Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di espandere rapidamente un gran numero di cellule NK umane. Ex vivo inizia isolando p BMC o cellule NK da buffy coat o campione di sangue intero. Quindi co-coltura di pbmc con cellule presentanti antigene artificiali in espansione cellulare NK.

I terreni integrati con IL 2 mantengono la coltura di cellule NK per tre settimane con stimolazioni settimanali con un PC avendo cura di mantenere il numero di cellule NK al di sotto di una volta per 10 al sesto per millilitro di coltura. I terreni infine convalidano l'efficacia funzionale delle cellule NK espanse utilizzando un saggio di citotossicità non radioattiva. Una tipica resa di cellule NK con questo schema di espansione si traduce in un'espansione mediana di 21.000 volte delle cellule NK alla fine di 21 giorni che hanno un'elevata citotossicità contro vari tumori, come determinato attraverso un saggio di rilascio di calcio.

Questo medico può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo della biologia delle cellule NK perché un gran numero di cellule NK è stato storicamente molto difficile da ottenere. Questa tecnica ha implicazioni per l'immunoterapia del cancro umano perché generare abbastanza cellule NK per tale terapia è stato storicamente molto difficile. A dimostrare questa tecnica sarà Cecily, l'assistente di ricerca senior per il mio laboratorio per ottenere sangue P BMC da donatori sani.

Tipicamente come banca del sangue, il Buffy coat viene utilizzato come fonte. Per prima cosa, aggiungi PBS per regolare il volume del cappotto di Buffy a 140 millilitri. Quindi stendere 35 millilitri di campione su 15 millilitri di fial PA per la centrifuga di separazione in gradiente a 400 G per 20 minuti.

Senza interruzioni. Recuperare con attenzione i P BMC dall'interfaccia del plasma Fial PA e mettere da parte il tubo di globuli rossi per utilizzarlo in seguito. Lavare i P BMC tre volte con centrifugazione PBS ogni volta a 400 G per 10 minuti.

Utilizzare questa frazione di BMC P per l'espansione delle cellule NK. Ora tornate al tubo del gradiente. Aspirare il fi.

Chiamare e trasferire i globuli rossi in due provette da centrifuga da 50 millilitri lavate con PBS aggiunto al segno di 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante schiumando la parte superiore dello strato di globuli rossi. Per rimuovere i granulociti.

Eseguire tre lavaggi, quindi risospendere i globuli rossi in un volume uguale di soluzione di else e conservarli a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. Questa frazione di globuli rossi può essere utilizzata per la purificazione roset SEP delle cellule NK al termine di due settimane di espansione. Per espandere in modo efficiente le cellule NK funzionali ex vivo, K 5 62, clonare nove cellule con IL 21 legato alla membrana, di seguito denominato K 5 62.

Il clone nove IL 21 viene utilizzato come antigene artificiale presentando il primo conteggio delle cellule pbmc e calcola il volume per cinque volte 10 alle sei cellule da posizionare per l'espansione delle cellule NK per ogni cinque volte 10 al sesto conteggio pbmc e irradia 10 volte 10 al sesto clone K 5 62 nove cellule IL 21. Utilizzando un irradiatore gamma a 100 gras, le celle irradiate possono anche essere congelate per un uso futuro. Lavare ora le cellule pre-irradiate con PBS e RESUSPEND in terreno di espansione cellulare NK.

Ora osservate un rapporto di due a uno di cellule irradiate con pbmc in 40 millilitri di terreno di espansione cellulare NK e posizionate il pallone T 75 in posizione verticale in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica il terzo giorno. Recuperare le cellule stimolate mediante centrifugazione a 400 G per cinque minuti e sostituire metà del terreno con NKEM fresco e continuare la coltura. Ripetere un cambio di terreno il quinto giorno Alla fine di una settimana, contare il numero di cellule messe da parte cinque volte 10 per la fenotipizzazione mediante citometria a flusso per il conteggio della seconda stimolazione e irradiare un rapporto uno a uno di K 5 62.

