Name: Fisiologici, caratterizzazione morfologica e neurochimica dei neuroni modulati Movimenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Impara a registrare la risposta fisiologica di singoli neuroni durante il movimento e caratterizzarne morfologia e neurochimica. Questa tecnica preserva le connessioni neuronali e gli input sinaptici per studi in vivo.

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Ringrazio Anthony Taylor per la formazione iniziale in in vivo registrazione intracellulare e A Maxwell Brown e David per aiutare lo sviluppo iniziale della tecnica di colorazione intracellulare. Ringrazio M. Argento per aiutare con la macro collocalization. Molti studiosi con i quali ho collaborato visione fornito nello sviluppo di questa tecnica tra cui R. Donga, M. Moritani, P. Luo, R. Ambalavanar. Questa tecnica è stata sviluppata con il supporto considerevole dalle sovvenzioni NIH DE10132, DE15386 e RR017971.

1. Preparazione degli animali <ol><li> Anestetizzare ratto con sodio pentobarbital (IP 50mg/kg) e posto su una piastra elettrica. Radere la pelle sovrastante il cranio posteriore con tagliaunghie animale. Controllare l'animale per assicurare che un livello chirurgico di livello di anestesia è stata ottenuta con test per l'assenza di un riflesso ritiro e vocalizzazione quando le dita sono schiacciati come pure l'assenza di un riflesso palpebrale. Controllare il livello di anestesia ogni 15 minuti e mantenere un livello chirurgico di anesthetisa con iniezioni di 15mg/kg di sodio pentobarbital ogni 45 minuti. </li><li> Utilizzare una tecnica asettica e fare un'incisione nella regione inguinale appena distalmente alla piega formata dal addome e interno coscia e inserire una cannula (1 mm di diametro, Clay Adams) nella vena femorale, e l'arteria femorale. Fai una incisione sulla linea mediana nella regione sottomandibolare, riflettono i muscoli infraioidea. Fai una piccola incisione nella trachea e inserire una cannula (2mm di diametro) per consentire la ventilazione. Tye una sutura intorno alla trachael cannual per fissarlo in place.Monitor pressione arteriosa sistemica sistolica e diastolica mediante la cannula arteriosa. Oltre a monitorare il ritiro e riflesso palpebrale ora monitorare la pressione del sangue per valutare il livello di anestesia. Somministrare l'anestesia aggiuntiva in caso di necessità attraverso la cannula venosa. </li><li> Posizionare il topo in un frame stereotassico ed eseguire una craniotomia per esporre il cervelletto. Fissare la cannula tracheale di un ventilatore roditori. Ventilare l'animale con un volume di 2 cm 3 ad un tasso di 100/min con aria umidificata. Una pressione positiva di fine espirazione di 1 cm H 2 O dovrebbe essere mantenuto per prevenire il collasso del polmone. Ogni 15 minuti hyperinflate i polmoni per prevenire atelettasia. Poi coprire la superficie del cervello con olio minerale riscaldato (30 ° C). Fare attenzione a evitare il seno grande venoso situato direttamente sotto la giunzione tra il parietale e ossa interparietale. </li><li> Applicare la colla al cianoacrilato una canna accoppiato ad un vibratore elettromagnetico e allegare l'asta nel diastema della mandibola. Spostare i segnali mandibola comando utilizzando il vibratore sia da un uscita A / D del computer o di un generatore di segnale. </li><li> Posizionare un siliver-argento elettrodo di messa a terra cloruro sotto la pelle adiacente alla craniotomia. </li></ol> 2. Elettrodo di preparazione <ol><li> Fabbricare microelettrodi in vetro di quarzo o di alluminio con un estrattore orizzontale microelettrodo. </li><li> Riempire il microelettrodo con biotinamide 5-10% sciolto in KCl 0.25M e 0.5M Tris HCl (pH 7,6) o del 2% tetramethlyrhodamine in soluzione salina (pH 6). Controllo dell'impedenza dell'elettrodo con un tester elettrodo. Per registrare da assoni di grande diametro fare elettrodi con impedenza di 60-80M Ω, per gli assoni piccoli e interneuroni fanno elettrodi con impedenza di 80-150MΩ. </li><li> Posizionare il microelettrodo nella fase capo della elettrometro. Visualizza l'elettrodo attraverso un piccolo telescopio (20X con un reticolo allegato) che è fissato in posizione dietro la testa dell'animale. Utilizzando il telescopio è importante perché permette di essere stereotaxically elettrodi posizionati con estrema precisione. </li></ol> 3. Registrazione elettrofisiologica e colorazione intracellulare <ol><li> Fai una piccola apertura nella pia madre e compensare il feedback capacità in modo che quando l'elettrodo tocca il cervello un segnale di feedback viene prodotto. Questo consente un accurato posizionamento della superficie del