Name: Purificazione ed espansione di cellule T Natural Killer invarianti di topo per studi in vitro e in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Impara a purificare ed espandere cellule iNKT di topo con un incremento di 30 volte in due settimane. Questo metodo immunologico consente studi in vitro e in vivo su risposte immunitarie.

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Ringraziamo Paolo Dellabona e Giulia Casorati per il supporto scientifico e la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche il NIH Tetramer Core Facility per il tetramero CD1d del topo. Lo studio è stato finanziato dalla Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (a M.F.) e dalla borsa di studio 2019-22604 dell'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) (a G.D.).

Le procedure qui descritte sono state esaminate e approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) (n. 1048) dell'Istituto Scientifico San Raffaele.
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili. Tutti i reagenti utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Lavorazione della milza
<ol><li>Eutanasia dei topi iVα14-Jα18 per inalazione di CO2 secondo la politica istituzionale. NOTA: i topi iVα14-Jα18 devono avere almeno 8 settimane. Per evitare il rigetto delle cellule dal trasferimento in vivo delle cellule, si consideri che le cellule isolate da topi femmina possono essere trasferite adottivamente sia in riceventi maschi che femmine, mentre le cellule isolate da topi maschi possono essere trasferite solo in riceventi maschi. Per gli esperimenti in vitro, non deve essere considerato alcun pregiudizio di genere. Più topi possono essere raggruppati per ottenere più cellule.</li>
	<li>Sezionare la milza di topo e romperla attraverso un colino cellulare da 70 nm per ottenere una sospensione unicellulare in 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con il 2% di siero bovino fetale (FBS).</li>
	<li>Centrifuga a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante per inversione ed elaborare con tampone di lisi degli eritrociti. Risospesere il pellet cellulare con 1 mL di tampone di lisatura sterile ACK (Ammonio-Cloruro-Potassio), incubare per 3 minuti a temperatura ambiente e bloccare con 5 ml di PBS con il 2% di FBS. Centrifuga a 300 x g per 5 min. NOTA: ACK è disponibile in commercio; è costituito da una soluzione di 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3e 0,1 mM Na2EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) disciolto in H2O bidillato, pH 7,2-7,4. Se fatto in casa, sterilizzare per filtrazione con un filtro da 0,22 μm.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante per inversione. Risospesciare il pellet cellulare in 3 ml di PBS con il 2% di FBS e rimuovere i residui di grasso mediante pipettaggio. Se necessario, raggruppare le cellule provenienti da topi diversi.</li>
	<li>Contare le cellule e mantenere 50 μL per l'analisi FACS.</li>
</ol>2. Arricchimento delle cellule T
NOTA: Per le fasi di arricchimento, lavorare velocemente, mantenere le celle fredde e utilizzare soluzioni pre-raffreddate a 4 °C durante la notte e poi mantenute sul ghiaccio
<ol><li>Centrifuga a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Risospendare tutte le celle nella quantità appropriata di PBS con 2% FBS (500 μL per 107 celle) e bloccante Fc (2,5 μL x 107 celle); incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lavare con 1-2 mL di tampone di separazione MACS (MB) per10 7 celle totali e centrifugare a 300 x g per 10 min. NOTA: il buffer MACS è disponibile in commercio. È costituito da PBS pH 7,2, 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM EDTA. Se fatto in casa, sterilizzare per filtrazione con un filtro da 0,22 μm.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante per inversione e macchiare le cellule con CD19-FITC e H2(IA b)-FITC (utilizzare 5 μL x 107 celle in 100 μL di MB). Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a 4-8 °C.</li>
	<li>Lavare le celle aggiungendo 1−2 mL di MB per 107 celle e centrifugare a 300 x g per 10 min.</li>
	<li>Pipettare completamente il surnatante e risospescere il pellet cellulare in 90 μL di MB per 107 celle totali. Aggiungere 10 μL di MicroBeads Anti-FITC per 107 celle totali. Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a 4-8 °C.</li>
	<li>Lavare le celle aggiungendo 1−2 mL di MB per 107 celle e centrifugare a 300 x g per 10 min.</li>
	<li>Pipettare completamente il surnatante e risospendere fino a 1,25 x 108 celle in 500 μL di MB.</li>
	<li>Posizionare una colonna LD nel campo magnetico del separatore MACS per procedere all'esaurimento. Per evitare intasamenti, applicare un filtro di pre-separazione sulla colonna LD e risciacquare con 2 ml di MB.</li>
	<li>Quando il serbatoio della colonna è vuoto, applicare la sospensione della cella sul filtro. Raccogliere le celle senza etichetta che passano attraverso la colonna.</li>
