Una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule Micropatterned

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di mostrare come la normalizzazione dell'architettura e della posizione cellulare ottenuta su specifici micro pattern adesivi consenta una facile automazione dell'acquisizione delle immagini e un'elaborazione diretta delle immagini con una quantificazione sensibile e robusta degli effetti dei farmaci, che è irraggiungibile sui supporti convenzionali in vetro. Ciò si ottiene seminando celle eliche su due chip SI che recano tre micro pattern marcati a forma di L. Le cellule adottano la forma triangolare costruendo una fibra di stress importante che attraversa le due estremità della L. Le cellule del modello vengono successivamente incubate con statina lebos o lasciate non trattate, quindi fissate e colorate per visualizzare il citoscheletro e i nuclei dell'attone.

Le immagini delle cellule del micropattern vengono quindi acquisite ed elaborate utilizzando la macro di riferimento cellulare per generare una pila di immagini per l'analisi e la macro dell'ipotenusa per quantificare i fenotipi. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano un effetto significativo di basse dosi di statine BLE sulle cellule HELOC a micropattern, che non è rilevabile in condizioni standard di coltura cellulare. Ciao, benvenuto.

Oggi siamo qui per illustrarvi il nostro protocollo sperimentale che spiega come utilizzare i micro pattern adesivi per l'analisi cellulare e per mostrarvi i dati sperimentali che illustrano la facile quantificazione di dosi molto basse di farmaci su questi micro pattern adesivi. Quindi, quando si vedono per la prima volta questi micro pattern, si capisce immediatamente come si possono risolvere i problemi di variabilità nell'acquisizione delle immagini durante l'analisi delle cellule. Perché avendo una vera e propria matrice di cellule, proprio come una micro matrice, è possibile spostare facilmente il tavolino del microscopio da una cella all'altra per essere in grado di catturare le immagini in modo graduale.

Ma questo, ovviamente, non è l'unico vantaggio dei micro modelli che offre. Offre molti più miglioramenti perché infatti, su alcuni micro pattern tipici come il crossbo o l'Y, stiamo di fatto normalizzando l'architettura cellulare interna, il che significa che gli organelli, il fuso mitotico, il citoscheletro e le diverse reti proteiche sono tutti nelle stesse posizioni da cellula a cellula o nello stesso orientamento da cellula a cellula, il che rende molto più facile prevedere e quantificare gli effetti dei farmaci su questi particolari modelli. Ora, questo può sembrare abbastanza controintuitivo rispetto a ciò che viene normalmente fatto nella classica capsula di Petri o micropiastra.

Beh, perché si vedono spesso, ovviamente, cellule che si muovono e adottano morfologie diverse. Mentre sui micro pattern adesivi, tutte le cellule inizieranno ad assomigliarsi perché rispondono a questo micro pattern adesivo e organizzano la loro architettura allo stesso modo. Questo può sembrare in effetti un po' artificiale, ma quando si arriva a guardarlo da vicino, la capsula di Petri non è ancora più artificiale?

Perché nei tessuti, le cellule sono vincolate dalle cellule vicine e dalla matrice extracellulare. Stanno ricevendo molte informazioni spaziali, che orientano l'architettura delle celle. E questo in loco per l'annuncio di micro modelli è ciò che stiamo facendo.

Stiamo ripristinando queste informazioni spaziali nelle cellule e tutte le cellule rispondono a questo e si organizzano allo stesso modo. E ora, poiché le celle si assomigliano tutte, possiamo introdurre il concetto di cella di riferimento, il che significa che possiamo fare la media di tutte le immagini e ottenere una singola immagine, che è davvero rappresentativa di come appare la cella in una data condizione. Quindi puoi aggiungere un farmaco e guardare di nuovo quella cellula di riferimento e vedere come ha modificato la morfologia o l'organizzazione della cellula in risposta a quel farmaco.

Posizionare due chip singolarmente in due pozzetti indipendenti di una piastra a sei pozzetti, assicurandosi che il logo del sito due sia leggibile. I due chip utilizzati per questo esperimento hanno micro pattern colorati con FibroGen SI three e devono essere tenuti al buio prima dell'uso. Raccogliere le cellule hela che sono circa l'80% confluenti dalla tripsina e verificare che siano adeguatamente individualizzate al microscopio, centrifugare a 300 G per quattro minuti e riprendere, sospendere delicatamente le cellule, contare e diluire le cellule a una concentrazione di 15.000 cellule per millilitro.

In terreni di coltura D-M-E-M-F 12 incompleti erogano 60.000 cellule per pozzetto. La piastra va spostata il meno possibile per evitare di introdurre movimenti rotatori nel mezzo, che tenderanno a concentrare le celle al centro. Lasciare sedimentare le cellule per 10 minuti sotto il cofano, quindi spostarle nell'incubatore cellulare.

