Name: Un metodo ottimizzato per lisolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Scopri un metodo ottimizzato per isolare ed espandere cellule iNKT dalla milza di topo. Questo protocollo utilizza separazione magnetica e FACS per ottenere un alto rendimento con risorse minime.

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D.E. e M.B.D. sono membri di una piattaforma di ricerca multidisciplinare (MRP) dell'Università di Ghent, e del consorzio Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID).

In questo studio, sono stati utilizzati per adulti (6-8 settimane) femmina C57BL / 6 topi. I topi sono stati ospitati e allevati secondo le linee guida del vivaio Università di Gand. Tutte le procedure di animali sono stati approvati dalla cura degli animali e Comitato Etico Istituzionale. 1. Preparazione di cellule mononucleate (MNC) da Spleen mouse <ol><li> Sacrifica il mouse per dislocazione cervicale. </li><li> Posizionare il mouse verso il basso sul tavolo di dissezione e fissare la cerva e zampe anteriori con perni. </li><li> Sterilizzare la pelle-superficie con il 70% (v / v) di etanolo / H 2 O. </li><li> Tagliare la pelle lungo la linea mediana addominale al torace ed esporre la milza con strumenti chirurgici sterili. </li><li> Dopo il taglio dei tessuti grassi circostanti, posizionare la milza in una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente. </li><li> Sezionare la milza con un bisturi sterile e trasferire i pezzi in un filtro di nylon 70 micron collocato all&#39;interno di una vasca 50 mle. </li><li> Usando una 2 ml stantuffo della siringa, schiacciare delicatamente i pezzi milza attraverso il filtro delle cellule e lavare con 5 ml di PBS 1X. </li><li> Aggiungere 3 ml di Ficoll-Paque in una provetta da 15 ml e sovrapporre il mezzo gradiente di densità con la sospensione cellulare 5 ml. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 20 min a temperatura ambiente senza freno. </li><li> Trasferire il interfase a un nuovo tubo da 15 ml, aggiungere 10 ml di freddo PBS 1X e centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in 2 ml di PBS 1x contenente 0,5% di albumina di siero bovino (BSA) e 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (tampone FACS). Trasferire 10 ml di sospensione cellulare in un piccolo tubo, mescolare con 10 ml di 0,4% </li></ol> 2. Arricchimento, rilevamento e purificazione delle cellule del mouse iNKT <ol><li> Arricchimento di topo milza CD5positive (CD5 +) linfociti. <ol><li> (Opzionale) Stain 10 5 cellule con FITC-coniugato anti-CD5 (4 ml di 1:30 diluizione / 10 6 celle)per 30 minuti a 4 ° C al buio, lavare con 200 ml FACS buffer e risospendere in 500 microlitri di buffer FACS. Preparare una soluzione di lavoro 20 mM di 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in PBS 1x, aggiungere 1 ml della stessa a 10 5 cellule in tampone FACS e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Acquisire 10 4 cellule pre-arricchito sul citofluorimetro. <ol><li> Utilizzando FCS-H e FCS-W, cancello elettronico su cellule Lo FSC W di escludere doppietti cellulari e aggregati (Figura 1A). Allora cancello elettronico fuori DAPI + (morti), le cellule all&#39;interno del FSC W lo popolazione (Figura 1B), e utilizzano SSC-A e FCS-A per selezionare elettronicamente la popolazione linfocitaria per dimensione (Figura 1C). </li><li> Utilizzando cellule all&#39;interno del gate linfocitario, tracciare SSC-A contro CD5 e elettronicamente cancello CD5 + linfociti come mostrato nella Figura 1D. Acquisire il resto del campione pre-arricchito sul citometro a flusso. </li&gt; </ol></li><li> Regolare conta delle cellule a 10 7 cellule per 90 microlitri di buffer di FACS e aggiungere 10 microlitri anti-CD5 microsfere. </li><li> Incubare a 4 ° C per 15 minuti, lavare una volta con 4 ml FACS tampone e risospendere in 500 microlitri di buffer FACS