Name: Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Scopri come espandere e purificare cellule NK umane periferiche con un metodo che raggiunge una espansione mediana di 21.000 volte in 21 giorni. Questa tecnica consente di ottenere grandi quantità di cellule NK funzionali per applicazioni terapeutiche in immunoterapia oncologica.

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Gli autori desiderano ringraziare Laurence Cooper, Harjeet Singh, e Lenka Hurton per il loro lavoro nella creazione del primo K562 aAPC e mIL21 vettori di fusione. Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal Programma UT Scientist medico MD Anderson, la Fondazione San Baldrick, e le leggende di Friendswood.

1. Isolamento di PBMC da Buffy Coat Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ottenuti per centrifugazione densità di galleggiamento su Ficoll-Paque da donatore sano campioni di buffy coat derivato da leucaferesi. <ol><li> Il Ficoll-Paque centrifugazione è fatto come protocollo per fabbricante, con piccole modifiche. </li><li> Aggiungi PBS a un normale-donatore di sangue-banca buffy coat ad un volume finale di 140 mL (tipico il volume buffy coat è 40-70 ml). </li><li> Strato di 35 ml di campione buffy coat su 15 ml di Ficoll-Paque (4 tubi). </li><li> Centrifugare a 400g per 20 minuti senza freno. </li><li> Recuperare il PBMC dal Ficoll-Paque: interfaccia plasma, non gettare i globuli rossi alla fine del Ficoll-Paque. </li><li> Lavare PBMC tre volte con PBS, centrifugazione di volta in volta a 400g per 10 minuti. </li><li> PBMC può essere utilizzato direttamente per l'espansione delle cellule NK in questa fase o cellule NK può essere isolato da RosetteSep (sezione 4) </li><li> PBMC restanti possono essere congelati in FBS contenente il 10% di DMSO in azoto liquido. </li><li> Aspirare il Ficoll e raccogliere i globuli rossi dal punto 5 a due tubo da 50 ml per centrifuga, lavare tre volte con PBS (aggiunti a 50 ml mark), ogni volta che aspirare la scrematura surnatante la parte superiore dello strato di RBC per rimuovere granulociti. </li><li> I globuli rossi possono essere utilizzati immediatamente per la depurazione RosetteSep  delle cellule NK (vedi capitolo 4) o conservati in uguale volume di soluzione Alsever è a 4 ° C per un uso successivo (I globuli rossi si possono conservare per un massimo di 4 settimane). </li></ol> 2. Espansione delle cellule NK L'espansione delle cellule NK può essere avviata utilizzando PBMC purificati o cellule NK. La quantità di PBMC utilizzati per l'espansione può essere variata in base alla quantità di cellule NK desiderato al termine di una espansione tre settimane, fare riferimento alla sezione risultati rappresentativi per i dettagli. (Vedi Nota 1) STIMOLAZIONE 1 Giorno 0 <ol><li> Per ogni 5x10 6 PBMC da espandere, conteggio e irradiare 10x10 6 K562 CL9 mIL21 utilizzando un irradiatore gamma a 100 Gy. </li><li> Irradiazione post, lavare le cellule con PBS e risospendere in espansione dei media cellule NK (NKEM). </li><li> Semi di 5x10 6 PBMC con 10x10 6 irradiati K562 CL9 mIL21 (rapporto 1:2) in 40 mL di NKEM in un pallone T75 e metterlo in posizione verticale in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> Giorni 3 e 5 <ol start="4"><li> Recuperare le cellule mediante centrifugazione a 400g per 5 minuti e sostituire la metà della media con NKEM fresca (aggiungendo IL2 fresco per l'intero volume media) e continuare la cultura. </li></ol> STIMOLAZIONE 2 7 ° giorno <ol><li> Contare il numero di cellule in coltura, alla fine di una settimana. </li><li> Mettere da parte 5x10 5 celle per fenotipizzazione mediante citometria di flusso (vedi nota 2) </li><li> Per ogni 5x10 6 celle da restimolati, conteggio e irradiare 5x10 6 K562 CL9 mIL21 utilizzando un irradiatore gamma a 100 Gy. </li><li> Aggiungi un numero uguale di irradiati K562 CL9 mIL21 (rapporto 1:1) e risospendere in NKEM a 2.5x10 5 cellule totale / mL (vedere Nota 3). </li><li> Semi di cellule in fiasche T75 (massimo 50 ml per ogni cilindro). </li></ol> Giorni 10 e 12 <ol start="6"><li> Contare il numero di cellule. </li><li> Cambia supporto intero con NKEM fresca sulla base del numero di cellule (vedere Nota 3). </li></ol> Giorno 14 <ol start="8"><li> Alla fine di due settimane di espansione contare il numero di cellule in coltura. </li><li> Mettere da parte 5x10 5 celle per fenotipizzazione mediante citometria di flusso (vedi nota 2) </li><li> Se l'espansione è stata avviata da PBMC cellule NK può essere purificato in questa fase di espansione utilizzando il protocollo RosetteSep purificazione (vedi capitolo IV). Se l'espansione è stata