Entro 10-20 minuti nell'incubatore cellulare, le cellule inizieranno ad aderire dopo 10 minuti, controllare regolarmente al microscopio quando le cellule si sono attaccate. Cambiare il mezzo cellulare e rimuovere l'eccesso cellulare ripetendo la seguente procedura quattro volte. Mantenendo la piastra piatta, aspirare delicatamente il fluido dal lato del pozzetto.

Fare attenzione a conservare una quantità sufficiente di materiale per evitare che il truciolo si secchi. Aggiungere quattro millilitri di PBS e aspirare partendo dal centro del chip. Quindi, spostandosi sul lato del pozzetto per aspirare la maggior parte del PBS come prima, controllare al microscopio la presenza di cellule galleggianti.

Se rimane una grande quantità di celle galleggianti, ripetere la procedura di lavaggio. Se sono presenti pochissime cellule, aspirare parte del PBS e sostituirlo con due millilitri di terreno fresco aspirato e aggiungere quattro millilitri di terreno fresco due volte. Incubare le cellule per tre ore in un incubatore cellulare per consentire alle cellule di diffondersi completamente.

Utilizzando questo metodo, tra il 10 e il 30% dei micro pattern sarà occupato da una singola cella, mentre gli altri pattern saranno vuoti o occupati da più celle. Per trattare le cellule con statine BLEs, diluire la soluzione madre del farmaco da 17 millimolari a una concentrazione finale di cinque micromolari con 0,1% di DMSO in quattro millilitri di terreno. Per il mezzo di controllo preparare solo con DMSO 0,1% aspirare il terreno cellulare e sostituirlo rapidamente con la statina BLE o le soluzioni di controllo per evitare che il truciolo si secchi.

Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius. Durante questa incubazione, preparare il tampone del citoscheletro. Aggiungi un grammo di saccarosio a due millilitri di cb.

Questo aiuta a preservare le strutture cellulari interne. Mescolare un millilitro di saccarosio CB con quattro millilitri di PFA al 5%. Aggiungere due millilitri di PFA in soluzione di saccarosio CB.

In due pozzetti di una piastra fresca a sei pozzetti. Per fissare le cellule, utilizzare una pinza per raccogliere il chip CY two e posizionarlo nella piastra a sei pozzetti contenente due millilitri di PFA in soluzione di saccarosio CB. Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente, rimuovere il PFA e lavare le cellule una volta con PBS, quindi lavare le cellule con due millilitri di cloruro di ammonio 100 millimolare per 10 minuti.

Per spegnere l'attività di reticolazione residua del PFA, permeare le cellule aggiungendo due millilitri di PBS contenente lo 0,1% di tritton X 100 per tre minuti, lavato due volte con filamenti di actina colorante PBS con due millilitri di ZI coniugato fain a uno a 2000 in PBS con 1,5% BSA incubare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi lavare le cellule una volta con due millilitri di PBS. Quindi, sostieni i nuclei.

Aggiungere due millilitri di milligrammo per millilitro venduti in PBS e incubare per tre minuti a temperatura ambiente. Lavare due volte con due millilitri di PBS. Monta i due chip laterali su una slitta standard utilizzando da 25 a 30 microlitri di soluzioni di montaggio come al.

Per acquisire immagini in tre lunghezze d'onda, utilizziamo il software di imaging Metamorph e un microscopio a T per eclissi a icona NIK. Dotato della telecamera CCD Hema Matsu e di un illuminatore in fibra di mercurio intens lite. Per prima cosa selezionare l'ingrandimento 20x.

Successivamente, nella barra dei menu, apri l'acquisizione multidimensionale. Per impostare i diversi parametri dell'esperimento. Per prima cosa indica dove salvare i tuoi dati.

Impostare il numero di lunghezze d'onda su tre, selezionare la lunghezza d'onda SI tre e posizionare il vetrino coprioggetto in modo che 12 micro modelli siano centrati nel campo della telecamera. Il numero di micro pattern visualizzati per campo varia a seconda della fotocamera e delle impostazioni dell'obiettivo. Impostare il tempo di esposizione per ciascuna lunghezza d'onda e la messa a fuoco automatica.

Per PS tre, creare un journal che esegue l'acquisizione multidimensionale e salvarlo come MDA jnl. Aprire la funzione di scansione per acquisire 24 immagini, ciascuna contenente 12 micro pattern. Inserisci sei colonne e quattro righe con meno 400 micron x dimensione del passo e 300 micron y dimensione del passo nel diario impostato per eseguire, carica il giornale MDA jnl press scan per avviare l'acquisizione automatica delle 24 immagini nelle tre lunghezze d'onda.