cervello. </li><li> Produrre ripetuto spostamento della mandibola e far avanzare l'elettrodo nel cervello con un motore passo-passo. </li><li> Riconoscere impalements neuronale da improvvisi cali di potenziale DC e identificare intrasomatica impalements neuronale in corso di attività sinaptica. Buzzing l'elettrodo con sovracompensazione di capacità o toccando raramente producono una penetrazione di successo cellula. A causa della alta impedenza degli elettrodi, le risposte neuronali sono raramente osservati prima della penetrazione. </li><li> Dopo aver infilzare un neurone e la penetrazione è considerato stabile, caratterizzano la risposta neuronale utilizzando rampa e tenere premuto e il movimento della mascella sinusoidale. 5 Mappa del campo recettivo del neurone sondando la pelle intorno alla testa e all'interno della cavità orale con un non-conduttivo sonda come un bastone di legno. Se rilevanti per lo studio, esaminare la risposta del neurone ad altri stimoli funzionalmente rilevanti quali la contrazione muscolare e stimoli nocivi. 6 afferenti primari nocicettivi recettori neuronali rispondere agli stimoli nocicettivi. Anesthesetics generale come il sodio pentobarbital Non blocco di conduzione assonale nei neuroni afferenti primari ma deprimono la trasmissione sinaptica. Così conduzione assonale nelle primarie assone afferente neuronale è conservato. </li><li> Iniettare corrente (DC, 1-4NA) per un tempo di iniezione totale di 15-70nA minuti. Monitorare la penetrazione degli elettrodi durante l'iniezione di corrente e sospendere se potenziale di membrana diventa più positivo di quello-30mV.</li></ol> 4. Lavorazione dei tessuti <ol><li> Eutanasia degli animali per overdose di pentobarbital (140mg/kg IV) e profumato con un risciacquo vascolare (0,9% NaCl 38 ° C che contiene 500 unità di eparina e 1ml 2% xylocaina seguito da paraformaldeide 4% in 0.1M tampone fosfato (pH 7,4) . </li><li> Togliere il cervello e la sezione è a 50-100μm con un vibratome sia nel frontale, piano sagittale o orizzontale. Secions sono raccolti flottante libero in 25 ° C PBS. </li><li> Processo del cervello per DAB incubando in 1-2% di siero normale di capra e 1% Triton X-100 a 0.01M PBS seguita da incubazione nel complesso avidina biotina (1:50 Elite Vectastain). Reagire sezioni utilizzando nichel-DAB con H 2 O 2. Al processo per il Texas Red, sezioni incubare in complesso avidina-biotina (1:50) in PBS notte a 4 ° C e incubare nel 4% Texas Red avidina DCS in PBST a 4 ° C durante la notte. Sezioni di contrasto con una macchia fluorescente Nissl (NeuroTrace) 20 minuti a 23 ° C. </li><li> Se il neurone è stato iniettato con rodamina, visualizzare il neurone iniettato direttamente con un microscopio a fluorescenza (Es 545nm). </li></ol> 5. La combinazione di metodo con marcatura retrograda, immunocitochimica, l'imaging confocale, analisi quantitativa colocalizzazione Il successo di combinare questa tecnica con altri metodi dipende in gran parte buona etichettatura intracellulare. <ol><li> Il metodo qui visualizzati possono essere facilmente combinati con retrograda etichettatura neuronale. 7-10 Per fare questo, anestetizzare l'animale e con tecnica asettica, iniettare un tracciante neuronale come la perossidasi del rafano (20% perossidasi di rafano. Sigma VI, Sigma) e 1% germe di grano aggultinated perossidasi (Sigma) in regioni periferiche come bersaglio il muscolo massetere. Questo tracciante neuronale sarà assunto in assoni periferici e trasportati attraverso il trasporto assonale al somata motoneuroni. Per il muscolo massetere, 15μl di tracciante viene iniettato nel muscolo con una sterile microsiringa da 10 microlitri. Gli animali vengono poi poste su una piastra elettrica e seguito fino alla ripresa dall'anestesia e poi messo nelle loro gabbie per il recupero. Dopo 24 ore, anestetizzare gli animali e fisiologicamente caratterizzano i neuroni e intracellulare loro macchia. Poi l'animale profumato come descritto sopra e sezioni di tessuto di processo per la presenza di HRP utilizzando tetrametilbenzidina (TMB) come cromogeno ed tungstato di sodio come lo stabilizzatore e intensificato con il cobalto. Sezioni posto in 1% di sodio tungstato sciolto in PBS 0,1 M (pH 6,5) e 0,0007% TMB dissolto in etanolo e acetone assoluto a 15 ° C per 20 min. Poi reagire sezioni di tessuto con l'aggiunta di 1,0 ml di 0,3% H 2 O 2 per 100 ml di soluzione di incubazione per 60 min. Lavare il tessuto in PBS 0,1 M (pH 6,5) e il luogo in diaminobenzidina 0,05% (pH 7,4), 0,02% di cobalto, e 0,01% di H 2 O 2 a 0,1 M PBS (pH 7,4) per 10 minuti. a 37 ° C. Processo il tessuto per la visualizzazione del neurone iniettati