Name: Indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella Lino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri come indurre variazioni genomiche ereditabili nel lino attraverso stress nutrizionale controllato. Questo metodo utilizza PCR e Q-R-T-P-C-R per analizzare cambiamenti genomici ed espressione genica, identificando l'elemento LIS one come fattore chiave nell'adattamento fenotipico.

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1. Crescita di lino in condizioni che inducono. <ol><li> 5 "vasi sono pieni di terreno e rassodata. </li><li> Tre semi per vaso sono piantati ¼ di pollice profondo e il terreno confermato sopra i semi. </li><li> I vasi vengono poi innaffiato con 100 ml di soluzioni appropriate nutrienti <ol><li> La mancata induzione di controllo (C) le condizioni di utilizzare una forza 1 / 10 di Miracle-Gro ogni settimana. La condizione di alta nutrienti (NPK trattamento) aveva Miracle Grow piena forza applicata settimanale. Povero di nutrienti - piante solo acqua del rubinetto fosse applicata in tutta la loro crescita. (Durrant 1971, Cullis 1980). </li></ol></li><li> Le piante sono coltivate in presenza di luce naturale durante l'estate. Durante l'inverno sono cresciuti sotto le luci di sodio con un 16 / 8 ore ciclo luce / buio. </li><li> Ad intervalli settimanali foglie e meristemi sono raccolti. </li><li> Il materiale vegetale è veloce congelati in azoto liquido. </li></ol> Risultati I tre genotipi crescere a tassi differenti rispetto a seconda delle condizioni (Figura 1). Pertanto in condizioni di controllare la linea Pl cresce meglio con L essendo più vigoroso di S (Figura 1a). Sotto nutrienti bassa (acqua), S cresce meglio L o Pl (Figura 1b). Sotto nutrienti alta (NPK) L cresce meglio di Pl che cresce solo di poco migliore di S (Figura 1c). Un confronto tra ciascuna delle linee cresciuti sotto i tre trattamenti diversi è illustrato nella figura 1 d - f. Pl cresce meglio in condizioni di controllo (Figura 1d), L migliori sotto nutrienti alta (figura 1e) e S in modo simile in entrambe le sostanze nutritive elevate e condizioni di controllo (Figura 1f). Questi dati dimostrano che le tre linee possono essere differenziate in base alla loro crescita sotto i tre ambienti. Di nota è che Pl cresce meglio nelle condizioni di controllo, mentre L cresce meglio nelle condizioni di NPK (alle quali è stata indotta). S cresce di circa lo stesso in tutte e tre le condizioni, cioè, non è in grado di approfittare delle migliori condizioni di nutrienti, ma è meglio in grado di crescere in condizioni di nutrienti molto bassi. I parametri di crescita che sono rilevanti per la differenziazione delle piante includono l'altezza della pianta (e associati a questo la lunghezza internodo, cioè la distanza tra ogni foglia), le dimensioni delle foglie e il grado di ramificazione. Per Pl in condizioni di controllare l'impianto è alto con rami e le foglie sono verdi grandi e scuri. Sotto nutrienti bassa l'impianto è molto breve, la distanza tra ogni foglia è anche molto breve e le foglie sono verdi piccoli e leggeri. Le foglie in punta sono più scuri di quelli verdi più in basso lo stelo. Sotto nutrienti alta la pianta sembra molto simile a quella in condizioni di controllo, tranne che sia il fusto principale e germogli laterali sono più corti negli impianti di controllo. Per la genotroph grandi le piante sembrano molto simili a quelle di Pl, tranne che la crescita più vigorosa in meno di sostanze nutritive elevate. Ancora una volta sotto i nutrienti a basso la pianta è molto breve e ha foglie verde chiaro. Il genotroph S cresce in modo simile in tutti e tre gli ambienti, anche se le foglie sono verde più chiaro sotto i nutrienti contenuti. Tuttavia, in condizioni di scarsa nutrienti la genotroph S è molto più vigorosa rispetto ad entrambi i Pl o linee L. 2. Estrazioni di RNA e DNA da meristemi di lino e le foglie sono fatte separatamente. La Roche RNA totale di preparazione kit è stato utilizzato per le estrazioni di RNA e DNA Qiagen DNeasy impianto di preparazione kit è stato utilizzato per l'estrazione del DNA. Estrazione di RNA <ol><li> 3 meristemi, più alcune foglie circostanti sono spostati da provetta Microbank ™ stoccaggio nel tubo eppendorf e messo in azoto liquido fino al momento di essere a terra. </li><li> Sabbia sterile viene aggiunto al tubo e il tessuto è a terra con