freddo. Arricchisci per CD5 + linfociti con separazione delle cellule magnetico (MACS) colonne secondo le raccomandazioni del fabbricante. </li><li> Opzionale) Macchia 10 5 cellule con FITC-coniugato anti-CD5 (4 l di diluizione 1:30 / 10 6 celle) e DAPI come in 2.1.1. Acquisire 10 4 linfociti arricchite sul citofluorimetro e verificare che i varchi elettronici creati al punto 2.1.1. selezionare CD5 + linfociti nel frazione cellulare arricchito. Acquisire 10 5 cellule sul citometro a flusso e analizzare la percentuale CD5 + linfociti presenti nella frazione arricchita come mostrato nella Figura 1E - H. </li></ol></li><li> Rilevamento e isolamento di topo iNKT cells di FACS. <ol><li> Risospendere CD5 + linfociti arricchiti ad una concentrazione di circa 10 6 cellule per 20 microlitri tampone FACS contenente in anti-CD16 / CD32 (4 ml di diluizione 1:50 / 10 6 cellule) e αGalCer PE-coniugato / CD1d tetramero (1 mg / 10 6 cellule). </li><li> Incubare per 30 minuti a RT al buio. </li><li> Diluire anticorpi murini (mAbs) anti-CD3ε V500 (4 ml di 1:20 diluizione / 10 6 celle), anti-CD19 E450 (4 l di diluizione 1:50 / 10 6 celle) e anti-CD8α E450 (4 ml di 1:50 / 10 6 cellule) in tampone FACS, aggiungi CD5 + linfociti e incubare per 30 min a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml tampone FACS per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere in 4 ml di tampone FACS ad una concentrazione finale di 10 7 cellule / ml. </li><li> Filtrare le cellule attraverso un colino cella 30 micron e posizionare le cellule in ghiaccio. </li><li> Calibrare il citofluorimetro per la cella di smistamento secondo le raccomandazioni del costruttore 14,15. Nota: Calibrazione di un citometro di flusso per l&#39;ordinamento delle cellule richiede una formazione e può essere eseguita da un operatore esperto, o un tecnico specializzato. </li><li> Aggiungere 10 ml di una soluzione di lavoro 20 pM di DAPI per 10 6 cellule e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Acquisire circa 10 4 CD5 + linfociti arricchito sul citofluorimetro. Elettronicamente cancello cellule Lo FSC-W escludere doppietti cellulari e aggregati (Figura 2A). Allora cancello elettronico fuori DAPI + CD8 + CD19 + cellule (canale di scarico) all&#39;interno del FSC W lo popolazione (Figura 2B), e utilizzare SSC-A e FCS-A per selezionare elettronicamente linfociti (Figura 2C), come descritto nella 2.1.1.1 . <ol><li> Trama αGalCer / CD1d tetramero da CD3ε ed elettronicamente cancello αGalCer / CD1dcellule tetramero + CD3ε + iNKT come mostrato nella Figura 2D. Cellule presenti nella frazione cellulare arricchita acquistare più del 2 x 10 5 CD5 + linfociti arricchiti per determinare la percentuale αGalCer / CD1d tetramero + CD3ε + iNKT. </li></ol></li><li> Utilizzando i varchi elettronici creati in 2.2.7., Le cellule FACS sorta αGalCer / CD1d tetramero + CD3ε + iNKT sul citofluorimetro a 70 psi utilizzando un ugello di 70 micron ad un flusso di &#39;1.5&#39;. Raccogliere le cellule iNKT ordinati in una provetta contenente 1 ml FACS 100% FCS. Successivamente lavare cellule iNKT filtrate dal lato del tubo FACS utilizzando 10 ml RMPI 1640 e centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere allineati cellule iNKT in 1 ml RPMI 1640 medium e acquisire 40 microlitri dello stesso su un citofluorimetro per valutare la purezza delle cellule iNKT ordinati. Selezionare FSC-W lo DAPI - linfocitis come descritto in 2.2.7. (Figura 2E - G) ed elettronicamente cancello αGalCer / CD1d cellule tetramero + CD3ε + iNKT come mostrato nella Figura 2H. </li></ol></li></ol> 3. Cultura ed espansione di cellule iNKT mouse Giorno 0 <ol><li> Cappotto una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto con purificata anti-CD3ε (3 mg / ml) per pozzetto per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare due volte con 200 microlitri di PBS 1x e