	<li>Lavare 3 volte con 1 ml di MB, solo quando il serbatoio della colonna è vuoto. Raccogliere l'effluente totale, che sarà arricchito in cellule T, e contare le cellule. Mantenere sempre 50 μL per l'analisi FACS.</li>
</ol>3. Arricchimento cellulare iNKT
<ol><li>Centrifugare a 300 x g per 5 min e rimuovere il surnatante per inversione.</li>
	<li>Colorare le cellule con CD1d-tetramer-PE (topo PBS57-CD1d-tetramero), secondo la titolazione anticorpale in 50 μL di MB per 106 cellule. Mescolare bene e incubare per 30 minuti al buio sul ghiaccio. NOTA: La procedura può essere eseguita anche con tetrameri mCD1d marcati APC e perline anti-APC; regolare di conseguenza i fluorocromi utilizzati nella successiva colorazione. Nel presente protocollo abbiamo utilizzato mouse PBS-57-CD1d-tetrameri forniti da NIH. αgalactosylceramide (αGal-Cer) è l'antigene prototipico riconosciuto dalle cellule iNKT; PBS-57 è un analogo di αGal-Cer con solubilità migliorata9; il NIH Tetramer Facility fornisce il ligando PBS-57 complessato ai tetrameri CD1d. Tuttavia, altri dimeri / tetrameri / dextramer CD1d sono disponibili in commercio e possono essere caricati con un antigene lipidico come αGal-Cer. Prevediamo la possibilità di adeguare il protocollo per il loro utilizzo.</li>
	<li>Lavare le celle aggiungendo 1−2 mL di MB per 107 celle e centrifugare a 300 x g per 10 min.</li>
	<li>Pipettare completamente il surnatante e risospescere il pellet cellulare in 80 μL di MB per 107 celle totali. Aggiungere 20 μL di MicroBeads Anti-PE per 107 cellule totali. Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a 4-8 °C.</li>
	<li>Lavare le celle aggiungendo 1−2 mL di MB per 107 celle e centrifugare a 300 x g per 10 min.</li>
	<li>Pipettare completamente il surnatante e risospendere fino a 108 celle in 500 μL di MB. In caso contrario, se le celle superano10 8, regolare il volume di conseguenza.</li>
	<li>In base al conteggio delle celle, posizionare una colonna LS (fino a10 8) o MS (fino a10 7) nel campo magnetico del separatore MACS. Risciacquare la colonna con MB (3 mL per LS, 500 μL per MS).</li>
	<li>Applicare la sospensione della cella sulla colonna.</li>
	<li>Raccogli le cellule senza etichetta che passano attraverso. Lavare la colonna 3 volte aggiungendo la quantità appropriata di MB (3 x 3 mL per la colonna LS, 3 x 500 μL per la colonna MS) solo quando il serbatoio della colonna è vuoto. L'effluente totale è la frazione negativa.</li>
	<li>Rimuovere la colonna dal campo magnetico e posizionarla su un nuovo tubo di raccolta.</li>
	<li>Pipetta MB sulla colonna (5 mL per la colonna LS o 1 mL per la colonna MS); spingere lo stantuffo fornito nella colonna e scovare la frazione positiva (arricchita in celle iNKT).</li>
	<li>Per aumentare ulteriormente il recupero delle cellule iNKT, centrifugare la frazione negativa a 300 x g per 10 minuti e ripetere i passaggi 3.6-3.7 con una nuova colonna LS o MS. Raggruppare le frazioni positive e determinare il conteggio delle cellule. Mantenere 50 μL di frazioni sia positive che negative per l'analisi FACS.</li>
	<li>Controllare le fasi di purificazione mediante analisi FACS. I campioni includono: milza ex-vivo, frazione arricchita di cellule T, frazione positiva iNKT e frazione negativa iNKT. Colorare le cellule con: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC e DAPI. NOTA: il recupero previsto da un mouse iVα14-Jα18 è 2x106 celle iNKT .</li>
</ol>4. Attivazione ed espansione delle celle iNKT
<ol><li>Attivare le cellule iNKT purificate con perline magnetiche anti-CD3/CD28 attivatore T del mouse in un rapporto 1:1.<ol>
<li>Centrifugare la frazione positiva della cella iNKT a 300 x g per 5 min.</li>
		<li>Nel frattempo trasferire il volume appropriato di perline magnetiche anti-CD3 / CD28 su un tubo e aggiungere un volume uguale di PBS, vortice per 5 secondi. Posizionare il tubo su un magnete per 1 minuto ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Rimuovere il tubo dal magnete e risospesciare le perle magnetiche lavate nel giusto volume di RPMI completo (RPMI 1640 medio, 10% FCS inattivato dal calore, 1 mM piruvato di sodio, 1% aminoacidi non essenziali, 10 U/ ml di penicillina e streptomicina, 50 μM β-Mercaptoetanolo) per avere 5 x 105 cellule iNKT in 1 mL. Utilizzare questa sospensione per risospendere la frazione positiva centrifugata iNKT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Piastra 1 mL della sospensione cellulare (5 x 105 celle iNKT) e perline magnetiche anti-CD3/CD28 in una piastra a 48 pozzetti con 20 U/mL IL-2 e incubare a 37 °C.</li>
	<li>Dopo 5 giorni, aggiungere 10 ng /mL IL-7.</li>
	<li>Dividere le celle 1:2 quando raggiungono l'80-90% di confluenza, aggiungere sempre 20U/mL IL-2 e 10 ng/mL IL-7. In queste condizioni, le cellule iNKT possono essere espanse fino a 15 giorni.</li>
</ol>

