Espansione ex vivo di cellule natural killer da cellule mononucleate del sangue periferico

Le cellule natural killer, NK, sono grandi linfociti granulari che eliminano i tumori e le infezioni microbiche.

Per l'espansione ex vivo delle cellule NK, assumere una sospensione di cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC, contenenti una popolazione eterogenea di linfociti, comprese le cellule NK. Aggiungere cellule feeder irradiate – cellule linfoblastoidi non proliferanti – che esprimono l'interleuchina 21 legata alla membrana, mIL-21, necessaria per attivare ed espandere le cellule NK.

Aggiungere la co-coltura in un pozzetto di coltura specializzato con una membrana permeabile ai gas sul fondo, che consente lo scambio di gas. Le cellule si depositano e proliferano per un periodo prolungato senza richiedere il passaggio.

Aggiungere l'interleuchina 2, IL-2 e l'interleuchina 15, IL-15, citochine per la proliferazione delle cellule NK. Incubare per un periodo adeguato in condizioni fisiologiche.

mIL-21 sulle cellule feeder si lega a uno specifico recettore eterodimerico sulle cellule NK. IL-15 e IL-2 esogene si legano ai rispettivi recettori. Il legame induce diverse vie di segnalazione a valle, attivando l'espressione genica, limitando la senescenza cellulare e portando a una proliferazione prolungata delle cellule NK.

Utilizzando la citometria a flusso, valutare l'espansione delle cellule NK a intervalli di tempo regolari.

Tracciare i dati registrati per analizzare il tasso di espansione delle cellule e la loro purezza: crescita selettiva del tipo di cellula NK bersaglio. L'espansione del collettore durante il periodo di incubazione indica una proliferazione sostenuta pur mantenendo un'elevata purezza.

Lavare separatamente le cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, e 100 cellule 221-mIL-21 irradiate con raggi gamma mediante centrifugazione a 400 g per 5 minuti con 10 millilitri di terreno R-10.

Dopo la centrifugazione, conservare 1 x 10⁶ PBMC per la citometria a flusso e miscelare 5 x 10⁶ PBMC con 10 x 10⁶ 100 cellule 221-mIL-21 irradiate con raggi gamma in una speciale piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 30 millilitri di terreno di R-10 integrato con interleuchina-2 umana e interleuchina-15 umana alla stessa piastra a 6 pozzetti e incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica sostituendo il terreno ogni tre o quattro giorni.

Durante l'incubazione, registrare il numero totale di cellule natural killer o PBNK nel sangue periferico, la vitalità ed eseguire la citometria a flusso ogni tre o quattro giorni per calcolare il tasso di espansione delle cellule NK.