una multa fino a micropestle. </li><li> 400 lisi ul / buffer vincolante da Roche RNA totale di preparazione kit è aggiunto e il tessuto è ulteriore terreno fino a quando non sono visibili grumi. </li><li> Campione è in agitazione per 15 secondi per aiutare lisi e poi filata per 1 minuto a 13.000 giri per raccogliere sabbia e detriti. </li><li> Surnatante si aggiunge a girare colonna e il resto della preparazione RNA istruzioni del kit sono seguite le istruzioni. </li></ol> DNAsi trattamento <ol><li> 1 / 10 del volume campione di RNA di 10X tampone DNAsi è aggiunto. </li><li> 30 unità di DNAsi si aggiunge e la reazione viene incubata a 37 ° C per 30 min e 70 ° C per 5 min. </li></ol> Trascrizione inversa <ol><li> Applied Biosystems RNA a cDNA kit è utilizzato secondo le istruzioni, la reazione di incubazione a 37 ° C per 1 ora e 95 ° C per 5 minuti. </li></ol> Il cDNA viene poi utilizzato in PCR o per qPCR qPCR qPCR è stata effettuata utilizzando un passaggio ABI Un unico sistema. Tutti i test sono stati eseguiti in triplicato a ogni esecuzione. Il gene actina è stata usata come controllo, come numero di copiela migliore gene housekeeping disponibili. <ol><li> La coppia di primer appropriato è stato aggiunto ad ogni provetta in 1ml. </li><li> Il cDNA è stato diluito alla concentrazione appropriata e 9μl aggiunto ad ogni provetta </li><li> 10μl del Potere 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) e 'stato aggiunto ad ogni provetta </li><li> Il programma di amplificazione programma è stato: <ul><li> 10 minuti a 95 ° C </li><li> 40 cicli di 15 sec a 95 ° C, 1 min a 60 ° C </li></ul> Denaturazione termica passo per verificare la specificità di amplificazione </li><li> I livelli di espressione relativi sono stati determinati dal valore di 2 (CTunknown - CTactin). </li></ol> Estrazione del DNA <ol><li> Buffer AP1 da impianto Qiagen DNeasy DNA preparazione kit è aggiunto 6 foglie con sabbia sterile in una provetta per microcentrifuga. Il tessuto è a terra con micropestle grumi fino a quando non sono visibili. </li><li> Le istruzioni del kit sono seguite le istruzioni. </li></ol> Risultati Amplificazione PCR dal DNA isolato dalle foglie in diverse posizioni lungo il fusto dimostra che la comparsa di LIS-1 si verifica durante le piante crescono in condizioni che inducono (4). I risultati qPCR mostrano che la presenza di LIS-1 (o altre variazioni genomiche associate alla induzione) influenza l'espressione dei geni nelle immediate vicinanze della LIS-1 (Figura 2). I sei geni mostrato nella Figura 2 sono differenzialmente espressi in Pl e S quattro di essi avevano l'espressione più alta in PL (senza LIS-1) e due che hanno maggiore espressione in S (che ha LIS-1). Pannello 1 e 2 sono i due geni più vicino al punto di inserimento di LIS-1. L'espressione di questi geni s in genotroph di grandi dimensioni (che ha avuto cambiamenti indotti, ma non ha LIS-1) e l'espressione in condizioni di crescita diversi saranno necessari per determinare una relazione causale tra LIS-1 e le variazioni di espressione. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Pl, L e S cresciuto sotto tre diversi regimi di nutrienti. Pannelli a - controllo, b - nutrienti bassa e c - NPK. d - Pl, e - S, f - L. Pannelli d - f da sinistra a destra: nutrienti basso, controllo e NPK. D - Pl, e - L, F - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="Figura 2 pollice" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2 pollice"> Figura 2. Espressione genica attorno al punto di inserimento di LIS-1. Gene 1 (inibitore di crescita) è immediatamente 5 'di LIS1 e il gene 2 (Kip legate ciclina-dipendente id inibitore della chinasi 3 "della LIS-1. I geni altre sono tutte lungo la stessa impalcatura (~ 500kb) costruito dal sequenza completa del genoma di lino. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">cliccare qui per vedere una figura più grande</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Amplificazioni PCR di DNA estratto dalle foglie di piante singole di Stormont Cirrus coltivate in condizioni di scarsa nutrienti. I prodotti di PCR sono stati separati su un 2% di agarosio TBE-gel. Il sito uninserted è mostrato in un pannello, le due estremità del sito inseriti sono mostrati in pannelli B e C. I campioni di foglie 1-6 sono stati isolati a intervalli settimanali con il campione 1 è il primo dopo la semina.