Clonare nove cellule IL 21 per espandere le sue cellule e quindi combinare le cellule nel terreno di espansione cellulare NK a 2,5 volte 10 per il quinto totale di cellule per millilitro. Ora vedere le cellule nei flaconi T 75 e continuare a coltivare le cellule nei giorni 10 e 12 di passaggio nelle cellule NK a 2,5 volte 10 fino alla quinta cellula per millilitro al giorno 14 di espansione. Ancora una volta, enumerare le cellule e fenotipizzare un campione mediante citometria a flusso.

Purificare questa espansione cellulare derivata da PBMC utilizzando il protocollo di purificazione SEP a rosetta e verificare la purezza delle cellule NK mediante fenotipizzazione con citometria a flusso. Eseguire una terza stimolazione sulle cellule NK purificate utilizzando un rapporto uno a uno di K 5 62 clone irradiate nove cellule IL 21. Infine, al giorno 21, analizzare le cellule NK amplificate mediante citometria a flusso utilizzando un pannello di anticorpi a fenotipizzazione completa.

Congelare le scorte di cellule in FBS contenenti il 10% di DMSO a una densità massima di cinque volte 10 per settima cella per fiala. Utilizzare cellule NK fresche o congelate per il test di citotossicità. Se si utilizzano cellule NK congelate, scongelare prima la fiala di cellule NK e seminare in NKEM per 24 ore per consentire il recupero cellulare il giorno del saggio, sospendere 10 cellule bersaglio in un millilitro di NKEM contenente calcium am e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius agitando occasionalmente in una piastra UBO a 96 pozzetti, aggiungere in triplicato 200 microlitri di cellule NK sospese una volta per 10 alle sei celle per millilitro ed eseguire la diluizione seriale delle celle come indicato.

Dopo un'ora di carico di calcio. Lavare le cellule bersaglio nel mezzo di espansione delle cellule NK due volte centrifusion per cinque minuti a 400 G. Ora contare le cellule bersaglio e risospendere una volta per 10 fino alla quinta cellula per millilitro. Aggiungere 100 microlitri di cellule bersaglio a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e centrifugare per un minuto a 100 G per avviare il contatto cellulare, incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro ore.

Per sospendere uniformemente il calcio rilasciato, mescolare delicatamente la coltura pipettando le cellule in pellet a 100 G per cinque minuti e trasferire 100 microlitri di surnatante in un nuovo piano. Piastra inferiore a 96 pozzetti, facendo attenzione a evitare bolle se necessario, far scoppiare le bolle che potrebbero formarsi utilizzando un ago sottile. Leggere la piastra utilizzando un lettore di piastre fluorescente impostato su filtro di eccitazione a 485 nanometri e filtro di emissione a 530 nanometri.

Calcola la percentuale di lisi specifica. Tipicamente l'espansione di cinque volte 10 al sesto pbmc isolato dal buffy coat produce tra una volta 10 al nono e 10 al 10°. Cellule NK, le cellule NK espanse esprimono vari recettori delle cellule NK che sono paragonabili alle cellule NK primarie non espanse nel buffy coat.

Le cellule NK possono costituire dal 2 al 18% del pbmc al giorno 14. La purificazione SEP a rosetta delle cellule espanse può recuperare dal 40 al 70% delle cellule NK presenti nella coltura a una purezza delle cellule NK del 99% indicata da CD tre. Le cellule NK espanse CD 56 negative hanno dimostrato citotossicità contro una serie di linee cellulari tumorali, tra cui neuroblastoma, osteosarcoma A ML e melanoma.

Qui l'uccisione ML rappresentativa A è mostrata come lisi specifica percentuale. Il video BIOT in diretta mostra l'uccisione delle cellule NK della linea cellulare di neuroblastoma CHP 1 34 caricata con calcio am Dopo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi della produzione di citochine da parte delle cellule NK e il trasferimento adattivo in modelli tumorali animali, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti le funzioni delle cellule NK.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come espandere e purificare un gran numero di cellule NK. Questo può essere ottenuto direttamente dalle cellule mononucleate del sangue periferico e quindi le cellule NK purificate o l'espansione può essere avviata utilizzando cellule NK purificate con il metodo della rosetta. All'inizio, un tipico buffy coat produrrà da 15 a 40 milioni di cellule NK, che possono essere utilizzate per espandere un numero molto elevato di cellule NK utilizzando lo schema descritto in questo metodo.