avviata da purificato le cellule NK procedere alla stimolazione 3. </li><li> Dopo la purificazione mettere da parte 5x10 5 celle per fenotipizzazione mediante citometria di flusso per verificare la purezza delle cellule NK (come al punto 8). </li><li> Procedere con stimolazione 3 usando tutte le cellule NK purificate (vedi Nota 4). </li></ol> STIMOLAZIONE 3 <ol><li> Risospendere le cellule NK con irradiati K562 CL9 mIL21 (rapporto 1:1) in NKEM base ai numeri di cellulare (vedere Nota 3). </li></ol> Giorni 17 e 19 <ol start="2"><li> Contare il numero di cellule. </li><li> Cambia media con NKEM fresca sulla base del numero di cellule (vedere Nota 3). </li></ol> Giorno 21 <ol start="4"><li> Alla fine delle tre settimane di espansione contare il numero di cellule in coltura. </li><li> Recuperare 1x10 6 celle per l'analisi di citometria a flusso per la piena del pannello degli anticorpi fenotipizzazione delle cellule NK (vedi tabella 1). </li><li> Congelare le cellule in FBS contenente il 10% di DMSO ad una densità massima di 5x10 7 celle per flaconcino per uso futuro. </li></ol> 3. Test di citotossicità delle cellule NK <ol><li> Scongelare una fiala di cellule NK e le sementi in NKEM, un giorno prima performing test di citotossicità per permettere il recupero. </li><li> Per ogni test di citotossicità delle cellule NK utilizzando una linea singola cellula bersaglio, 6x10 5 cellule NK e 3x10 5 cellule bersaglio sono obbligatori (vedi nota 5). </li><li> Preparare CAM-Media diluendo calceina-AM (stock 1 mg / mL in DMSO) in NKEM (vedi Nota 6). </li><li> Risospendere 10 6 cellule bersaglio in 1 ml di CAM-media (vedi nota 7). </li><li> Incubare per 1 ora a 37 ° C, con agitazione occasionale. </li><li> Risospendere le cellule NK a 1x10 6 cellule / ml e aggiungere 200uL di sospensione delle cellule NK a ciascuno dei 3 pozzi di un U-basso 96-pozzetti corrispondenti a 10: 1 E: rapporto T mostrato nella Figura 1. (Vedi nota 8) </li><li> Aggiungi 100uL dei media completa per tutti i pozzetti rimanenti ad eccezione di "Massimo". </li><li> Aggiungi 100uL del 2% Triton X-100 al "Massimo". </li><li> Effettuare diluizioni seriali delle cellule NK per il successivo E 5: Rapporti con il trasferimento di T 100uL di cellule di volta in volta, mescolare bene. Eliminare 100uL degli ultimi pozzi (E: rapporto T di 0.3125:1). </li><li> Dopo 1 ora di carica calceina, lavare le cellule bersaglio in NKEM due volte, centrifugando per 5 min a 1200 giri al minuto. (Vedi nota 9) </li><li> Ricontare le cellule bersaglio e risospendere a 1x10 5 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 100 ml di cellule bersaglio ad ogni pozzetto (1x10 4 / e). Centrifugare per 1 minuto a 100g per iniziare il contatto delle cellule. </li><li> Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 4 ore. </li><li> Mescolare delicatamente la cultura pipettando con un pipetter 100 ul al fine di sospendere in modo uniforme la calceina rilasciato, spin down piastra a 100g per 5 minuti per far sedimentare le cellule e trasferimento 100 l del surnatante in una nuova piastra avendo cura di evitare bolle. Pop eventuali bolle che si possono formare con ago sottile. </li><li> Leggere la piastra con un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione filtro di 485 nm, emissione filtro di 530 nm). Leggere in basso è raccomandato. </li><li> Calcolare Lysis specifici percentuale secondo la formula [(rilascio spontaneo rilascio di test) / (massimo stampa - rilascio spontaneo)] x 100. </li></ol> 4. Purificazione di cellule NK RosetteSep <ol><li> Prendere di 100 volte l'eccesso di globuli rossi a quella di PBMC o cellule espanse, in una provetta da 50 ml (100:1 RBC: PBMC). </li><li> Se si utilizza globuli rossi freschi procedere direttamente alla fase successiva o se i globuli rossi venivano conservati in soluzione Alsever s, contare il numero di globuli rossi e lavare appropriati (100 volte in eccesso) quantità di globuli rossi con PBS integrata con il 2% FBS tre volte, centrifugando a 1200 rpm per 10 minuti ogni volta. </li><li> Combina globuli rossi con PBMC dal punto 1.7 o cellule espanse a partire dal punto in PBS 2,10 + 2% FBS ad un volume finale di 1 mL per 5x10 7 di PBMC o cellule espanse. </li><li> Aggiungere 1ml di RosetteSep  umani Cocktail cellule NK di arricchimento per 1x10 6 di PBMC o cellule espanse. </li><li> Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti con dolce mescolando ogni 5 minuti. </li><li> Aggiungere uguale volume di PBS mix + 2% FBS delicatamente e strato sulla parte superiore di Ficoll-Paque. </li><li> Ripetere le operazioni di Ficoll-Paque centrifugazione