<ol><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+killer+T+%28NKT%29+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1%28-%29CD4%28%2B%29+CD1d-dependent+precursor+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li>
<li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li>
<li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li>
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<li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+CD40%2FFas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li>
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<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li>
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<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD62L%2B+NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li>
<li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li>
<li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-party+CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4%2BCD25%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li>
<li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li>
<li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li>
<li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735(2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma%3A+an+interim+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li>
<li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma%3A+A+Phase+I+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li>
<li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui mostriamo un protocollo riproducibile e fattibile per ottenere milioni di celle iNKT pronte all'uso. A causa della scarsità di queste cellule in vivo, era altamente necessario un metodo per espanderle. Il protocollo che proponiamo non richiede né una particolare strumentazione né un elevato numero di topi. Abbiamo sfruttato i topi transgenici iVα14-Jα18 di proposito per ridurre il numero di topi necessari per la procedura.
Un altro protocollo di successo per l'espansione cellulare iNKT da ...

Le cellule T natural killer invarianti (cellule iNKT) sono linfociti T innati che esprimono un recettore semi-invariante delle cellule T αβ (TCR), formato nei topi da una catena Vα14-Jα18 invariante accoppiata con un insieme limitato di diverse catene Vβ1, che è specifico per gli antigeni lipidici presentati dalla molecola correlata alla classe I MHC CD1d2. Le cellule iNKT subiscono un programma di selezione agonista con conseguente acquisizione di un fenotipo effettore attivato/innato già presente nel timo, che avviene attraverso diversi stadi di maturazione3,4,producendo un sottoinsieme CD4+ ecd4- sottoinsieme. Attraverso questo programma, le cellule iNKT acquisiscono fenotipi effettrici T helper (TH) distinti, vale a dire TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) e TH17 (iNKT17), identificabili dall'espressione dei fattori di trascrizione T-bet, GATA3, PLZF e RORγt, rispettivamente5. Le cellule iNKT riconoscono una serie di lipidi microbici ma sono anche autoreattive nei confronti dei lipidi endogeni che sono sovraregolati nel contesto di situazioni patologiche di stress cellulare e danno tissutale, come il cancro e l'autoimmunità2. Al momento dell'attivazione, le cellule iNKT modulano le funzioni di altre cellule effettrici immunitarie innate e adattative attraverso il contatto diretto e la produzione di citochine2.
Le indagini sulle cellule iNKT sono state facilitate da modelli murini, tra cui topi cd1d-deficienti o Jα18-carenti, e dalla produzione di tetrameri CD1d caricati con antigene più la generazione di anticorpi monoclonali (mAbs) specifici per il TCR semi-invariante umano. Tuttavia, la generazione della linea cellulare iNKT del topo primario si è dimostrata difficile. Per caratterizzare meglio le funzioni antitumorali delle cellule iNKT e utilizzarle per la terapia cellulare adottiva, abbiamo istituito un protocollo per purificare ed espandere le cellule iNKT spleniche di topi transgenici iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, in cui le cellule iNKT sono 30 volte più frequenti rispetto ai topi wild type.
