Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

L'obiettivo generale di questa procedura è espandere rapidamente un elevato numero di cellule NK umane. Iniziare ex vivo isolando le pBMC o le cellule NK da un campione di strato frazionario (buffy coat) o da sangue intero. Successivamente, coltivare in co-coltura le pBMC con cellule presentanti l'antigene artificiali nell'espansione delle cellule NK.

Il mezzo integrato con IL-2 mantiene la coltura di cellule NK per tre settimane, con stimolazioni settimanali mediante aAPC, avendo cura di mantenere il numero di cellule NK al di sotto di 1 × 10⁶ per millilitro di coltura. Alla fine, si verifica l'efficacia funzionale delle cellule NK espanse mediante un saggio di citotossicità non radioattivo. Un tipico rendimento di cellule NK ottenuto con questo schema di espansione risulta in un'espansione mediana di 21.000 volte delle cellule NK al termine di 21 giorni, che mostrano elevata citotossicità contro vari tumori, come determinato tramite un saggio di rilascio del calcio.

Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda fondamentale nel campo della biologia delle cellule NK, poiché ottenere grandi quantità di cellule NK è stato storicamente molto difficile. Questa tecnica ha implicazioni per l'immunoterapia del cancro umano, perché generare un numero sufficiente di cellule NK per tale terapia è stato storicamente molto complesso. La dimostrazione di questa tecnica sarà effettuata da Cecily, l'assistente di ricerca senior del mio laboratorio, per ottenere PBMC dal sangue di donatori sani.

Tipicamente viene utilizzato come fonte il buffy coat proveniente dalla banca del sangue. Inizialmente, aggiungere PBS per regolare il volume del buffy coat a 140 millilitri. Successivamente, stratificare 35 millilitri di campione su 15 millilitri di fiala PA per la centrifugazione in gradiente a 400 G per 20 minuti.

Senza interruzione. Recuperare con attenzione le BMC-P dall'interfaccia plasma Fial PA e mettere da parte il tubo di globuli rossi da utilizzare in seguito. Lavare le BMC-P tre volte con PBS, centrifugando ogni volta a 400 ×g per 10 minuti.

Utilizzare questa frazione di BMCs per l'espansione delle cellule NK. Tornare ora al tubo del gradiente. Aspirare il fi.

Trasferire i globuli rossi in due provette da centrifuga da 50 millilitri e lavarli con PBS aggiunto fino al segno dei 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante rimuovendo delicatamente lo strato superiore dello strato di globuli rossi. Per rimuovere i granulociti.

Eseguire tre lavaggi, quindi risospendere i globuli rossi in un volume uguale di soluzione else's e conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. Questa frazione di globuli rossi può essere utilizzata per la purificazione mediante rosetta SEP delle cellule NK al termine di due settimane di espansione. Per espandere in modo efficiente cellule NK funzionali ex vivo, utilizzare le cellule della linea K 5 62 clone nine con IL 21 legata alla membrana, indicate qui di seguito come K 5 62.

Utilizzare nove cloni di IL-21 come cellule presentatrici di antigene artificiali; innanzitutto, contare i PBMC e calcolare il volume necessario per ottenere cinque volte 10 alla sesta cellule da seminare per l'espansione delle cellule NK, per ogni conteggio di cinque volte 10 alla sesta PBMC, e irradiare 10 volte 10 alla sesta cellule K562 clone nove IL-21. Irradiare le cellule utilizzando un irradiatore a raggi gamma a 100 Gy; le cellule irradiate possono anche essere congelate per un uso futuro. Lavare ora le cellule pre-irradiate con PBS e risospendere nel mezzo di espansione per cellule NK.

Ora si osserva un rapporto di due a uno tra cellule irradiate e PBMC in 40 millilitri di mezzo di espansione per cellule NK e si posiziona il fiasco T75 in posizione verticale in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica al terzo giorno. Recuperare le cellule stimolate mediante centrifugazione a 400 ×g per cinque minuti e sostituire metà del mezzo con NKEM fresco, continuando la coltura. Ripetere il cambio di mezzo al quinto giorno. Al termine di una settimana, contare il numero di cellule, mettendone da parte 5 × 10⁵ per la fenotipizzazione mediante citometria a flusso, e per la seconda stimolazione contare e irradiare un rapporto uno a uno di K562.