citati per l'isolamento PBMC (Sezione I). </li><li> Contare le cellule NK recuperato dopo purificazione e mettere da parte 5x105 cellule per phenotpying mediante citometria di flusso per la purezza delle cellule NK (Punto 8). </li></ol> 5. Note NOTA 1. Cellule NK può essere espansa direttamente da PBMC, o da RosetteSep  purificato le cellule NK. Abbiamo preso atto di efficienza simile espansione, ma alcuni donatori possono avere molto basso numero di cellule NK con conseguente difficoltà da purificare RosetteSep prima espansione. NOTA 2. Noi abitualmente uso CD56-FITC, CD16-PE, e CD3-PE-Cy5 per fenotipizzazione durante l'espansione, enumerando le cellule NK, come quelle che sono negativi e CD3-CD16 o CD56-positive. NOTA 3. Ad ogni cambio dei media o la stimolazione, risospendere le cellule a 2,5 x 10 5 / ml per mantenere PBMC / numero di cellule NK pari o inferiore a 2 milioni di euro mL nelle fasi di picco di espansione. Questo consentirà di evitare l'esaurimento delle sostanze nutritive e di contribuire a realizzare la massima espansione e sopravvivenza. NOTA 4. Il tasso di espansione è donatore NK dipendente e alla fine di stimolazioni 1 o 2 parte delle cellule possono essere congelati e parte ampliato ulteriormente a seconda delle esigenze sperimentali. Abbiamo avuto un buon successo nell'usare le cellule congelate per le espansioni in un secondo momento. NOTA 5. Al fine di consentire margine di errore si consiglia di utilizzare un minimo di 7x10 5 cellule NK risospese in 700 ULS di NKEM e 4x10 5 calceina-AM cellule bersaglio colorate risospese in 4 ml di NKEM per l'impostazione del test di citotossicità. Se si utilizza pipetta multicanale per la semina delle cellule bersaglio maggiori volumi di cellule (fino a 6x10 5 in 6 ml) può essere richiesto in base alle dimensioni del supporto bacino utilizzato. Anche i numeri consigliati cellule NK sono specifici per la E: T ratio mostrano nel protocollo, per l'utilizzo di più E: T ratio aumentareil numero delle cellule NK per ml di conseguenza (ad esempio per un 40:1 E: 4x10 rapporto T usare 6 cellule / ml) NOTA 6. Si consiglia di eseguire una preliminare calceina-AM carico titolazione per la linea di cellule bersaglio di scelta, utilizzando i seguenti diluizioni di 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 e 1:100 per ottenere differenza ottimale tra massimo rilascio e spontaneo. NOTA 7. Quando si utilizza una linea aderente cella come obiettivo, prima preparare sospensione singola cella utilizzando non enzimatica delle cellule tampone dissociazione. Se si esegue ADCC, preparare un tubo duplicato di cellule bersaglio nel CAM-media. NOTA 8 Se si esegue ADCC, aggiungere stessa cellule NK di 3 pozzi che corrisponde a 10:1 E:. T per ADCC. Ripetere l'operazione per i donatori aggiuntivi. Ripetere l'operazione per le cellule bersaglio aggiuntivi. NOTA 9. Se si esegue un esperimento ADCC, dopo 45 minuti di carico calceina, aggiungere 10ug di anticorpi specifici per indurre ADCC contro le cellule bersaglio. Dopo 15 minuti, lavare le cellule bersaglio in terreno completo due volte, centrifugando per 5 min a 1200 giri al minuto. Risospendere le cellule a 1x10 5 cellule / ml e procedere con il passo successivo nel protocollo. 6. RAPPRESENTANTE RISULTATI <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Quando l'espansione è effettuata secondo lo schema descritto sopra, usando 5x106 PBMC come materiale di partenza, tipico delle cellule NK gamma rese da 1x10 dal 9-10 ottobre cellule (variabilità donatore dipendente). La figura mostra l'espansione delle cellule NK volte (n = 19) rispetto alle cellule NK presenti nel prodotto originale (media + / - quartile). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Le cellule NK ampliato esprimere vari recettori delle cellule NK, che sono paragonabili alle cellule primarie non espanso NK con poche eccezioni (CD11b, CD160 e CD244). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Ripresa PBMC da Buffy pelo è donatore dipendente e può variare da 6 a 300x10 800x10 6. Le cellule NK possono prevedere 2% - 18% dei PBMC. RosetteSep per la purificazione delle cellule espanse, recupero di puro cellule NK al giorno 14 compreso tra 40-70%. Seguendo il protocollo raccomandato di espansione e di purificazione, la purezza delle cellule NK del 99% può essere previsto. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Cellule NK espanso hanno dimostrato la citotossicità contro una serie di linee cellulari tumorali tra cui il neuroblastoma, leucemia mieloide acuta, l'osteosarcoma e il melanoma (rappresentante uccidendo AML mostrato come lisi specifica per cento).