<ol><li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li>
<li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li>
<li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environmentally+induced+adaptive+%28%3F%29+insertion+event+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Genet.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Lino sembra avere un genoma intrinsecamente instabile. Un certo numero di varietà commerciali lino tessile rapidamente diventato non uniforme quando destinata alla produzione di poche generazioni. Le stesse osservazioni non sembrano valere per varietà di lino l&#39;olio. Quindi sembra esserci un&#39;associazione tra la selezione per la qualità delle fibre e l&#39;instabilità del genoma. Il indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella lino sono stati inizialmente identificati attraverso l&#39;indagine delle osservazioni agronomiche della crescita del raccolto fibra. Queste osservazioni ripetibili di specifiche varianti fenotipiche e genomica solleva la questione di come lo stress ambientale può influenzare la suite di riarrangiamenti genomici che possono verificarsi. La comparsa ripetuta di LIS-1 in risposta a particolari ambienti è coerente con questa mutazione sia direttamente o indirettamente selezionato. La crescita delle linee indotta da trattamenti vari indica anche un miglioramento delle prestazioni in condizioni che inducono rilevanti. Le variazioni di espressione anche associata con la presenza di LIS-1 indica ancora una volta che questo inserimento influire sulle prestazioni degli impianti. Il video di presentazione fornisce un forum per osservare i cambiamenti fenotipici impianto in maniera impossibile da trasmettere attraverso i tradizionali materiale stampato.

<ul><li> Semi di lino dell&#39;originale varietà Stormont Cirrus denotato Pl e la genotrophs L e S. </li><li> 5 &quot;pentole </li><li> terriccio </li><li> Miracle-Gro </li><li> serra </li><li> Sodio ad alta pressione luci </li><li> Azoto liquido </li><li> Mortaio e pestelli </li><li> Micropestles e tubi microcentrifuga </li><li> Termociclatore </li><li> Gel elettroforesi attrezzature </li><li> Imaging digitale di setup </li><li> StepOne qPCR modulo </li><li> Qiagen DNeasy impianto di preparazione del DNA kit </li><li> Applied Biosystems RNA a cDNA kit </li><li> Roche RNA totale di preparazione kit </li></ul>

indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella lino

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Alcune varietà di lino rispondere alle sollecitazioni dei nutrienti, modificando il loro genoma e queste modifiche possono essere ereditate attraverso molte generazioni. Anche associata a questi cambiamenti genomici sono ereditarie fenotipica 1,2 variazioni. La varietà di lino Stormont Cirrus (Pl), se coltivate in tre diverse condizioni di nutrienti possono restare inducibile (nelle condizioni di controllo), o diventare stabilmente modificate sia al genotroph grande o piccolo da una crescita in condizioni di nutrienti alto o basso, rispettivamente. Le linee derivanti dalla crescita iniziale in ciascuno di tali condizioni sembrano crescere meglio se coltivate nelle stesse condizioni nelle generazioni successive, in particolare la linea Pl cresce meglio sotto il trattamento di controllo che indica che le piante che crescono in entrambi i nutrienti di alta e bassa sono in fase di stress. Uno dei cambiamenti genomiche che sono associati con l&#39;induzione di cambiamenti ereditabili è la comparsa di un elemento di inserimento (LIS-1) 3, 4, mentre le piante crescono sotto lo stress dei nutrienti. In relazione a questo evento di inserimento, la varietà di lino Stormont Cirrus (Pl), se coltivate in tre diverse condizioni di nutrienti possono restare invariati (alle condizioni di controllo), hanno l&#39;inserimento appare in tutte le piante (sotto nutrienti basso) e hanno trasmesso questo alla prossima generazione, o hanno l&#39;inserimento (o parti di essa), ma non sembrano essere trasmessi attraverso le generazioni (sotto i nutrienti alto) 4. La frequenza della comparsa di questa inserzione indica che è in fase di selezione positiva, che è anche coerente con la risposta di crescita nelle generazioni successive. Foglie o meristemi raccolte nelle varie fasi di crescita sono utilizzate per l&#39;isolamento del DNA e RNA. L&#39;RNA viene utilizzato per identificare variazioni nell&#39;espressione associate con gli ambienti di crescita diversi e / o t ha presenza / assenza di LIS-1. Il DNA isolato viene utilizzato per identificare quelle piante in cui l&#39;inserimento è avvenuto.