una volta con 200 microlitri completa terreno RPMI 1640 (10% vol / vol FCS, 100 U / ml di penicillina-streptomicina, 5.5 mM β-mercaptoetanolo). </li><li> Contare il numero di cellule vitali filtrate iNKT (fase 2.2.8) utilizzando un emocitometro 0,4% come 1.11., Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere a 5 x 10 5 cellule / ml in RPMI completo 1640 contenente ricombinante IL-2 murino (10 ng / ml), ricombinante murino IL-12 (1 ng / ml) e solubile CD28 anti-topo (5 mg / ml). Piastreorted cellule iNKT a 10 5 cellule / pozzetto in piastre rivestite anti-CD3ε e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 2 giorni. </li></ol> Giorno 2 <ol start="3"><li> Trasferire le cellule ad una non rivestito 96 pozzetti a fondo piatto fresco e coltura delle cellule in condizioni di riposo in completo RPMI 1640 medium a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 2 giorni. </li></ol> Giorno 4 <ol start="4"><li> Rimuovere le cellule dalla piastra delicatamente pipettando e trasferire le cellule a una nuova provetta da 15 ml. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C, risospendere a 5 x 10 5 cellule / ml in RPMI completo 1640 medium contenente ricombinante IL-7 murina (5 ng / ml), e la piastra 10 5 cellule / pozzetto in una piatta fondo 96 pozzetti per 4 giorni a 37 ° C in un incubatore CO 2. </li></ol> Giorno 8 <ol start="5"><li> Raccogliere le cellule in una nuova provetta, centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere a 5 x 10 5 cellule / ml in RPMI completo 1640 medium contenente solubile anti-CD28 (5 mg / ml). </li><li> Cappotto una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto con purificata anti-CD3ε (3 mg / ml) per bene e lavare come in 3.1. Piatto 10 5 cellule / pozzetto in piastre anti-CD3ε rivestiti e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 fino al giorno 11. </li></ol> Giorno 11-18 <ol start="7"><li> Ripetere i passaggi 3,4-3,6. </li></ol> Giorno 19-20 <ol start="8"><li> Trasferire le cellule ad un nuovo tubo 15 ml, centrifugare a 300 xg e risospendere a 5 x 10 5 cellule / ml in RPMI 1640 medium completo. </li><li> Cellule piastra a 10 5 cellule / pozzetto in una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto e permettere alle cellule di riposare per 2 giorni a 37 ° C in un incubatore CO 2 prima dell&#39;uso in un esperimento. </li></ol> 4. citochine da parte delle cellule iNKT mouse usando una CD1d Plate-bound Assay <ol><li> Cappotto una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto con 100 ml di murino ricombinante CD1d (10 mg / ml in PBS 1x) per pozzetto e incubare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Lavare quattro volte con 200 microlitri di PBS 1x, aggiungere 200 ml di 2% FCS in PBS 1x (soluzione bloccante) per pozzetto ed incubare per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione di saturazione, aggiungere 200 ml di αGalCer (5 ng / mL) per ogni bene, e incubare la piastra a 37 ° C per 16 ore. [Per la preparazione della soluzione αGalCer, aggiungere 1.085 μ 1x PBS a 55 mg di αGalCer sciolto in mezzo contenente 96 mg / ml di saccarosio, 10 mg / ml di sodio desossicolato e 5 mg / ml di Tween 20]. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, scartare la soluzione αGalCer e lavare il ben due volte con 200 microlitri PBS 1x seguito da 200 ml completo RPMI 1640 medie. </li><li> Raccogliere le cellule iNKT espanse in vitro a giorno 21, centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere in completa RPMI 1640 ad una concentrazione di 0,5 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 200 ml di risospensione delle cellule iNKT per pozzetto e incubare per 72 ore a 37 ° C in un incubatore CO 2. </li><li> Raccogliere il surnatante e misura citochine di interesse da parte di immunoassorbimento enzyme-linked assay (ELISA) secondo il protocollo del produttore. </li></ol>