con biotinamide come descritto e visualizzare le relazioni tra i neuroni sensoriali etichettato e una varietà di motoneuroni. </li><li> La tecnica qui può anche facilmente essere combinato con immnocytochemistry 6. Per fare un esempio, immunocytochemically processo del cervello per sinaptofisina di localizzare con precisione all'interno delle sinapsi dei neuroni etichettati (Fig. 3). Per fare questo, incubare sezioni di cervello di topo anti-sinaptofisina anticorpi (1:10.000) per 2 giorni a 4 ° C e incubare anti-mouse FITC (1:400) per 1h a 23 ° C. </li><li> Neuroni marcati con marcatori fluorescenti o trattati per l'imaging fluorescenti sono l'ideale per l'imaging confocale. Figura 3 è un esempio di una sezione ottica ottenuta con microscopia confocale attraverso un bouton assone. (Fig. 3). Generare animazioni dei neuroni etichettati con l'acquisizione di più sezioni ottiche attraverso il neurone etichettati (Fig. 4). </li><li> I neuroni etichettati con questo metodo può essere utilizzato per l'analisi quantitativa colocalizzazione. Per fare questo, utilizzare una macro di software disponibili al pubblico in collaborazione con NIH immagine (che si trova a http://phy.ucsf.edu/ ° idl / colocalization.htm). Sinaptofisina localizzare all'interno dei terminali singolo assone combinando etichettatura intracellulare con immunocitochimica sinaptofisina 6. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Una panoramica dei risultati rappresentativi che si possono ottenere con questo metodo sono illustrati nella Figura 1. Questo singolo neurone tronco encefalico è stato elettrofisiologico registrato durante il movimento della mandibola e, come si può chiaramente vedere, la risposta del neurone (Figura 1 in basso a sinistra, la luce blu) è stata modulata durante il movimento. Questo neurone è stato iniettato con biotinamide dopo caratterizzazione elettrofisiologica e successivamente trattati per la visualizzazione. Il neurone ricostruito (Figura 1 medio, verde) può essere realeTed ad un punto di riferimento anatomico, in questo caso il nucleo motore del trigemino designato (contorno rosso). Basati sulla risposta neuronale durante il movimento e la ricostruzione questo neurone può essere identificato come un neurone secondario fuso muscolare afferenti. La figura 2 illustra un esempio rappresentativo della risposta fisiologica di un neurone durante lo spostamento della mandibola. La risposta del neurone è rappresentato come frequenza di emissione istantanea. Si noti che la risposta neuronale imita strettamente spostamento mandibolare indicando che questo neurone particolare fornisce un feedback sensoriale legati alla posizione della mandibola. Figura 3 è un'immagine forte ingrandimento di un assone intracellulare macchiato combinato con colorazione di Nissl sinaptofisina e una macchia. Si noti la colocalizzazione di sinaptofisina (giallo) all'interno del bouton assone. Figura 4 è una animazione di un singolo neurone fisiologicamente caratterizzato e intracellulare etichettati. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Panoramica del metodo. In alto a sinistra: lo spostamento della mandibola. Medio registrazione intracellulare (verde) da solo neurone (giallo). La morfologia di questo neurone è stato ricostruito dopo la registrazione intracellulare e iniezione. Contorno rosso indica la posizione del nucleo motore del trigemino. In basso a sinistra: risposta fisiologica di questo neurone durante il movimento della mascella. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Rappresentante risposta fisiologica di un neurone singolo muscolo sensoriali registrate in vivo durante il movimento della mandibola. Si noti la somiglianza della risposta neuronale con spostamento della mandibola. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Arborizzazione terminale assonale con boutons sinaptica (gonfiori rosso) di un livello intracellulare macchiato di neuroni sensoriali che hanno risposto durante muscolare sondaggio. Il conseguente trattamento immunocitochimica per sinaptofisina mostra la localizzazione del sinaptofisina all'interno del bouton assonale (giallo). Green è un colorante fluorescente Nissl. Figura 4. Animazione di assone fuso muscolare neurone primario afferente la cui risposta fisiologica è stato registrato in vivo durante il movimento mandibolare, L'assone è stato poi intracellulare colorati ed elaborati per la visualizzazione. <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">Scaricare un video ad alta risoluzione di Figura 4 qui</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">Scaricare un video a media risoluzione di Figura 4 qui</a>