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<li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A%2C+4-1BB+ligand%2C+and+interleukin-15%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

NK di espansione cellulare e Media di attivazione (NKEM) <ul><li> 90% di RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> 10% di siero fetale bovino (Gibco) </li><li> 1x penicillina / streptomicina (Cellgro) </li><li> 1x L-Glutammina (Gibco) <ul><li> Filtro dei media Sterilizzare prima dell&#39;uso. </li></ul></li><li> 50 U / mL IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc.) <ul><li> - Diluito da una UI / mL 200 stock. Aggiungi IL2 alla quantità desiderata di mezzi poco prima di utilizzare ogni volta. </li></ul></li></ul> PBMC e NK cella di isolamento <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Soluzione di Alsever (Sigma) </li><li> RosetteSep umani NK arricchimento Cocktail Cell (Tecnologie Stemcell) </li></ul> Test di citotossicità delle cellule NK <ul><li> Calceina-AM (Invitrogen) <ul><li> Soluzione madre è a 1 mg / ml, conservare congelato in aliquote di 50 microlitri. Sciogliere in NKEM mezzi per ottenere la diluizione desiderata per la colorazione delle cellule. </li></ul></li></ul> Anticorpi L&#39;elenco degli anticorpi utilizzati per la fenotipizzazione delle cellule NK sono elencati nella tabella sottostante; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Anticorpo </td><td> Volume per test </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Provetta 1 </td><td valign="top"> Isotipo FITC Isotipo FITC Isotipo FITC Isotipo FITC FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Provetta 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tubo 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D Systems Miltenyi Biotec R &amp; D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tubo 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tubo 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tubo 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS Buffer Volume totale </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico nk

