Un metodo ottimizzato per l'isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di espandere in varianti le cellule T o INKT natural killer raccolte dalla milza del topo. Ciò si ottiene isolando prima le cellule mononucleate spleniche, seguite dall'arricchimento della popolazione di linfociti CD cinque positivi mediante separazione cellulare magnetica. La frazione di cellule spleniche INKT viene quindi ulteriormente isolata mediante smistamento cellulare attivato da fluorescenza.

Nella fase finale, le celle INKT selezionate vengono posizionate per l'espansione in vitro. In definitiva, il profilo delle citochine delle cellule INKT espanse può essere valutato da Eliza. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà poiché la purificazione e l'espansione delle cellule INKT richiede la combinazione di diverse tecniche di esecuzione.

Questa procedura sarà shrogen uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo aver raccolto la milza, trasferire il tessuto in un filtro di nylon da 70 micron, quindi utilizzare uno stantuffo da siringa da due millilitri per schiacciare delicatamente la milza attraverso il colino in un tubo conico da 50 millilitri e lavare il filtro con cinque millilitri di PBS. Quindi aggiungere tre millilitri di pacco di carbone in un tubo da 15 millilitri e sovrapporre il gradiente di densità con i cinque millilitri di sospensione cellulare.

Separare le celle mediante centrifugazione e trasferire l'interfaccia in una nuova provetta da 15 millilitri. Quindi lavare le cellule in 10 millilitri di PBS freddo e risospendere il pellet in due millilitri di tampone fax per arricchire per la CD cinque linfociti splenici positivi. Regolare la diluizione cellulare a una volta da 10 a settima cellula per 90 microlitri con più tampone fax e aggiungere 10 microlitri di cinque microsfere anti CD alle cellule.

Dopo 15 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le celle con quattro millilitri di tampone fax e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone fax fresco. Isolare le cinque celle positive del CD mediante separazione magnetica delle celle secondo le raccomandazioni del produttore. Quindi diluire il CD arricchito cinque linfociti positivi in una volta 10 per le sei cellule per 20 microlitri di tampone inax contenente anti CD 16, CD 32 e PE coniugato alfa gal aria CD 1D tetramero a temperatura ambiente al buio dopo 30 minuti, incubare le cellule con gli anticorpi di interesse a quattro gradi Celsius al buio per altri 30 minuti.

Quindi lavare le cellule in un tampone fax fresco e colorarle con 10 microlitri di una soluzione di lavoro a 20 micromolari di DPI per una volta 10 per le sei celle per cinque minuti. A temperatura ambiente ora acquisisci circa una volta 10 al quarto CD arricchito cinque eventi linfocitari positivi sul citometro a flusso che gating elettronicamente sulla dispersione diretta con cellule basse per escludere elettronicamente i doppietti cellulari e gli aggregati. Gate out del DAPI CD positivo, otto celle positive CD 19 positive all'interno della dispersione diretta con bassa popolazione e utilizzare grafici di dispersione laterale e area di dispersione diretta.

Per selezionare elettronicamente i linfociti, tracciare i tetrameri alfa gal SER CD 1D per CD tre epsilon e elettronicamente ga l'alfa gal ser CD 1D tetramero positivo CD tre cellule INKT epsilon positive come indicato. Quindi, acquisendo non più di due volte 10 al quinto CD, cinque linfociti arricchiti positivi determinano la percentuale di alfa gal SER CD, 1D tetramero CD, tre cellule INKT epsilon positive presenti nella frazione cellulare arricchita. Utilizzando questo tipo basso di cancello, l'alfa alser CD 1D tetramero positivo CD tre cellule INKT epsilon positive in un tubo fax contenente un millilitro di siero fetale di vitello alla fine del tipo.

Sciacquare le cellule NKT isolate dal lato del tubo fax con 10 millilitri di terreno RPMI 1640. Quindi centrifugare le cellule, risospendere il pellet in un millilitro di RPMI 1640 e utilizzare un'aliquota di 40 microlitri delle celle per valutare la purezza delle celle selezionate. Utilizzando la stessa strategia di gating.

Per quanto riguarda l'impostazione dei parametri di ordinamento per espandere le celle INKT, far girare le cellule e risospendere le cellule isolate a cinque volte da 10 a 5 cellule per millilitro in terreno RPMI 1640 completo integrato con IL due IL 12 e anti CD 28. Quindi seminare le cellule in una sola volta, da 10 a 5 cellule INKT per pozzetto, in una piastra rivestita anti-CD a fondo piatto da 96 pozzetti, con tre epsilon e incubarle a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari. Dopo due giorni, trasferire le cellule in una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto fresca non rivestita per la coltura in condizioni di riposo in RPMI 1640 completo.

Medio per un'altra incubazione di due giorni. Il quarto giorno dopo la cernita, pipettare delicatamente il surnatante in ogni pozzetto per rimuovere le cellule e raccoglierle in una provetta conica da 15 millilitri. Dopo la centrifugazione, risospendere il palato a cinque volte da 10 a una quinta cellula per millilitro.

In RPMI 16 completo terreno integrato con IL sette e seme una volta 10 alla quinta cellula per pozzetto. In una nuova piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, rimettere le cellule nell'incubatore dopo quattro giorni, immergerle in una nuova provetta conica da 15 millilitri per la centrifugazione. Risospendere il pellet in un mezzo RPMI 1640 completo contenente anti CD 28 solubile e seminare le cellule su una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti rivestita con anti CD tre epsilon in una volta 10 delle quinte cellule per pozzetto e riportare le cellule all'incubatore per altri tre giorni, quattro giorni, da 11 a 18.

Ripetere il trattamento IL seven anti CD 28 e anti CD 3 epsilon come appena dimostrato il giorno 19. Trasferire le cellule in una nuova provetta conica da 15 millilitri. Girarli verso il basso e risospendere il pellet a cinque volte da 10 alla quinta cella per millilitro in RPMI 1640.Medium completo.

Quindi seminare le cellule una volta da 10 a 5 cellule per pozzetto in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti e lasciare riposare le cellule per due giorni nell'incubatore per colture cellulari. La stimolazione di cellule INKT selezionate con anti CD legato su piastra, tre epsilon in presenza di IL, due IL 12 e anti CD 28 solubile determina un'espansione di circa tre volte del numero di INKT dopo due giorni di coltura. La successiva espansione delle cellule INKT in presenza di IL sette si traduce in un aumento da tre a quattro volte del numero di cellule INKT presenti al quarto giorno in coltura.

In particolare, la ripetizione di queste condizioni di coltura può produrre in media da sette volte 10 alla settima cellula INKT dopo due cicli di espansione senza alcuna perdita visibile di cellule tra i cambiamenti nei terreni di coltura in giorni diversi, con conseguente espansione di almeno 70 volte in 18 giorni. Cellule INKT ulteriormente espanse attivate con murina ricombinante legata a piastre. Il CD 1D caricato con alfa alser produce IL due IL quattro IFN gamma, TNF alfa e IL sei a 48 ore dopo la stimolazione, dimostrando che le cellule INKT mantengono la loro capacità di produrre TH uno e TH due citochine dopo l'espansione.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la corretta colorazione delle cellule INKT con cdre caricato con alfa ceramide è essenziale per identificare le cellule INKT durante la citometria a flusso. Certo.