<ol><li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li>
<li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li>
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<li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li>
<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li>
<li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li>
<li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li>
</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti conformemente al guidlines e regolazione di cui la Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (NIH Publication No. 86-23, riveduta 1985) e l&#39;Università del Maryland e cura degli animali Usa comitato.

Il metodo qui illustrato è una tecnica potente che fornisce informazioni importanti nella funzione di singoli neuroni e di come la risposta dei singoli neuroni contribuisce a circuiti neuronali. 9 Questa conoscenza è fondamentale per comprendere la funzione senso-motoria. La più grande forza di questa tecnica è che consente sia la determinazione di un gran numero di parametri su un neurone tra cui la fisiologia, la morfologia e la morfologia sinaptica e la distribuzione. Quando combinato con altre tecniche co...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente o attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> vibratore elettromagnetico </td><td> Ling Dynamic Systems </td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td> generatore di segnale </td><td> Sistemi di feedback </td><td> PFG605 </td><td> in grado di produrre il segnale di uscita trapezoidale </td></tr><tr><td> elettrodo di vetro </td><td> Sutter Instruments </td><td> AF100-68-10 </td><td> con filamento </td></tr><tr><td> elettrodo estrattore </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modello P-2000 e P-80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td> Laboratori Vector </td><td> SP-1120 </td><td> conservato a 4 ° C </td></tr><tr><td> Texas Red avidina DCS </td><td> Laboratori Vector </td><td> A-2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td> Molecular Probes </td><td> D-3308 </td><td> 3000 peso molecolare, lisina fissabile </td></tr><tr><td> topo anti-sinaptofisina anticorpi </td><td> Chemicon </td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td> fluorescente macchia Nissl </td><td> Neurotrace, Molecular Probes </td><td> N-21480 </td><td></td></tr><tr><td> elettrodo tester </td><td> Winston Elettronica </td><td> BL-1000-B </td><td> per misurare l&#39;impedenza degli elettrodi </td></tr><tr><td> elettrometro </td><td> Axon Instruments </td><td> Axoprobe 1A, 2B Axoclamp </td><td></td></tr></tbody></table>

fisiologici, caratterizzazione morfologica e neurochimica dei neuroni modulati movimenti