Le cellule iNKT espanse possono essere sfruttate per saggi in vitro e in vivo al momento del trasferimento nei topi. In questo contesto, ad esempio, abbiamo mostrato i loro potenti effettiantitumorali 7. Inoltre, le cellule iNKT espanse in vitro sono suscettibili di modificazione funzionale tramite trasferimento genico o modifica prima della loro iniezione in vivo8, consentendo un'analisi funzionale approfondita dei percorsi molecolari, oltre a spianare la strada a terapie cellulari avanzate.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di ammonio-cloruro-potassio (ACK)</td><td>in house</td><td></td><td>0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2-7,4</td></tr><tr><td>Microsfere anti-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere anti-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD19 -FITC</td><td>Biolegend</td><td>115506</td><td>clone 6D5</td></tr><tr><td>CD1d-tetramero -PE</td><td>NIH tetramero core facility topo</td><td></td><td>PBS57-Cd1d-tetrameri</td></tr><tr><td>CD4 -PeCy7</td><td>Biolegend</td><td>100528</td><td>clone RM4-5</td></tr><tr><td>bloccante</td><td>Fc BD Bioscience</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0186L</td><td>inattivato a caldo e filtrato .22 prima dell'uso</td></tr><tr><td>FOXP3 Tampone di colorazione del fattore di trascrizione</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>H2 (IAb) -FITC</td><td>Biolegend</td><td>114406</td><td>clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>hrIL-2</td><td>Chiron Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Colonne LD</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Colonne</td><td>LS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Tampone MACS (MB)</td><td>in house</td><td></td><td>0,5% Albumina sierica bovina (BSA; Colonne Sigma-Aldrich) e 2Mm EDTA</td></tr><tr><td>MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina e streptomicina (Pen-Strep)</td><td>Lonza</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PermWash</td><td>BD Bioscience</td><td>51-2091KZ</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Tamponato con fosfato soluzione salina (PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Filtri di Pre-Separazione (30 &; micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinato IL-7</td><td>R& D System</td><td>407-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 con glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta; -APC</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td>clone H57-597</td></tr><tr><td>&alpha; CD3CD28 attivatore T per topi Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

purificazione ed espansione di cellule t natural killer invarianti di topo per studi in vitro e in vivo

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Le cellule Invariant Natural Killer T (iNKT) sono linfociti T innata che esprimono un recettore delle cellule T semi-invariante (TCR) conservato specifico per antigeni lipidici auto o microbici presentati dalla molecola non polimorfica MHC di classe I CD1d. Studi preclinici e clinici supportano un ruolo delle cellule iNKT nel cancro, nell'autoimmunità e nelle malattie infettive. Le cellule iNKT sono molto conservate in tutte le specie e la loro indagine è stata facilitata da modelli murini, tra cui topi cd1d-carenti o iNKT-carenti, e la possibilità di rilevarle inequivocabilmente in topi e uomini con tetrameri CD1d o mAbs specifici per il TCR semi-invariante. Tuttavia, le cellule iNKT sono rare e devono essere espanse per raggiungere numeri gestibili per qualsiasi studio. Poiché la generazione della linea cellulare iNKT di topo primario in vitro si è dimostrata difficile, abbiamo istituito un protocollo robusto per purificare ed espandere le cellule iNKT spleniche dai topi transgenici iVα14-Jα18 (iVα14Tg), in cui le cellule iNKT sono 30 volte più frequenti. Mostriamo qui che le cellule iNKT iVα14Tg miliniche primarie possono essere arricchite attraverso un processo di separazione immunomagnetica, producendo circa il 95-98% di cellule iNKT pure. Le cellule iNKT purificate sono stimolate da perline anti-CD3 / CD28 più IL-2 e IL-7, con conseguente espansione di 30 volte al giorno +14 della coltura con purezza dell'85-99%. Le cellule iNKT espanse possono essere facilmente manipolate geneticamente, fornendo uno strumento inestimabile per sezionare i meccanismi di attivazione e funzione in vitro e, soprattutto, anche dopo il trasferimento adottivo in vivo.