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells 

Natural killer (NK) svolgono un ruolo importante nella sorveglianza immunitaria contro una varietà di microrganismi infettivi e tumori. Limitata disponibilità di cellule NK e la capacità di espandere in vitro ha limitato lo sviluppo di immunoterapia delle cellule NK. Qui si descrive un metodo per estendere in modo efficiente grandi quantità di funzionali NK cellule ex vivo utilizzando cellule che esprimono K562 legata alla membrana IL21, come artificiale delle cellule presentanti l&#39;antigene (aAPC). Terapie con cellule NK adottivi fino ad oggi hanno utilizzato un prodotto cellulari ottenute da steady-state leucaferesi del donatore seguita da deplezione delle cellule T o selezione positiva delle cellule NK. Il prodotto è solitamente attivata in IL-2 durante la notte e poi somministrato il giorno seguente 1. A causa della bassa frequenza di cellule NK nel sangue periferico, un numero relativamente piccolo di cellule NK sono stati consegnati nel corso degli studi clinici. L&#39;incapacità di propagare le cellule NK in vitro è stato il fattore limitante per la generazione di numero di cellule sufficiente per l&#39;ottimale risultato clinico. Alcuni di espansione delle cellule NK (5-10 volte più di 1-2 settimane) è essere raggiunto attraverso alte dosi di IL-2 solo 2. L&#39;attivazione di cellule T autologhe possono mediare l&#39;espansione delle cellule NK, presumibilmente anche attraverso il rilascio di citochine locali 3. Supporto con stroma mesenchimale o cellule che presentano l&#39;antigene artificiale (aAPCs) in grado di supportare l&#39;espansione delle cellule NK sia da sangue periferico e cordone ombelicale 4. Combinato NKp46 e l&#39;attivazione da CD2 legate agli anticorpi perline è attualmente commercializzato per l&#39;espansione delle cellule NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), con conseguente espansione circa 100 volte in 21 giorni. Studi clinici utilizzando aAPC-espanso o attivate le cellule NK sono in corso, uno che utilizza la linea cellulare leucemica CTV-1 al primo e attivare le cellule NK 5 senza significativa espansione. Un secondo processo utilizza EBV-LCL per l&#39;espansione delle cellule NK, raggiungendo una espansione media 490 volte in 21 giorni 6. Il terzo utilizza un K562-based aAPC trasdotte con 4-1BBL (CD137L) e legata alla membrana IL-15 (MIL-15) 7, che ha raggiunto una media di espansione NK 277-volte in 21 giorni. Anche se, le cellule NK espansa utilizzando K562-41BBL-mIL15 aAPC sono altamente citotossici in vitro e in vivo rispetto ai non espanso cellule NK, e partecipare a ADCC, la loro proliferazione è limitata dalla senescenza attribuito a un accorciamento dei telomeri 8. Più di recente di 350 volte l&#39;espansione delle cellule NK è stato segnalato con K562 esprimere MICA, 4-1BBL e IL15 9. Il nostro metodo di espansione delle cellule NK descritta nel presente documento produce rapida proliferazione delle cellule NK senza senescenza raggiungere un&#39;espansione media 21 mila volte in 21 giorni.

Qui si descrive un metodo per estendere in modo efficiente e purificare un gran numero di cellule NK e valutare la loro funzione.

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

Le cellule natural killer (NK) svolgono un ruolo importante nella sorveglianza immunitaria contro una varietà di microrganismi infettivi e tumori. La disponibilità limitata di...