Crescente alcune varietà di lino sotto i risultati dello stress nutrienti in variazione genomica all&#39;interno di un sottoinsieme del genoma e della variazione fenotipica. Un complesso di inserimento in un sito specifico viene associata a una crescita sotto vari regimi di nutrienti e con i cambiamenti nell&#39;espressione genica intorno a questo sito.

Indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella Lino

Alcune varietà di lino rispondono allo stress nutrizionale modificando il proprio genoma e tali modificazioni possono essere ereditate per molte generazioni. Inoltre...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo per coltivare una varietà di lino inducibile in condizioni che determinano una variazione genomica ereditabile. Inoltre, vengono monitorati i cambiamenti genomici e viene osservata la crescita delle piante indotte nelle generazioni successive in diversi ambienti. Per raggiungere questo scopo, il lino viene coltivato in una serie di condizioni induttive.Il tessuto fogliare e del fusto di Maris viene quindi raccolto in diversi momenti durante la crescita delle piante in vari ambienti. Successivamente, il DNA e l'RNA vengono isolati dai campioni di tessuto. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'eseguire la PCR utilizzando i campioni di DNA e la Q-R-T-P-C-R utilizzando l'RNA isolato, al fine di identificare le variazioni genomiche e le alterazioni nell'espressione genica risultanti dalla crescita in diverse condizioni ambientali.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la risposta genomica alle condizioni di crescita con la comparsa dell'elemento di inserzione LIS-1 in un punto specifico del genoma e le differenze di espressione associate alla presenza di tale elemento, come visualizzato mediante PCR e RT-PCR eseguite con acidi nucleici isolati dai tessuti delle piante trattate. Ciao, sono Chris Cull del Dipartimento di Biologia della Case Western Reserve University. Sono Cory Johnson del Cull Lab.E io sono Tiffany Moss, anch'io del laboratorio Cull. E io sono Marshall Lucas, uno studente universitario nel programma estivo di ricerca per studenti universitari presso il laboratorio Cull.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le modifiche nel genoma e nell'espressione genica risultanti da variazioni nell'ambiente di crescita. Cominciamo dunque. Per coltivare la lino in condizioni induttive, iniziare riempiendo vasi da cinque pollici con terriccio e compattandolo.Piantare successivamente tre semi di lino per vaso, ad una profondità di un quarto di pollice. Coprire quindi i semi con terriccio per le condizioni di controllo non induttive. Innaffiare le piante con 100 millilitri di soluzione di Miracle Grow diluita a un decimo della concentrazione.Trattare le piante in condizioni di alta disponibilità di nutrienti con 100 millilitri di soluzione nutritiva completa. Miracle grow. Applicare infine.Utilizzare solo acqua del rubinetto per le piante a basso contenuto nutritivo. Coltivare le piante alla luce naturale durante l'estate, mentre crescono. Irrigare tutte le piante mediante un sistema di nebulizzazione automatico due volte al giorno per cinque minuti.Applicare le condizioni di crescita alle piante una volta alla settimana. Raccogliere le foglie insieme ai fusticini a intervalli settimanali. Per l'estrazione del DNA vengono raccolte sei foglie, mentre per l'estrazione dell'RNA sono necessari tre fusticini; dopo il campionamento, collocare il materiale vegetale in una provetta criogenica, congelarlo rapidamente in azoto liquido e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione.I tre genotipi crescono a velocità relative diverse a seconda delle condizioni. In condizioni di controllo, la varietà di lino inbred storm oppure la linea PL cresce meglio. Diversi ceppi sono stati ottenuti da questo genitore, con una varietà grande o L più vigorosa rispetto alla varietà piccola o S.Tuttavia, in condizioni di bassi nutrienti, S cresce meglio di L o di pl. In condizioni di alti nutrienti, L cresce meglio di pl, che a sua volta cresce solo leggermente meglio di S. Un confronto tra ciascuna delle linee coltivate in tre condizioni diverse rivela che PL cresce meglio nelle condizioni di controllo. L cresce meglio in condizioni di alti nutrienti, mentre S cresce in modo simile sia in condizioni di alti nutrienti che in condizioni di controllo.Questi dati mostrano che le tre linee possono essere differenziate in base alla loro crescita nei tre