<ol><li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells%3A+development%2C+specificity%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li>
<li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immuno%22%5BJournal%5D)">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+glycosphingolipid+recognition+by+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells.</a> Science. 306, 1786-1789 (2004).</li>
<li>Cardell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1-restricted+CD4%2B+T+cells+in+major+histocompatibility+complex+class+II-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice.</a> J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).</li>
<li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d-restricted+and+TCR-mediated+activation+of+valpha14+NKT+cells+by+glycosylceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides.</a> Science. 278, 1626-1629 (1997).</li>
<li>Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+in+rheumatic+disease%3A+a+joint+dilemma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).</li>
<li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+cells+in+immunoregulation+of+tumor+immunity%3A+a+new+immunoregulatory+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis.</a> Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).</li>
<li>Molling, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li>
<li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li>
<li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li>
<li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection%2C+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li>
<li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li>
<li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+%27real+time%27%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li>
<li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi concorrenti da rivelare.

Passaggi critici nel protocollo corrente comprendono l&#39;isolamento e successivo arricchimento di linfociti CD5 + (Sezione 1 e 2), FACS ordinamento (sezione 3) e il fasciame iniziale di cellule iNKT (sezione 4). Dei provvedimenti nella Sezione 1, ricordarsi di strato con attenzione la sospensione cellulare milza nel medio gradiente di densità tale che un interfasica cellulare distinta viene generato dopo la centrifugazione. La successiva arricchimento per CD5 + linfociti di separazione cellulare ...

Murino invarianti natural killer T (iNKT), le cellule sono una popolazione distinta di linfociti T innate selezionati nel timo by-CD1d esprimendo timociti corticali 1,2. iNKT cellule esprimono un recettore delle cellule T (TCR) costituito da una catena invariante Vα14-Jα18 TCR accoppiato con entrambi Vβ8, Vβ7 o Vβ2 TCR 3, che è in grado di riconoscere endogena così come antigeni estranei lipidi nel contesto CD1d. Per esempio, le cellule murine iNKT riconoscono e sono attivati ​​da un antigene chiamato isoglobotrihexosylceramide lipidica endogena (iGb3) 4, nonché α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, un glicolipide isolato da spugne marine. TCR-dipendente attivazione delle cellule iNKT promuove il priming delle risposte immunitarie adattative, e come risultato, le cellule iNKT hanno dimostrato di essere funzionalmente coinvolti nel miglioramento o lo sviluppo di una serie di patologie comprese malattia reumatica 7 e cancro &lt;sup&gt; 8. Attualmente, ligandi di cellule iNKT sintetiche costituiscono promettenti nuovi coadiuvanti che possono essere in grado di regolare una serie di condizioni immunopatologiche. È stato precedentemente dimostrato che le cellule iNKT possono essere generati in vitro dopo isolamento dal tessuto del mouse tuttavia; molti di questi studi impiegano l&#39;uso di cellule primarie presentanti l&#39;antigene (APC) e / o linee cellulari 9, Vα14 TCR transgenici (Tg) topi 10, timomi o per la generazione di cellule derivate iNKT ibridomi 11,12. Inoltre, un gran numero di topi, elevati volumi di reagenti, quali dimeri CD1d αGalCer-caricati, e tempi lunghi di cultura fanno alcuni protocolli pubblicati meno eticamente ed economicamente accattivante 9,13. In questo rapporto si descrive un metodo adatto per l&#39;isolamento e l&#39;espansione delle cellule iNKT vitro da topo milza. Più specificamente, il protocollo descrive un metodoper arricchire le cellule iNKT da milza del mouse che riduce i topi, i reagenti e il tempo richiesto per l&#39;ordinamento delle cellule FACS, e propone un approccio ottimizzato per espandere le cellule iNKT milza ordinati in vitro.