L'obiettivo generale di questa procedura è espandere rapidamente un elevato numero di cellule NK umane. Iniziare ex vivo isolando le pBMC o le cellule NK da un campione di strato buffo o di sangue intero. Successivamente, coltivare in co-coltura le pBMC con cellule presentanti l'antigene artificiali nell'espansione delle cellule NK.Il mezzo integrato con IL-2 mantiene la coltura delle cellule NK per tre settimane, con stimolazioni settimanali mediante aAPC, avendo cura di mantenere il numero di cellule NK al di sotto di 1 × 10⁶ per millilitro di coltura. Alla fine, si verifica l'efficacia funzionale delle cellule NK espanse mediante un saggio di citotossicità non radioattivo. Un tipico rendimento di cellule NK ottenuto con questo schema di espansione risulta in un'espansione mediana di 21.000 volte delle cellule NK al termine di 21 giorni, che mostrano elevata citotossicità contro vari tumori, come determinato tramite un saggio di rilascio del calcio.Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda fondamentale nel campo della biologia delle cellule NK, poiché ottenere grandi quantità di cellule NK è stato storicamente molto difficile. Questa tecnica ha implicazioni per l'immunoterapia del cancro umano, perché generare un numero sufficiente di cellule NK per tale terapia è stato storicamente molto complesso. La dimostrazione di questa tecnica sarà effettuata da Cecily, l'assistente di ricerca senior del mio laboratorio, per ottenere PBMC dal sangue di donatori sani.Tipicamente viene utilizzato come fonte il buffy coat proveniente dalla banca del sangue. Per prima cosa, aggiungere PBS per regolare il volume del buffy coat a 140 millilitri. Successivamente, stratificare 35 millilitri di campione su 15 millilitri di fial PA per la centrifugazione di separazione in gradiente a 400 G per 20 minuti.Senza interruzione. Recuperare con attenzione le BMC-P dall'interfaccia plasma Fial PA e mettere da parte il tubo dei globuli rossi per un uso successivo. Lavare le BMC-P tre volte con PBS, centrifugando ogni volta a 400 ×g per 10 minuti.Utilizzare questa frazione di P BMCs per l'espansione delle cellule NK. Tornare ora al tubo del gradiente. Aspirare il fi.Trasferire i globuli rossi in due provette da centrifuga da 50 millilitri e lavarli con PBS aggiunto fino al segno dei 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante prelevando delicatamente lo strato superiore del pellet di globuli rossi. Per rimuovere i granulociti.Eseguire tre lavaggi, quindi risospendere i globuli rossi in un volume uguale di soluzione else's e conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. Questa frazione di globuli rossi può essere utilizzata per la purificazione mediante rosetta SEP delle cellule NK al termine di due settimane di espansione. Per espandere in modo efficiente cellule NK funzionali ex vivo, utilizzare le cellule della linea K 5 62 clone nine con IL-21 legata alla membrana, indicate qui di seguito come K 5 62.Utilizzare nove cloni di IL-21 come cellule presentatrici di antigene artificiali; innanzitutto, contare i PBMC e calcolare il volume necessario per ottenere cinque milioni di cellule da seminare per l'espansione delle cellule NK. Per ogni conteggio di cinque milioni di PBMC, irradiare dieci milioni di cellule K562 clone 9 IL-21. Irradiare le cellule utilizzando un irradiatore a raggi gamma a 100 Gy; le cellule irradiate possono anche essere congelate per un uso futuro. Lavare ora le cellule pre-irradiate con PBS e risospendere nel mezzo di espansione per cellule NK.Ora si osserva un rapporto di due a uno tra cellule irradiate e PBMC in 40 millilitri di mezzo di espansione per cellule NK e si posiziona il fiasco T75 in posizione verticale in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica al terzo giorno. Recuperare le cellule stimolate mediante centrifugazione a 400 ×g per cinque minuti e sostituire metà del mezzo con NKEM fresco, continuando la coltura. Ripetere il cambio di mezzo al quinto giorno. Alla fine di una settimana, contare il numero di cellule, mettendone da parte 5 × 10⁵ per la fenotipizzazione mediante citometria a flusso, e per la seconda stimolazione contare e irradiare un rapporto uno a uno di K562.Clonare nove cellule IL 21 per espanderne il numero, quindi combinare le cellule in mezzo di espansione per cellule NK a una concentrazione di 2,5 × 10⁵ cellule totali per millilitro. Osservare ora le cellule in fiasche T75 e continuare la coltura nei giorni 10 e 12, passando le cellule in mezzo di espansione per cellule NK a 2,5 × 10⁵ cellule per millilitro al giorno 14 dell'espansione. Nuovamente, enumerare le cellule e fenotipizzare un