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Il ruolo dei singoli neuroni e la loro funzione nei circuiti neuronali è fondamentale per capire i meccanismi neuronali delle funzioni sensoriali e motorie. Maggior parte delle indagini di meccanismi sensomotori avvalersi né esame di neuroni, mentre un animale è 1,2 statico o registrare l&#39;attività neuronale extracellulare durante un movimento. 3,4 Anche se questi studi hanno fornito lo sfondo fondamentale per la funzione sensomotoria, che o non valutare le informazioni funzionali che si verifica durante un movimento o sono limitate nella loro capacità di caratterizzare completamente il fenotipo anatomia, fisiologia e neurochimici del neurone. Una tecnica è qui che permette la caratterizzazione completa di singoli neuroni nel corso di un movimento vivo. Questa tecnica può essere utilizzata non solo per studiare i neuroni afferenti primari, ma anche per caratterizzare motoneuroni e interneuroni sensomotorie. Inizialmente la risposta di un singolo neurone viene registrata con metodi elettrofisiologici durante vari movimenti della mandibola seguita dalla determinazione del campo recettivo per il neurone. Un tracciante neuronale viene poi iniettata livello intracellulare nel neurone e il cervello viene elaborata in modo che i neuroni possono essere visualizzati con la microscopia ottica, elettronica e confocale (Fig. 1). La morfologia dettagliata del neurone è caratterizzata poi ricostruita in modo che la morfologia neuronale può essere correlato con la risposta fisiologica del neurone (Fig. 2,3). In questa comunicazione dei dettagli delle chiavi importanti e suggerimenti per il successo di questa tecnica sono forniti. Preziose informazioni aggiuntive possono essere determinate per il neurone in fase di studio, combinando questo metodo con altre tecniche. Retrograda etichettatura neuronale può essere usato per determinare i neuroni con cui le sinapsi dei neuroni etichettati; permettendo così la determinazione dettagliata dei circuiti neuronali. Immunocitochimica può essere combinato con questo metodo per esaminare neurotrasmettitori all&#39;interno del neurone etichettati e per determinare i fenotipi chimica dei neuroni con cui le sinapsi dei neuroni etichettati. Il neurone marcata può essere effettuato anche per la microscopia elettronica per determinare le caratteristiche ultrastrutturali e microcircuiti del neurone etichettati. In generale questa tecnica è un potente metodo per caratterizzare accuratamente i neuroni in movimento durante vivo permettendo quadro chiaro della funzione del neurone in funzione senso-motoria.

Una tecnica è descritta per quantificare in vivo la risposta fisiologica dei neuroni dei mammiferi durante il movimento e correlare la fisiologia del neurone con morfologia neuronale, fenotipo neurochimico e microcircuiti sinaptici.

Fisiologici, caratterizzazione morfologica e neurochimica dei neuroni modulati Movimenti

Il ruolo dei singoli neuroni e la loro funzione nei circuiti neuronali sono fondamentali per comprendere i meccanismi neuronali sensoriali e motori...