<table><tbody><tr><td>Materiale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ricombinante murino IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>ricombinante murino IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>ricombinante murino IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>purificato anti-topo CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>purificato anti-topo CD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450-coniugato anti-topo CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-coniugato anti-topo CD8&alfa; (53-6,7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD5 anti-topo coniugato FITC (53-7.3)</td><td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>CD3 anti-topo coniugato V500&epsilon; (500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>microsfere anti-topo CD5 (Ly-1)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>purificato anti-topo CD16/32 (2.4G2)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Colonne</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0,4% (wt/vol)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca2+/Mg2+ - free]</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>sierica bovinaSigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti F-bottom</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tubo</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>tubo falco da 50 ml</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m filtro</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 &micro; m filter</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MiniMACS</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Colonne MS</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a CO2 con camicia d'acqua</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>VWR</td> Kit di dissezione VWR <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Bioscienze</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo ottimizzato per l&#39;isolamento ed espansione invariante natural killer cellule t da spleen mouse

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

La capacità di secernere rapidamente citochine dopo stimolazione è una caratteristica funzionale del invariante natural killer T (iNKT) linea cellulare. iNKT cellule sono quindi caratterizzati da una popolazione di cellule T innata capace di attivare e sterzo adattivo risposte immunitarie. Lo sviluppo di tecniche migliorate per la coltura e l&#39;espansione di cellule murine iNKT facilita lo studio della biologia cellulare iNKT in vitro ed in sistemi modello in vivo. Qui si descrive un procedimento ottimizzato per l&#39;isolamento e l&#39;espansione di cellule spleniche iNKT murine. Milza di topi C57BL / 6 vengono rimossi, sezionati e tese e la sospensione cellulare risultante è stratificato su supporti gradiente di densità. Dopo la centrifugazione, le cellule mononucleate spleniche (MNC) sono raccolti e CD5 positivi (CD5 +) linfociti sono arricchiti per l&#39;utilizzo di sfere magnetiche. cellule iNKT all&#39;interno della frazione CD5 + sono successivamente colorate con ^5; GalCer-caricato CD1d tetramero e purificata mediante la fluorescenza delle cellule attivate (FACS). FACS ordinati cellule iNKT sono quindi inizialmente coltivate in vitro utilizzando una combinazione di citochine ricombinanti murine e recettore delle cellule T piastriforme bound (TCR) stimoli prima di essere espanso in presenza di IL-7 murina ricombinante. Utilizzando questa tecnica, di circa 10 8 cellule iNKT possono essere generati entro 18-20 giorni di coltura, dopo di che possono essere utilizzate per saggi funzionali in vitro o in vivo per esperimenti di trasferimento nei topi.

L&#39;isolamento delle cellule mononucleari spleniche mediante gradiente di densità richiede circa 1 ora ed elimina l&#39;uso di reagenti necessari per la lisi dei globuli rossi (RBC). Un alto rendimento di cellule vitali è ottenuto utilizzando questo metodo e detriti generati durante sforzare dell&#39;organo viene rimosso. Tipicamente, la frequenza di cellule iNKT nel pool di linfociti splenici compresa tra 1 e 5% del totale di linfociti T tuttavia, questo può variare a seconda dello stato età, il sesso e la salute deg...

Qui presentiamo un protocollo adattato che può essere utilizzato per generare un gran numero di cellule T natural killer invarianti murine dalla milza di topo. Il protocollo delinea un approccio attraverso il quale le cellule spleniche iNKT possono essere arricchite, isolate ed espanse in vitro utilizzando un numero limitato di animali e reagenti.