Il protocollo descritto in questo manoscritto consente di arricchire le cellule iNKT dalla milza di topi transgenici iVa14-Ja18 attraverso un processo di separazione immunomagnetica riassunto in Figura 1A. Le cellule T della milza totale vengono prima selezionate negativamente esaurendo le cellule B e i monociti, seguite dallo smistamento immunomagnetico positivo delle cellule iNKT con tetrameri CD1d caricati con antigene lipidico PBS-57, che consentono di colorare specificamente solo le cel...

Descriviamo un protocollo rapido e robusto per arricchire le cellule T natural killer invarianti (iNKT) dalla milza di topo ed espanderle in vitro a numeri adatti per studi in vitro e in vivo.

Purificazione ed espansione di cellule T Natural Killer invarianti di topo per studi in vitro e in vivo

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Questo protocollo consente la purificazione delle cellule T INK, che sono molto rare, e consente un'espansione di 30 volte nel loro numero. La purificazione può essere eseguita in un giorno e produrre un gran numero di cellule T INK pronte all'uso per studi in vivo e in vitro in due settimane. A dimostrare la procedura sarà Gloria Delfanti, post-doc in laboratorio.Dopo aver sezionato la milza di topo, romperla attraverso un filtro a celle da 70 nanometri per ottenere una sospensione a singola cellula in 10 millilitri di PBS con il 2% di FBS. Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con un millilitro di tampone sterile di cloruro di ammonio potassio lisina.Incubare le cellule per tre minuti a temperatura ambiente, quindi bloccare con cinque millilitri di PBS con il 2% di FBS. Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospese il pellet cellulare in tre millilitri di PBS con 2% FBS e rimuovere i residui di grasso mediante pipettaggio.Per le fasi di arricchimento, mantenere le celle fredde e utilizzare soluzioni pre-raffreddate a quattro gradi Celsius e quindi mantenute sul ghiaccio. Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Sospendere tutte le cellule nella quantità appropriata di PBS con bloccante 2% FPS e Fc e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Lavare con uno o due millilitri di tampone di separazione MACS per 10 milioni di celle e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, colorare le cellule con CD19-FITC e H2-IAb-FITC e incubare per 15 minuti al buio a quattro-otto gradi Celsius. Lavare le celle aggiungendo uno o due millilitri di tampone MACS per 10 milioni di celle e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti.Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare in 90 microlitri di tampone MACS per 10 milioni di cellule. Aggiungere 10 microlitri di microsfere anti-FITC per 10 milioni di cellule. Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a quattro-otto gradi Celsius.Lavare le cellule aggiungendo uno o due millilitri di tampone MACS per 10 milioni di cellule e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere fino a 125 milioni di cellule in 500 microlitri di buffer MACS. Posizionare una colonna LD nel campo magnetico del separatore MACS.Per evitare intasamenti, applicare un filtro di pre-separazione sulla colonna LD e risciacquarla con due millilitri di buffer MACS. Applicare la sospensione cellulare sul filtro e raccogliere le celle senza etichetta che passano attraverso la colonna. Lavare il serbatoio della colonna vuoto tre volte con un millilitro di buffer MACS.Raccogliere l'effluente arricchito con cellule T e contare le cellule, mantenendo 50 microlitri per l'analisi FACS. Dopo aver centrifugato a 300 volte G per cinque minuti, rimuovere il surnatante e macchiare le cellule con CD1d tetramer-PE. Mescolare bene e incubare per 30 minuti al buio sul ghiaccio.Lavare le celle aggiungendo da uno a due millilitri di buffer MACS per 10 milioni di celle. Dopo la centrifugazione a 300 volte G per 10 minuti, rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare in 80 microlitri di tampone MACS per 10 milioni di cellule. Aggiungere 20 microlitri di microsfere anti-PE per 10 milioni di cellule.Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a quattro-otto gradi Celsius. Lavare le celle aggiungendo uno o due millilitri di tampone MACS per 10 milioni di celle e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere fino a 100 milioni di cellule in 500 microlitri di buffer MACS.In base al conteggio delle celle, posizionare la colonna LS o MS nel campo magnetico del separatore MACS e risciacquare la colonna con il buffer MACS. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna, raccogliere le celle senza etichetta che passano attraverso e lavare la colonna tre volte come descritto in precedenza. Questa è la frazione negativa.Rimuovere la colonna dal campo magnetico e posizionarla su un nuovo tubo di raccolta. Pipettare il buffer MACS sulla colonna e spingere lo stantuffo fornito nella colonna per scovare la frazione positiva arricchita in celle T INK. Per aumentare ulteriormente il recupero delle cellule T INK, centrifugare la frazione negativa a 300 volte G per 10 minuti e ripetere i passaggi precedenti con una nuova colonna LS o MS.Tirare le frazioni positive e determinare il conteggio delle cellule. Conservare 50 microlitri di frazioni sia positive che negative per l'analisi FACS per verificarne la purezza. Per attivare le cellule T INK con un rapporto uno-a-uno, trasferire il volume appropriato di perline magnetiche anti-CD3 e CD28 su un tubo e ad un volume uguale di PBS, quindi vortice per cinque secondi.Posizionare il tubo su un magnete per un minuto ed eliminare il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e risospescere le perle magnetiche lavate nel giusto volume di RPMI. Centrifugare le cellule T INK purificate a 300 volte G per cinque minuti e mescolarle con perline magnetiche anti-CD3 o CD28 dell'attivatore T del mouse.Piastra un millilitro della sospensione cellulare, perline magnetiche anti-CD23 e CD28 in una piastra a 48 pozzetti con 20 unità per millilitro IL-2, quindi incubare a 37 gradi Celsius. Dopo cinque giorni, aggiungere 10 nanogrammi per millilitro IL-7. Dividere le cellule a metà quando raggiungono l'80-90% di confluenza, aggiungendo sempre 20 unità per millilitro IL-2 e 10 nanogrammi per millilitro IL-7.In queste condizioni, le cellule T INK possono essere espanse fino a 15 giorni. Utilizzando questo protocollo, le cellule T INK sono arricchite dalla milza di topi transgenici attraverso un processo di separazione immunomagnetica. Dopo l'arricchimento, le cellule possono essere espanse con perline anti-CD3 e CD28, con conseguente espansione di 30 volte in media entro il giorno 14 della coltura.La forte attivazione con perline anti-CD3 e anti-CD ha indotto la downregulation dell'espressione del TCR delle cellule T IMK sulla superficie cellulare ed è apparsa una doppia popolazione negativa. La maggior parte delle cellule T INK espanse sono CD4 negative. La caratterizzazione dei fattori di trascrizione specifici del lignaggio PLZF e ROR gamma T ha permesso di identificare i fenotipi NKT1, NKT2 e NKT17 su cellule T INK arricchite al giorno zero e 14.Le cellule T INK arricchite mostrano un fenotipo effettore simile a T80, che viene conservato dopo 14 giorni di espansione come confermato dalla secrezione di interferone gamma e IL-4 dopo stimolazione di PMA e ionomicina. Durante le fasi di purificazione, ricordarsi di lavorare velocemente con soluzioni pre-raffreddate e di eliminare eventuali residui di grasso che possono essere visti durante il pipettaggio. Le cellule T INK espanse possono essere sfruttate per saggi in vitro e trasferimenti in vivo nei topi, anche dopo modifiche funzionali tramite trasferimento genico o modifica.L'espansione in vitro delle cellule T INK supera il limite dato dalla scarsità, rendendole sfruttabili in studi preclinici nei campi della sorveglianza immunitaria tumorale, delle malattie infettive e dell'autoimmunità.

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Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

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Un metodo ottimizzato per l&#39;isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse

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Descriviamo qui un saggio di uccisione a base di citometria in vivo che consente di esaminare l'immunodominanza nelle risposte citotossiche dei linfociti T (CTL) a un antigene tumorale modello. Forniamo esempi di come questo saggio elegante può essere impiegato per gli studi meccanicistici e per i test di efficacia dei farmaci.

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Purificazione ed espansione di cellule T Natural Killer invarianti di topo per studi in vitro e in vivo

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