Clonare nove cellule IL 21 per espanderne il numero, quindi combinare le cellule in mezzo di espansione per cellule NK a una concentrazione di 2,5 × 10⁵ cellule totali per millilitro. Osservare ora le cellule in fiaschi T75 e continuare la coltura; al giorno 10 e al giorno 12 passare le cellule in mezzo di espansione per cellule NK a 2,5 × 10⁵ cellule per millilitro al giorno 14 dell'espansione. Nuovamente, enumerare le cellule e fenotipizzare un campione mediante citometria a flusso.

Purificare questa espansione cellulare derivata da PBMC utilizzando il protocollo di purificazione rosette SEP e verificare la purezza delle cellule NK mediante fenotipizzazione con citometria a flusso. Eseguire una terza stimolazione sulle cellule NK purificate utilizzando un rapporto uno a uno di cellule K 5 62 clone nine IL 21 irradiate. Infine, al giorno 21, analizzare le cellule NK amplificate mediante citometria a flusso utilizzando un pannello completo di anticorpi per la fenotipizzazione.

Congelare le scorte cellulari in FBS contenente DMSO al 10% a una densità massima di cinque volte 10 alla settima cellule per provetta. Utilizzare cellule NK fresche o congelate per il saggio di citotossicità. Se si utilizzano cellule NK congelate, scongelare innanzitutto la provetta di cellule NK e seminare in NKEM per 24 ore per consentire il recupero cellulare nel giorno del saggio; risospendere 10 alla sesta cellule bersaglio in un millilitro di NKEM contenente calcio am e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius con agitazione occasionale in una piastra UBO a 96 pozzetti. Aggiungere in triplice replicato 200 microlitri di cellule NK risospese a una concentrazione di una volta 10 alla sesta cellule per millilitro ed eseguire diluizioni seriali delle cellule come indicato.

Dopo un'ora di carico con calcio, lavare le cellule bersaglio nel mezzo di espansione delle cellule NK mediante due centrifugazioni di cinque minuti a 400 G. Contare nuovamente le cellule bersaglio e risospendere a una concentrazione di 1 × 10⁵ cellule per millilitro. Aggiungere 100 microlitri di cellule bersaglio in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e centrifugare per un minuto a 100 G per avviare il contatto cellulare; quindi incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro ore.

Per sospendere in modo uniforme il calcio rilasciato, mescolare delicatamente la coltura pipettando le cellule del pellet a 100 G per cinque minuti e trasferire 100 microlitri del soprannatante in una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo piatto, avendo cura di evitare bolle; se necessario, eliminare eventuali bolle formatesi utilizzando un ago sottile. Leggere la piastra utilizzando un lettore fluorimetrico impostato su un filtro di eccitazione a 485 nanometri e un filtro di emissione a 530 nanometri.

Calcolare la lisi specifica percentuale. Tipicamente, l'espansione di cinque volte 10 alla sesta pbmc isolate dal buffy coat produce tra uno virgola zero volte 10 alla nona e 10 alla decima cellule NK. Le cellule NK espanse esprimono vari recettori delle cellule NK paragonabili a quelle primarie non espanse presenti nel buffy coat.

I linfociti NK possono rappresentare dal 2% al 18% dei PBMC al giorno 14. La purificazione mediante rosette SEP delle cellule espanse può recuperare dal 40% al 70% delle cellule NK presenti nella coltura, con una purezza delle cellule NK del 99%, indicata dal marcatore CD3. Le cellule NK espanse CD56 negative e CD56 positive hanno dimostrato citotossicità contro una serie di linee cellulari tumorali, inclusi neuroblastoma, leucemia mieloide acuta (AML), osteosarcoma e melanoma.

Qui, l'uccisione rappresentativa mediata da A ML è mostrata come percentuale di lisi specifica. Il video BIOT in tempo reale mostra l'uccisione da parte delle cellule NK della linea cellulare di neuroblastoma CHP 1 34 caricate con calcio am Dopo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi della produzione di citochine da parte delle cellule NK e il trasferimento adattativo in modelli animali di tumore, possono essere eseguiti, come è noto, per rispondere a ulteriori domande riguardanti le funzioni delle cellule NK.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come espandere e purificare un elevato numero di cellule NK. Questo può essere ottenuto direttamente a partire da cellule mononucleate del sangue periferico, per poi purificare le cellule NK, oppure si può avviare l'espansione utilizzando cellule NK purificate con il metodo delle rosette. All'inizio, un tipico strato di buffy coat fornirà da 15 a 40 milioni di cellule NK, tutte utilizzabili per espandere un numero molto elevato di cellule NK seguendo lo schema descritto in questo metodo.