Un metodo ottimizzato per l'isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è espandere le cellule T natural killer in variante, o cellule INKT, ottenute dalla milza del topo. Ciò viene realizzato isolando innanzitutto le cellule mononucleate spleniche, seguito dall'arricchimento della popolazione linfocitaria positiva per CD5 mediante separazione cellulare magnetica. La frazione di cellule INKT spleniche viene quindi ulteriormente isolata mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza.

Nell'ultima fase, le cellule INKT ordinate vengono seminate per l'espansione in vitro. In definitiva, il profilo citochinico delle cellule INKT espanse può essere valutato mediante Eliza. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo avranno difficoltà poiché la purificazione e l'espansione delle cellule INKT richiedono la combinazione di diverse tecniche da eseguire.

Questa procedura verrà eseguita da uno studente laureando del mio laboratorio. Dopo aver prelevato la milza, trasferire il tessuto in un filtro in nylon da 70 micron, quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa da due millilitri per schiacciare delicatamente la milza attraverso il filtro in un tubo conico da 50 millilitri e lavare il filtro con cinque millilitri di PBS. Successivamente, aggiungere tre millilitri del coal pack in un tubo da 15 millilitri e sovrapporre al gradiente di densità i cinque millilitri di sospensione cellulare.

Separare le cellule mediante centrifugazione e trasferire l'interfaccia in un nuovo tubo da 15 millilitri. Quindi lavare le cellule con 10 millilitri di PBS freddo e risospendere il pellet in due millilitri di buffer fax per arricchire i linfociti splenici positivi per CD5. Regolare il diluimento cellulare a 1 × 10⁷ cellule per 90 microlitri aggiungendo altro buffer fax e aggiungere 10 microlitri di microperle anti-CD5 alle cellule.

Dopo 15 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le cellule con quattro millilitri di buffer fax e risospendere il pellet in 500 microlitri di buffer fax fresco. Isolare le cellule CD5 positive mediante separazione cellulare magnetica secondo le raccomandazioni del produttore. Successivamente, diluire i linfociti CD5 positivi arricchiti a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule per 20 microlitri di buffer inax contenente anti-CD16, CD32 e il tetramero PE-coniugato α-GalCer CD1d, a temperatura ambiente e al buio. Dopo 30 minuti, incubare le cellule con gli anticorpi di interesse a quattro gradi Celsius, al buio, per altri 30 minuti.

Quindi lavare le cellule in un nuovo tampone fax e colorarle con 10 microlitri di una soluzione lavorativa di 20 micromolare di DPI per un milione di cellule per cinque minuti. A temperatura ambiente, acquisire ora circa diecimila eventi di linfociti arricchiti positivi per CD5 mediante citometria a flusso, effettuando un gating elettronico in base allo scatter anteriore con bassa intensità per escludere i doppietti e gli aggregati cellulari. Eliminare elettronicamente le cellule positive per DAPI, positive per CD8 e positive per CD19 all'interno della popolazione con basso scatter anteriore, utilizzando grafici di area dello scatter laterale e dello scatter anteriore.

Per selezionare elettronicamente i linfociti, tracciare i tetrameri alfa-gal SER CD1D rispetto a CD3 epsilon ed estrarre elettronicamente le cellule iNKT positive ai tetrameri alfa-gal SER CD1D e positive a CD3 epsilon come indicato. Successivamente, acquisendo non più di due volte 10 alla quinta linfociti arricchiti CD5 positivi, determinare la percentuale di cellule iNKT positive ai tetrameri alfa-gal SER CD1D e positive a CD3 epsilon presenti nella frazione cellulare arricchita. Utilizzando questa finestra di selezione bassa, ordinare le cellule iNKT positive ai tetrameri alfa-gal SER CD1D e positive a CD3 epsilon in un tubo FACS contenente un millilitro di siero fetale bovino alla fine dell'ordinamento.

Risciacquare le cellule NKT isolate dalla parete del tubo FACS con 10 millilitri di mezzo RPMI 1640. Quindi centrifugare le cellule, risospendere il pellet in un millilitro di RPMI 1640 e utilizzare un'aliquota di 40 microlitri delle cellule per valutare la purezza delle cellule ordinate. Utilizzando la stessa strategia di gating.

Per quanto riguarda l'impostazione dei parametri di coltura per l'espansione delle cellule INKT, centrifugare le cellule e risospendere le cellule isolate a una concentrazione di cinque volte 10 alla quinta cellule per millilitro in mezzo RPMI 1640 completo integrato con IL-2, IL-12 e anti-CD28. Quindi seminare le cellule a una densità di una volta 10 alla quinta cellule INKT per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto rivestita con anti-CD3 epsilon e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari. Dopo due giorni, trasferire le cellule in una nuova piastra da 96 pozzetti a fondo piatto non rivestita per la coltura in condizioni di riposo in RPMI 1640 completo.

Mezzo per un'ulteriore incubazione di due giorni. Al quarto giorno dopo il sorting, pipettare delicatamente il soprannatante in ciascuna pozzetta per staccare le cellule e raccoglierle in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet a una concentrazione di cinque volte 10 alla quinta cellule per millilitro.

In RPMI 1640 completo integrato con IL-7, seminare 1 × 10⁵ cellule per pozzetto in una nuova piastra da 96 pozzetti a fondo piatto. Dopo quattro giorni, trasferire le cellule in un tubo conico da 15 mL per la centrifugazione. Ri-sospendere il pellet in mezzo RPMI 1640 completo contenente anti-CD28 solubile e seminare le cellule in una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto rivestita con anti-CD3ε, a 1 × 10⁵ cellule per pozzetto, quindi reinserire le cellule nell'incubatore per altri tre-quattro giorni, dal giorno 11 al giorno 18.

Ripetere il trattamento con IL-7, anti-CD28 e anti-CD3 epsilon come appena mostrato al giorno 19. Trasferire le cellule in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare e risospendere il pellet a 5 × 10⁵ cellule per millilitro in mezzo RPMI 1640 completo.

Quindi seminare le cellule a una concentrazione di 1 × 10⁵ cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto e lasciare riposare le cellule per due giorni nell'incubatore per colture cellulari. La stimolazione delle cellule INKT ordinate mediante anti-CD3 epsilon legato alla piastra, in presenza di IL-2, IL-12 e anti-CD28 solubile, determina un'espansione di circa tre volte il numero di cellule INKT dopo due giorni di coltura. L'ulteriore espansione delle cellule INKT in presenza di IL-7 porta a un incremento di tre-quattro volte il numero di cellule INKT presenti al quarto giorno di coltura.

È degno di nota che ripetendo queste condizioni di coltura è possibile ottenere una media di sette volte 10 alla settima cellule INKT dopo due cicli di espansione, senza alcuna perdita visibile di cellule tra i cambiamenti del mezzo di coltura effettuati in giorni diversi, ottenendo così un'espansione di almeno 70 volte in 18 giorni. Le cellule INKT ulteriormente espanse, attivate con CD1D murino ricombinante immobilizzato su piastra e caricato con alfa-alser, producono IL-2, IL-4, IFN-gamma, TNF-alfa e IL-6 a 48 ore dallo stimolo, dimostrando che le cellule INKT conservano la loro capacità di produrre citochine di tipo TH1 e TH2 dopo l'espansione.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la corretta colorazione delle cellule INKT con cdre carico di alfa-ceramide è essenziale per identificare le cellule INKT durante la citometria a flusso.