campione mediante citometria a flusso.Purificare l'espansione cellulare derivata da PBMC utilizzando il protocollo di purificazione rosette SEP e verificare la purezza delle cellule NK mediante fenotipizzazione tramite citometria a flusso. Eseguire una terza stimolazione sulle cellule NK purificate utilizzando un rapporto uno a uno di cellule K562 clone 9 irradiate che esprimono IL-21. Infine, al giorno 21, analizzare le cellule NK amplificate mediante citometria a flusso utilizzando un pannello completo di anticorpi per la fenotipizzazione.Congelare le colture cellulari in FBS contenente DMSO al 10% a una densità massima di cinque volte 10 alla settima cellule per provetta. Utilizzare cellule NK fresche o congelate per il saggio di citotossicità. Se si utilizzano cellule NK congelate, scongelare innanzitutto la provetta di cellule NK e seminare in NKEM per 24 ore per consentire il recupero cellulare nel giorno del saggio; risospendere 10 alla sesta cellule bersaglio in un millilitro di NKEM contenente calcio am e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius con agitazione occasionale. In una piastra UBO a 96 pozzetti, aggiungere in triplice replicato 200 microlitri di cellule NK risospese a una concentrazione di una volta 10 alla sesta cellule per millilitro ed eseguire diluizioni seriali delle cellule come indicato.Dopo un'ora di carico con calcio, lavare le cellule bersaglio nel mezzo di espansione delle cellule NK mediante due centrifugazioni di cinque minuti a 400 ×g. Contare nuovamente le cellule bersaglio e risospendere a una concentrazione di 1 × 10⁵ cellule per millilitro. Aggiungere 100 microlitri di cellule bersaglio in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e centrifugare per un minuto a 100 ×g per favorire il contatto cellulare; quindi incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro ore.Per sospendere in modo uniforme il calcio rilasciato, mescolare delicatamente la coltura aspirando e dispensando il pellet cellulare a 100 G per cinque minuti e trasferire 100 microlitri del soprannatante in una nuova piastra piatta da 96 pozzetti, avendo cura di evitare la formazione di bolle; se necessario, eliminare eventuali bolle formatesi utilizzando un ago sottile. Leggere la piastra mediante un lettore fluorimetrico impostato su un filtro di eccitazione a 485 nanometri e un filtro di emissione a 530 nanometri.Calcolare la lisi specifica percentuale. Tipicamente, l'espansione di cinque volte 10 alla sesta pbmc isolate dal buffy coat produce tra uno virgola zero volte 10 alla nona e 10 alla decima cellule NK. Le cellule NK espanse esprimono vari recettori delle cellule NK paragonabili a quelli delle cellule NK primarie non espanse presenti nel buffy coat.I linfociti NK possono rappresentare dal 2% al 18% dei PBMC al giorno 14. La purificazione mediante rosette SEP delle cellule espanse può recuperare dal 40% al 70% delle cellule NK presenti nella coltura, con una purezza delle cellule NK del 99%, indicata dal marcatore CD3. Le cellule NK espanse CD56 positive e CD56 negative hanno dimostrato citotossicità contro una serie di linee cellulari tumorali, inclusi neuroblastoma, leucemia mieloide acuta (AML), osteosarcoma e melanoma.Qui l'uccisione rappresentativa mediata da linfociti T citotossici (A ML) è mostrata come percentuale di lisi specifica. Il video BIOT in tempo reale mostra l'uccisione da parte dei linfociti NK della linea cellulare di neuroblastoma CHP 134 carica di calcio am dopo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi della produzione di citochine da parte dei linfociti NK e il trasferimento adattativo in modelli animali di tumore, possono essere eseguiti, come è noto, per rispondere ad ulteriori domande riguardo le funzioni dei linfociti NK.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come espandere e purificare un elevato numero di cellule NK. Questo può essere ottenuto direttamente a partire da cellule mononucleate del sangue periferico, per poi purificare le cellule NK, oppure si può avviare l'espansione utilizzando cellule NK già purificate mediante il metodo delle rosette. All'inizio, un tipico strato di buffy coat fornirà da 15 a 40 milioni di cellule NK, tutte utilizzabili per espandere un numero molto elevato di cellule NK seguendo lo schema descritto in questo metodo.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Qui si descrive un metodo per l'attivazione ed espandere cellule NKT dal bulk popolazioni di cellule T usando cellule presentanti antigene artificiali (AAPC). L'uso di CD1d basata AAPC fornisce un metodo standard per la generazione di numeri elevati di cellule NKT funzionali.

Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Questo video mostra una tecnica per l'espansione di cellule natural killer (NK) direttamente dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando una linea cellulare alimentatrice. Le PBMC sono co-coltivate con cellule alimentatrici linfoblastoidi geneticamente modificate che esprimono l'interleuchina-21 legata alla membrana (mIL-21) e la coltura è integrata con le citochine interleuchina-2 (IL-2) e interleuchina-15 (IL-15). Insieme, questo cocktail di ligandi porta...

Espansione ex vivo di cellule natural killer da cellule mononucleate del sangue periferico

Questo protocollo descrive lo sviluppo, l'espansione e immagini in vivo di cellule NK derivate da hESCs e iPSCs.

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

Qui presentiamo un protocollo adattato che può essere utilizzato per generare un gran numero di cellule T natural killer invarianti murine dalla milza di topo. Il protocollo delinea un approccio attraverso il quale le cellule spleniche iNKT possono essere arricchite, isolate ed espanse in vitro utilizzando un numero limitato di animali e reagenti.

Un metodo ottimizzato per l&#39;isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse

Un metodo semplice ed affidabile è descritto qui di analizzare un insieme di funzioni delle cellule NK come degranulazione, citochine e chemochine ai differenti sottopopolazioni di cellule NK.

Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l'attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Un protocollo per lo studio di eventi guidati da FcγRIIIa da anticorpi terapeutici in cellule natural killer umane è descritto qui. Questa piattaforma di stimolazione artificiale consente l'interrogazione delle funzioni emozionali a valle come la degranulazione, la produzione di chemochine / citochine e le vie di segnalazione mediate dalle porzioni FcγRIIIa e Fc degli anticorpi coinvolti nel legame.

Valutazione degli eventi delle cellule natural killer umane guidati dall'impegno di FcγRIIIa nella presenza di anticorpi terapeutici

Descriviamo un protocollo rapido e robusto per arricchire le cellule T natural killer invarianti (iNKT) dalla milza di topo ed espanderle in vitro a numeri adatti per studi in vitro e in vivo.

Purificazione ed espansione di cellule T Natural Killer invarianti di topo per studi in vitro e in vivo

Qui, presentiamo un metodo per espandere il natural killer del sangue periferico (PBNK), le cellule NK dai tessuti epatici e le cellule del recettore dell'antigene chimerico (CAR)-NK derivate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o sangue del cordone ombelicale (CB). Questo protocollo dimostra l'espansione delle celle NK e CAR-NK utilizzando celle di alimentazione 221-mIL-21 oltre alla purezza ottimizzata delle celle NK espanse.

Metodo di espansione cellulare Natural Killer (NK) e CAR-NK utilizzando la linea cellulare B modificata Membrane Bound-IL-21-Modified

Il presente protocollo mostra come differenziare le cellule CD3−/CD45+CD56+ con citotossicità lieve dalle cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) sia in condizioni di coltura 3D che 2D. Ciò consente la convalida fenotipica di routine senza la distruzione del complesso microambiente.

Generazione di cellule Natural Killer da cellule staminali umane espanse

Scopri come espandere e purificare cellule NK umane periferiche con un metodo che raggiunge una espansione mediana di 21.000 volte in 21 giorni. Questa tecnica consente di ottenere grandi quantità di cellule NK funzionali per applicazioni terapeutiche in immunoterapia oncologica.

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

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