Un metodo ottimizzato per l&#39;isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

L'obiettivo generale di questa procedura è espandere le cellule T natural killer in variante, o cellule INKT, ottenute dalla milza del topo. Ciò viene realizzato isolando innanzitutto le cellule mononucleate spleniche, seguito dall'arricchimento della popolazione linfocitaria positiva per CD5 mediante separazione cellulare magnetica. La frazione di cellule INKT spleniche viene quindi ulteriormente isolata mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza.Nell'ultima fase, le cellule INKT ordinate vengono seminate per l'espansione in vitro. In definitiva, il profilo citochinico delle cellule INKT espanse può essere valutato mediante Eliza. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo avranno difficoltà poiché la purificazione e l'espansione delle cellule INKT richiedono la combinazione di diverse tecniche da eseguire.Questa procedura verrà eseguita da uno studente laureando del mio laboratorio. Dopo aver prelevato la milza, trasferire il tessuto in un filtro in nylon da 70 micron, quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa da due millilitri per schiacciare delicatamente la milza attraverso il filtro in un tubo conico da 50 millilitri e lavare il filtro con cinque millilitri di PBS. Successivamente, aggiungere tre millilitri del coal pack in un tubo da 15 millilitri e sovrapporre al gradiente di densità i cinque millilitri di sospensione cellulare.Separare le cellule mediante centrifugazione e trasferire l'interfaccia in un nuovo tubo da 15 millilitri. Quindi lavare le cellule con 10 millilitri di PBS freddo e risospendere il pellet in due millilitri di buffer fax per arricchire i linfociti splenici positivi per CD5. Regolare il diluimento cellulare a 1 × 10⁷ cellule per 90 microlitri aggiungendo altro buffer fax e aggiungere 10 microlitri di microperle anti-CD5 alle cellule.Dopo 15 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le cellule con quattro millilitri di buffer fax e risospendere il pellet in 500 microlitri di buffer fax fresco. Isolare le cellule CD5 positive mediante separazione cellulare magnetica secondo le raccomandazioni del produttore. Successivamente, diluire i linfociti CD5 positivi arricchiti a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule per 20 microlitri di buffer inax contenente anti-CD16, CD32 e il tetramero PE-coniugato α-GalCer CD1d, a temperatura ambiente e al buio. Dopo 30 minuti, incubare le cellule con gli anticorpi di interesse a quattro gradi Celsius, al buio, per altri 30 minuti.Quindi lavare le cellule in un nuovo tampone fax e colorarle con 10 microlitri di una soluzione lavorativa di 20 micromolare di DPI per un milione di cellule per cinque minuti. A temperatura ambiente, acquisire ora circa diecimila eventi di linfociti arricchiti positivi per CD5 mediante citometria a flusso, effettuando un gating elettronico in base allo scatter anteriore con bassa intensità per escludere i doppietti e gli aggregati cellulari. Eliminare elettronicamente le cellule positive per DAPI, positive per CD8 e positive per CD19 all'interno della popolazione con basso scatter anteriore, utilizzando grafici di area dello scatter laterale e dello scatter anteriore.Per selezionare elettronicamente i linfociti, tracciare i tetrameri alfa-gal SER CD1D rispetto a CD3 epsilon ed estrarre elettronicamente le cellule iNKT positive ai tetrameri alfa-gal SER CD1D e positive a CD3 epsilon come indicato. Successivamente, acquisendo non più di due volte 10 alla quinta linfociti arricchiti CD5 positivi, determinare la percentuale di cellule iNKT positive ai tetrameri alfa-gal SER CD1D e positive a CD3 epsilon presenti nella frazione cellulare arricchita. Utilizzando questa finestra di selezione bassa, ordinare le cellule iNKT positive ai tetrameri alfa-gal SER CD1D e positive a CD3 epsilon in un tubo FACS contenente un millilitro di siero fetale bovino alla fine dell'ordinamento.Risciacquare