In questo video, i micro pattern L vengono utilizzati per innescare la formazione di una singola fibra di stress di actina principale che sostiene la parte non attaccata della cellula e semplifica la visualizzazione e la misurazione dell'impatto della statina di BLE sulle cellule rispetto alle cellule posizionate sulla fibronectina semplice. Per l'elaborazione e l'analisi automatizzata delle immagini, delineiamo due macro personalizzate scritte per il programma open source image J da una pila di immagini grezze, la prima macro estrae singole celle e crea una cella di riferimento. La seconda macro misura il collasso della membrana cellulare.

Il primo passo è la segmentazione delle singole cellule da immagini grezze. Le immagini di micro pattern etichettate in fluorescenza vengono utilizzate per delimitare le regioni centrate sui micro pattern che vengono ritagliate sulle immagini per ogni lunghezza d'onda e riassemblate in pile per ogni lunghezza d'onda. Per selezionare micro pattern con singole cellule, la macro rileva il numero di nuclei per immagine ed elimina in tutte le pile quelli che contengono più di un nucleo o nessun nucleo.

Infine, l'immagine J plugin multi-stack reg viene utilizzato per riallineare tutte le immagini raccolte e tutti i canali in base alla posizione del micropattern. Questo passaggio genera una pila di singole immagini che possono ora essere utilizzate per l'analisi di singole celle o per creare una cella di riferimento. Nell'immagine J, la cella di riferimento è costruita effettuando una proiezione delle immagini filtrate e allineate da una pila.

È possibile applicare diversi metodi di proiezione, ma di solito viene scelta una proiezione mediana per eliminare i valori anomali della pila di immagini. La cella di riferimento è uno strumento unico e utile per la rappresentazione e l'analisi delle immagini ottenute solo con celle di micropattern. Per facilitarne l'esame, viene applicata una tabella di ricerca o LUT per convertire l'immagine monocromatica in una mappa di frequenza codificata.

Per caratterizzare l'effetto delle statine delle BLE, la rigidità e il collasso della cellula sono stati analizzati utilizzando una seconda macro di immagine J. In breve, le immagini di soglia del micro pattern L vengono utilizzate per definire un'ipotenusa teorica della forma del triangolo cellulare. Successivamente, viene eseguita la soglia delle immagini della colorazione dell'acton per definire la forma della cellula.

Viene quindi misurata la differenza di area tra l'ipotenusa teorica e la membrana cellulare concava effettiva: le cellule che presentano un'area sotto l'ipotenusa teorica sono considerate collassate. L'impatto di cinque statine micromolari di BLE è stato caratterizzato confrontando il numero di cellule collassate in condizioni trattate e di controllo. Immagini tipiche di cellule con micropattern L trattate con statine BLE o non trattate mostrano che le cellule sono state fissate e i micro pattern colorati.

L'actina e i nuclei sono mostrati rispettivamente in rosso, verde e blu. Si noti l'impatto delle statine BLE sulla forma delle cellule rispetto alle condizioni di controllo. Qui sono mostrate le cellule rappresentative dopo l'incubazione con statine BLE o i controlli su fibronectina semplice.

Le cellule sono state fissate e colorate con actina e nuclei rispettivamente in verde e blu. Si noti la somiglianza tra le condizioni trattate e quelle controllate. Vengono mostrate immagini tipiche di cellule di riferimento ottenute da cellule trattate con statine BLEs o non trattate.

Si noti il potenziale di questo approccio per una facile osservazione del fenotipo in studio. Ecco un esempio di analisi degli effetti delle statine BLE sulle cellule utilizzando la macro ipotenusa. Mentre il 25% delle cellule di controllo era collassato, questo è aumentato di tre volte del 75% nelle cinque cellule micromolari BLE trattate con statine, riflettendo la rete contrattile di acchinina indebolita.

Dopo aver visto questo, ora dovresti avere una buona comprensione di come i micro pattern adesivi risolvono diversi colli di bottiglia nell'analisi ad alto contenuto. In primo luogo, l'uso di micro pattern adesivi ha reso l'analisi dell'elaborazione dell'acquisizione delle immagini molto più semplice. In secondo luogo, i micro pattern consentono di rilevare effetti molto sottili dei farmaci a dosi molto basse perché si riduce la variabilità da cellula a cellula normalizzando la loro morfologia e il loro comportamento.

E infine, rispetto alle migliaia di cellule che di solito sono necessarie per ottenere un buon risultato nell'analisi cellulare, sono necessarie solo poche decine di cellule per ottenere un risultato robusto e significativo utilizzando la nostra cella di riferimento.