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare la risposta fisiologica di singoli neuroni durante il movimento e caratterizzare ulteriormente la morfologia e la neurochimica di questi neuroni. Questo viene ottenuto anestetizzando prima l'animale e preparandolo chirurgicamente. Il passaggio successivo consiste nel registrare elettrofisiologicamente la risposta intracellulare di singoli neuroni durante il movimento.Dopo aver perfuso l'animale ed elaborato il cervello, il passaggio finale consiste nel visualizzare e analizzare la risposta fisiologica e la morfologia neuronale. In definitiva, le tecniche di registrazione neuronale intracellulare, di immunoistochimica e di analisi si combinano per mostrare le modulazioni del potenziale di membrana di singoli neuroni durante il movimento. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la coltura cellulare, è che vengono preservate le connessioni neuronali e gli input sinaptici, e i neuroni non sono estratti autonomamente né posti in mezzi artificiali. Il giorno prima, l'esperimento prevede l'iniezione di un tracciante neuronale, come la perossidasi di rafano, nelle regioni bersaglio periferiche per etichettare retrogradamente i motoneuroni.Il giorno successivo anestetizzare il ratto e posizionarlo su un tappetino riscaldante, rasare la cute sovrastante il cranio posteriore con forbici per animali utilizzando una tecnica asettica. Praticare un'incisione lungo la coscia interna, inserire una cannula nella vena femorale per un'ulteriore anestesia. Inserire un'altra cannula nell'arteria femorale per monitorare la pressione sanguigna.Infine, inserire una cannula nella trachea. Successivamente, posizionare il ratto in un telaio stereotassico. Eseguire una craniotomia per esporre il cervelletto, avendo cura di evitare il grande seno venoso situato esattamente sotto la giunzione tra le ossa parietali e interparietali.Successivamente, coprire la superficie del cervello con olio minerale riscaldato. Ora incollare la mandibola a un'asta collegata a un vibratore elettromagnetico. Il movimento della mandibola è controllato da segnali di comando inviati al vibratore da un generatore di segnale.Successivamente, posizionare un elettrodo di messa a terra sotto la cute adiacente alla craniotomia. Per preparare gli elettrodi intracellulari, tirare e riempire microelettrodi con una soluzione del colorante IDE o tetraetilrodamina. L'impedenza dell'elettrodo deve essere compresa tra 60 e 80 megaohm per gli assoni di grande diametro e tra 80 e 150 megaohm per gli assoni afferenti di piccole dimensioni e i neuroni intercalati.Successivamente, posizionare l'elettrodo microscopico nella testata dell'elettrometro utilizzando un piccolo telescopio fissato in posizione dietro la testa dell'animale. Visualizzare l'elettrodo microscopico attraverso l'oculare rosso 20x del telescopio. L'area bersaglio si trova a circa 0,5 millimetri caudalmente al margine inferiore del collicolo inferiore.Ora creare una piccola apertura nella pie meningea per consentire una localizzazione accurata della superficie del cervello. Sovracompensare il feedback di capacità in modo che, quando l'elettrodo tocca il cervello, venga prodotto un segnale di feedback. Avanzare l'elettrodo fino a quando non entra nel cervello.Il passo successivo consiste nell'attivare lo spostamento ripetuto della mandibola. Successivamente, utilizzando un motore passo-passo, avanzare l'elettrodo nel cervello. Quando un impalamento neuronale è indicato da una brusca diminuzione del potenziale in corrente continua e da un'attività sinaptica in corso, interrompere l'avanzamento dell'elettrodo.Quando la penetrazione è considerata stabile, iniziare movimenti rampa-e-pausa e movimenti sinusoidali delle mascelle. Registrare la risposta neuronale e caratterizzare il neurone in base alla sua risposta. Successivamente, per mappare il campo recettivo del neurone, utilizzare una sonda ottusa per esplorare la cute intorno alla testa e la cavità intraorale.Esplorare la risposta del neurone ad altri stimoli, come la contrazione muscolare o stimoli nocicettivi. Al termine delle registrazioni, iniettare da uno a quattro nanoampere di corrente continua per un'iniezione totale compresa tra 15 e 70 nanoampere minuti. Monitorare la penetrazione dell'elettrodo e interrompere l'iniezione di corrente.Se il potenziale della membrana diventa più positivo di meno 30 millivolt, il passo successivo è sezionare il tessuto cerebrale. Dopo l'eutanasia e la perfusione dell'animale, rimuovere il cervello. Quindi tagliare sezioni di 50-100 micron nei piani frontale, sagittale o orizzontale.Per visualizzare la relazione tra il neurone sensoriale marcato e una varietà di neuroni motori, processare il tessuto con H-R-P-D-A-B o rosso Texas, a seconda del tessuto; analisi aggiuntive possono essere effettuate con un microscopio fluorescente o confocale oppure utilizzando software di colocalizzazione quantitativa. Se necessario, è possibile eseguire un'elaborazione immunochemica per la sinaptofisina al fine di localizzare con precisione le sinapsi all'interno dei neuroni marcati. Questa figura mostra un neurone del tronco encefalico che è stato iniettato con IDE dopo la caratterizzazione elettrofisiologica.In base alla risposta neuronale durante il movimento, questo neurone può essere identificato come un neurone afferente del fuso muscolare secondario. Il contorno marrone indica la posizione del nucleo motore del trigemino. Questa figura mostra la risposta fisiologica di un neurone sensoriale durante lo spostamento della mandibola.La risposta del neurone è rappresentata come frequenza istantanea di scarica. Si noti che la risposta imita da vicino lo spostamento della mandibola, indicando che questo particolare neurone fornisce un feedback sensoriale relativo alla posizione mandibolare. Questa figura mostra un neurone sensoriale che ha risposto durante la stimolazione muscolare.Il neurone è stato colorato con ide dopo il trattamento immunochemico. I bastoncini sinaptici, che appaiono come rigonfiamenti rossi, sono visibili co-localizzati con la sinaptofisina gialla. Il verde è una colorazione fluorescente a missile.Questa figura è un'animazione di un assone di un neurone afferente primario del fuso muscolare. Sono state utilizzate diverse sezioni ottiche del neurone marcato per generare l'animazione. Dopo questa procedura, altri metodi come microscopia elettronica, microscopia confocale e marcatura neuronale anterograda o retrograda possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardo alle caratteristiche ultrastrutturali del neurone, alla colocalizzazione di neurotrasmettitori con le sinapsi e alla connettività neuronale.

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