le cellule NKT isolate dalla parete del tubo FACS con 10 millilitri di mezzo RPMI 1640. Quindi centrifugare le cellule, risospendere il pellet in un millilitro di RPMI 1640 e utilizzare un'aliquota di 40 microlitri delle cellule per valutare la purezza delle cellule ordinate. Utilizzando la stessa strategia di gating.Per quanto riguarda l'impostazione dei parametri di coltura per l'espansione delle cellule INKT, centrifugare le cellule e risospendere le cellule isolate a una concentrazione di cinque volte 10 alla quinta cellule per millilitro in mezzo RPMI 1640 completo integrato con IL-2, IL-12 e anti-CD28. Quindi seminare le cellule a una densità di una volta 10 alla quinta cellule INKT per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto rivestita con anti-CD3 epsilon e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari. Dopo due giorni, trasferire le cellule in una nuova piastra da 96 pozzetti a fondo piatto non rivestita per la coltura in condizioni di riposo in RPMI 1640 completo.Mezzo per un'ulteriore incubazione di due giorni. Al quarto giorno dopo il sorting, pipettare delicatamente il soprannatante in ciascuna pozzetta per staccare le cellule e raccoglierle in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet a una concentrazione di cinque volte 10 alla quinta cellule per millilitro.In RPMI 1640 completo integrato con IL-7, seminare 1 × 10⁵ cellule per pozzetto in una nuova piastra da 96 pozzetti a fondo piatto. Dopo quattro giorni, trasferire le cellule in un tubo conico da 15 mL per la centrifugazione. Ri-sospendere il pellet in mezzo RPMI 1640 completo contenente anti-CD28 solubile e seminare le cellule in una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto rivestita con anti-CD3ε, a 1 × 10⁵ cellule per pozzetto, quindi reinserire le cellule nell'incubatore per altri tre-quattro giorni, dal giorno 11 al giorno 18.Ripetere il trattamento con IL-7, anti-CD28 e anti-CD3 epsilon come appena mostrato al giorno 19. Trasferire le cellule in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare e risospendere il pellet a 5 × 10⁵ cellule per millilitro in mezzo RPMI 1640 completo.Quindi seminare le cellule a una concentrazione di 1 × 10⁵ cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto e lasciare riposare le cellule per due giorni nell'incubatore per colture cellulari. La stimolazione delle cellule INKT ordinate mediante anti-CD3 epsilon legato alla piastra, in presenza di IL-2, IL-12 e anti-CD28 solubile, determina un'espansione di circa tre volte il numero di cellule INKT dopo due giorni di coltura. L'ulteriore espansione delle cellule INKT in presenza di IL-7 porta a un incremento di tre-quattro volte il numero di cellule INKT presenti al quarto giorno di coltura.È degno di nota che ripetendo queste condizioni di coltura è possibile ottenere una media di sette volte 10 alla settima cellule INKT dopo due cicli di espansione, senza alcuna perdita visibile di cellule tra i cambiamenti del mezzo di coltura effettuati in giorni diversi, ottenendo così un'espansione di almeno 70 volte in 18 giorni. Le cellule INKT ulteriormente espanse, attivate con CD1D murino ricombinante immobilizzato su piastra e caricato con alfa-alser, producono IL-2, IL-4, IFN-gamma, TNF-alfa e IL-6 a 48 ore dallo stimolo, dimostrando che le cellule INKT conservano la loro capacità di produrre citochine di tipo TH1 e TH2 dopo l'espansione.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la corretta colorazione delle cellule INKT con cdre carico di alfa-ceramide è essenziale per identificare le cellule INKT durante la citometria a flusso.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video descrive l'arricchimento delle cellule T dalla milza di un topo mediante selezione negativa utilizzando un separatore magnetico. La tecnica prevede di indirizzare le altre cellule del campione per la deplezione utilizzando anticorpi o ligandi diretti contro specifici antigeni della superficie cellulare.

