-R eseguita con acido nucleico isolato dai tessuti delle piante trattate. Ciao, sono Chris Cull del Dipartimento di Biologia della Case Western Reserve University. Sono Cory Johnson del Cull Lab.

E io sono Tiffany Moss, anche lei del laboratorio di abbattimento. E io sono Marshall Lucas. Uno studente universitario nel programma estivo per la ricerca universitaria presso il laboratorio Cull.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i cambiamenti nel genoma e nell'espressione genica derivanti da variazioni nell'ambiente di crescita. Quindi iniziamo. Per coltivare il lino in condizioni induttive, inizia riempiendo vasi da cinque pollici con terra e rassodando.

La prossima pianta, tre semi di lino per vaso, profondi un quarto di pollice. Quindi dal terreno sopra i semi per le condizioni di controllo non induttive. Innaffia le piante con 100 millilitri di una soluzione miracolosa per la coltivazione della decima forza.

Trattare le piante in condizioni di alto contenuto nutritivo con 100 millilitri di piena forza. Miracolo di crescere. Infine fai domanda.

Acqua del rubinetto solo per le piante a basso contenuto di nutrienti. Coltiva le piante sotto la luce naturale durante l'estate man mano che le piante crescono. Innaffia tutte le piante con un sistema di spruzzatura automatico due volte al giorno per cinque minuti.

Applicare le condizioni di crescita alle piante una volta alla settimana. Raccogli le foglie in steli di mari a intervalli settimanali. Sei foglie vengono raccolte per l'estrazione del DNA e tre steli di me sono necessari per l'estrazione dell'RNA dopo la raccolta, posizionare il materiale vegetale in una fiala criogenica, congelarlo rapidamente in azoto liquido e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione.

I tre genotipi crescono a tassi relativi diversi a seconda delle condizioni. In condizioni di controllo, la varietà di lino consanguinea storm o la linea PL crescono meglio. Diverse linee sono derivate da questo genitore con una varietà grande o L più vigorosa della varietà piccola o S.

Tuttavia, con bassi nutrienti S cresce meglio di L o pl. E in condizioni di nutrienti elevati, L cresce meglio di pl, che cresce solo leggermente meglio di S.Un confronto tra ciascuna delle linee coltivate con i tre diversi trattamenti rivela che PL cresce meglio in condizioni di controllo. L cresce meglio in condizioni di nutrienti elevati e S cresce in modo simile sia in condizioni di nutrienti elevati che di controllo.

Questi dati mostrano che le tre linee possono essere differenziate in base alla loro crescita nei tre ambienti. Mentre PL e L crescono meglio in ambienti specifici, S cresce più o meno allo stesso modo in tutte e tre le condizioni. S non è in grado di trarre vantaggio da condizioni di nutrienti migliorate, ma è in grado di crescere meglio in condizioni di nutrienti molto bassi.

Per l'estrazione del DNA aggiungere un tampone, AP uno dalla pianta Qiagen, DNEZ, kit di preparazione del DNA a sei foglie con sabbia sterile in un tubo per micro fuge, macinare il tessuto con un micro pestello fino a quando non sono visibili grumi. Continuare l'estrazione seguendo le istruzioni del kit come indicato per iniziare il trasferimento dell'estrazione dell'RNA, tre steli di maris più alcune foglie circostanti da una fiala criogenica di conservazione a un tubo per micro fuge. Aggiungere sabbia sterile al tubo e macinare il tessuto con un micro pestello fino a macinarlo finemente.

Agitare il campione per 15 secondi per facilitare la lisi, quindi centrifugare per un minuto a 13.000 giri/min per raccogliere sabbia ed eventuali detriti. Aggiungere lo SNAT alla colonna di centrifuga e continuare con la preparazione dell'RNA secondo le istruzioni del produttore. Una volta che l'RNA è stato estratto dal tessuto, trasferire 10 tamponi XDNA a un decimo del volume del campione di RNA alla reazione.

E a 30 unità di D Ns, incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti, seguita da 70 gradi Celsius per cinque minuti. Eseguire la trascrizione inversa utilizzando il kit RNA to CD NA dei biosistemi applicati. Secondo le istruzioni del produttore e di S, incubare la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora, quindi a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Infine, eseguire cinque microlitri di CDNA su un gel AROS all'1,5% per determinare la resa. Una volta che il CD NA di lino è stato preparato, viene utilizzato per il QPCR. Eseguire la QPCR utilizzando un sistema A BI Step one.

Eseguire tutti i saggi in triplice copia per ogni corsa e utilizzare il Gene Acton per le pulizie come controllo del numero di copie per preparare le reazioni per la QPCR. Aggiungere un microlitro dell'apposito paio di primer a ciascun tubo. Diluire il CD NA alla concentrazione appropriata e aggiungere nove microlitri a ciascuna provetta.

Infine, aggiungere 10 microlitri della miscela master PCR due x cyberg green in ciascuna provetta. Quindi, impostare il programma di amplificazione dopo l'amplificazione. Calcolare i livelli di espressione relativi dal numero di ciclo per la soglia, che è determinato dai parametri predefiniti nel software del primo passaggio e confermato dall'ispezione delle curve di amplificazione.

L'amplificazione PCR dal DNA, isolato da foglie in varie posizioni lungo lo stelo, dimostra l'aspetto di una singola copia di 5,7 kilobasi, frammento di DNA chiamato sequenza di inserzione della linea, o LIS, quando le piante vengono coltivate in condizioni di induzione. LIS 1 compare quando il PL viene coltivato in condizioni di bassa induzione di nutrienti e alla fine diventa omozigote. Qui. I campioni di foglie da uno a sei sono stati isolati a intervalli settimanali, con il campione uno che è stato il primo dopo che il DNA di cucitura è stato estratto dai campioni.

L'amplificazione PCR rivela la presenza di entrambi i terminali della LAS, uno in tutti i campioni tranne il primo. Ciò corrisponde alla scomparsa del sito inserito nell'unins e nessuna evidenza di ciò da parte della QPCR della quinta foglia. I risultati mostrano che la presenza di uno o altri cambiamenti genomici associati all'induzione influenza l'espressione di geni nelle immediate vicinanze di uno S.

I sei geni mostrati qui sono tutti espressi in modo differenziale in PL e S, quattro dei geni hanno un'espressione più elevata in pl, che non ha LIS, uno. Al contrario, due hanno un'espressione più alta in S, che ha LIS uno, ti abbiamo appena mostrato come coltivare linee di lino inducibili. Quindi il genoma cambia in risposta all'ambiente di crescita e alle caratteristiche di crescita delle generazioni successive.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le condizioni di crescita devono essere replicate per l'induzione riproducibile dei cambiamenti. Quindi questo è tutto. So che molti di voi sono scettici su questo fenomeno, ma ora potete riprodurre le osservazioni da soli.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.