ambienti. Mentre PL e L crescono meglio in ambienti specifici, S cresce in modo simile in tutte e tre le condizioni. S non è in grado di sfruttare condizioni nutrizionali migliorate, ma è più efficiente nella crescita in condizioni di nutrienti molto basse.Per l'estrazione del DNA, aggiungere il buffer AP del kit Qiagen DNEZ Plant DNA Prep a sei foglie con sabbia sterile in un tubo microcentrifuga e macinare il tessuto con una pestella micropestle fino a quando non sono visibili grumi. Continuare l'estrazione seguendo le istruzioni del kit. Per iniziare l'estrazione dell'RNA, trasferire tre fusti di maris e alcune foglie circostanti da una provetta criogenica a un tubo microcentrifuga. Aggiungere sabbia sterile al tubo e macinare il tessuto usando una micropestle fino a ottenere una polvere fine.Vortexare il campione per 15 secondi per favorire la lisi, quindi centrifugare per un minuto a 13.000 giri/min per raccogliere la sabbia e eventuali detriti. Aggiungere il SNAT alla colonna di centrifugazione e proseguire con la preparazione dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore. Una volta estratto l'RNA dal tessuto, trasferire 10 XDNA buffer in un volume pari a un decimo del volume del campione di RNA nella reazione.E a 30 unità di D Ns, incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti, seguiti da 70 gradi Celsius per cinque minuti. Eseguire la trascrizione inversa utilizzando il kit Applied Biosystems da RNA a CD NA. Secondo le istruzioni del produttore e di S, incubare la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora, quindi a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Infine, eseguire cinque microlitri del cDNA su un gel AROS al 1,5% per determinare il rendimento. Una volta che il cDNA di lino è stato preparato, viene utilizzato per la QPCR. Eseguire la QPCR utilizzando un sistema A BI Step one.Eseguire tutti i saggi in triplice replicato per ogni run e utilizzare il gene di controllo Actin come controllo del numero di copie per preparare le reazioni per la QPCR. Aggiungere un microlitro della coppia di primer appropriata a ogni tubo. Diluire il DNA alla concentrazione appropriata e aggiungere nove microlitri a ogni tubo.Infine, aggiungere 10 microlitri del master mix PCR con cybergreen 2x in ogni provetta. Successivamente, impostare il programma di amplificazione seguendo l'amplificazione. Calcolare i livelli di espressione relativi in base al numero di cicli per il valore soglia, determinato dai parametri predefiniti nel software StepOne e confermato mediante l'analisi delle curve di amplificazione.L'amplificazione mediante PCR del DNA, isolato da foglie in posizioni diverse lungo il fusto, dimostra la comparsa di un frammento di DNA di 5,7 chilobasi in singola copia, denominato sequenza di inserzione della linea, o LIS uno, quando le piante vengono coltivate in condizioni induttive. LIS uno compare quando la PL è coltivata in condizioni induttive di basso contenuto nutritivo e alla fine diventa omozigote. Qui, campioni fogliari da uno a sei sono stati isolati a intervalli settimanali, con il campione uno prelevato in epoca più precoce dopo la semina; successivamente il DNA è stato estratto dai campioni.L'amplificazione mediante PCR rivela la presenza di entrambi i capi di LAS uno in tutti i campioni tranne il primo. Questo corrisponde alla scomparsa del sito inserito non integrato e alla mancanza di evidenza dello stesso alla QPCR della quinta foglia. I risultati mostrano che la presenza di LAS uno o di altre modifiche genomiche associate all'induzione influisce sull'espressione dei geni nelle immediate vicinanze di un S uno.I sei geni mostrati qui sono tutti espressi in modo differenziale nel PL e nell'S; quattro dei geni presentano un'espressione maggiore nel pl, che non possiede LIS uno. Al contrario, due geni mostrano un'espressione maggiore nell'S, che possiede LIS uno. Vi abbiamo appena mostrato come coltivare linee di lino inducibili. Pertanto, il genoma cambia in risposta all'ambiente di crescita e alle caratteristiche di crescita delle generazioni successive.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le condizioni di crescita devono essere replicate per ottenere un'induzione riproducibile dei cambiamenti. Questo è tutto. So che molti di voi sono scettici riguardo a questo fenomeno, ma ora potete riprodurre le osservazioni autonomamente.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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