Arricchimento delle cellule T: una tecnica per isolare le cellule T da una popolazione di cellule miste mediante separazione magnetica

Questo video dimostra l'isolamento dei linfociti, comprese le cellule natural killer o cellule NK, dal tessuto epatico umano per un'espansione selettiva. La digestione enzimatica e meccanica, seguita dalla separazione in gradiente di densità, favorisce l'isolamento dei linfociti, comprese le cellule NK. I linfociti raccolti possono essere ulteriormente utilizzati per l'espansione selettiva delle cellule NK.

Isolamento di cellule Natural Killer dal tessuto epatico per l'espansione selettiva

Questo video descrive un protocollo per isolare le cellule T CD8+ specifiche per l'antigene raro utilizzando cellule artificiali presentanti l'antigene (aAPC) basate su nanoparticelle magnetiche funzionalizzate con MHC-Ig caricate con peptidi antigenici e anticorpi anti-CD28. L'interazione delle aAPC con le cellule T CD8+ che esprimono specificamente i recettori delle cellule T antigeniche bersaglio per i peptidi, seguita dalla loro espansione in vitro, provoca l'arricchimento e l'espansione di...

Arricchimento ed espansione basati su nanoparticelle di cellule T CD8+ antigene-specifiche

Questo video dimostra l'induzione della malattia intestinale del trapianto contro l'ospite, GvHD, in un topo ricevente irradiato letalmente utilizzando cellule staminali ematopoietiche allogeniche e linfociti T alloreattivi splenici che inducono GvHD. Questo protocollo aiuta a stabilire un modello di GvHD intestinale acuta grave per comprendere il meccanismo della malattia e sviluppare opzioni terapeutiche innovative.

Induzione della malattia del trapianto contro l'ospite in modelli murini tramite trapianto allogenico di midollo osseo e cellule spleniche

Questo video illustra un metodo per isolare le cellule T natural killer invarianti, note anche come cellule iNKT. La procedura inizia con l'iniezione di un glicolipide sintetico in un topo per stimolare l'attivazione e la proliferazione delle cellule iNKT nella milza. Successivamente, le sospensioni di singole cellule vengono preparate dalla milza e incubate con complessi di riconoscimento delle cellule iNKT marcati con fluorofori, seguite da una separazione basata su biglie magnetiche, per...

Isolamento di cellule T Natural Killer invarianti da un modello murino

Le cellule T CD4+ ingenue si polarizzano in vari sottoinsiemi a seconda dell'ambiente al momento dell'attivazione.  La differenziazione delle cellule T CD4+ naive in vari sottogruppi di effettori può essere ottenuta in vitro attraverso l'aggiunta di stimoli recettoriali delle cellule T e segnali specifici delle citochine.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Esistono sottogruppi distinti di cellule dendritiche come popolazioni rare negli organi linfoidi, e quindi sono difficili da isolare in numero e purezza sufficienti per esperimenti immunologici. Qui descriviamo un metodo ad alta efficienza e ad alta resa per l'isolamento di tutti i principali sottogruppi attualmente noti di cellule dendritiche spleniche di topo.

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Qui, presentiamo un protocollo che descrive il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche e consente valutazioni ripetitivi mini-endoscopica del colon distale in situ per la presenza, caratteristiche e la severità di infiammazione colica all'interno dal vivo topi affetti da malattia intestinale graft - versus - host.

Induzione di intestinale Graft - versus - host Disease e sua valutazione endoscopica Mini in topi dal vivo

Descriviamo un protocollo rapido e robusto per arricchire le cellule T natural killer invarianti (iNKT) dalla milza di topo ed espanderle in vitro a numeri adatti per studi in vitro e in vivo.

Purificazione ed espansione di cellule T Natural Killer invarianti di topo per studi in vitro e in vivo

Qui, presentiamo un metodo per espandere il natural killer del sangue periferico (PBNK), le cellule NK dai tessuti epatici e le cellule del recettore dell'antigene chimerico (CAR)-NK derivate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o sangue del cordone ombelicale (CB). Questo protocollo dimostra l'espansione delle celle NK e CAR-NK utilizzando celle di alimentazione 221-mIL-21 oltre alla purezza ottimizzata delle celle NK espanse.

Metodo di espansione cellulare Natural Killer (NK) e CAR-NK utilizzando la linea cellulare B modificata Membrane Bound-IL-21-Modified

Scopri un metodo ottimizzato per isolare ed espandere cellule iNKT dalla milza di topo. Questo protocollo utilizza separazione magnetica e FACS per ottenere un alto rendimento con risorse minime.

Un metodo ottimizzato per l'isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse

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