Fisiologici, caratterizzazione morfologica e neurochimica dei neuroni modulati Movimenti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare la risposta fisiologica dei singoli neuroni durante il movimento e caratterizzare ulteriormente la morfologia e la neurochimica di questi neuroni. Ciò si ottiene anestetizzando e preparando chirurgicamente l'animale. Il passo successivo è quello di registrare elettrofisiologicamente la risposta intracellulare dei singoli neuroni durante il movimento.

Dopo aver perfuso l'animale ed elaborato il cervello, il passo finale è quello di visualizzare e analizzare la risposta fisiologica e la morfologia neuronale. In definitiva, le tecniche di registrazione neuronale intracellulare, l'immunochimica e l'analisi si combinano per mostrare le modulazioni del potenziale di membrana dei singoli neuroni durante il movimento. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la coltura cellulare, è che le connessioni neuronali e gli input sinaptici sono preservati e i neuroni non vengono ex autotomizzati né inseriti in mezzi artificiali. Il giorno prima, l'esperimento inietta un tracciante neuronale, come il ravanello di cavallo, la perossidasi nelle regioni periferiche bersaglio per marcare retrogradamente i motoneuroni.

Il giorno successivo anestetizzare il ratto e posizionarlo su un termoforo, radere la pelle, sovrastante il cranio posteriore con tosatrici per animali utilizzando una tecnica asettica. Praticare un'incisione lungo l'interno coscia, inserire una cannula nella vena femorale per un'ulteriore anestesia. Inserire un'altra cannula nell'arteria femorale per monitorare la pressione sanguigna.

Infine, inserire una cannula nella trachea. Quindi, posiziona il ratto in un fotogramma stereotassico. Eseguire una craniotomia per esporre il cervelletto facendo attenzione ad evitare il grande seno venoso situato direttamente sotto la giunzione tra le ossa parietale e interparietale.

Quindi, copri la superficie del cervello con olio minerale riscaldato. Ora incolla la mandibola a un'asta accoppiata a un vibratore elettromagnetico. Il movimento della mandibola è controllato da segnali di comando al vibratore da un generatore di segnali.

Quindi posizionare un elettrodo di messa a terra sotto la pelle adiacente alla craniotomia. Per prepararsi agli elettrodi intracellulari, estrarre i micro elettrodi di riempimento con un IDE o test in soluzione di colorante Domine a barra tetraetile. L'impedenza dell'elettrodo è compresa tra 60 e 80 mega ohm per assoni di grande diametro e tra 80 e 150 mega ohm per assoni afferenti piccoli e interneuroni.

Quindi, posizionare il microelettrodo nello stadio della testa dell'elettrometro utilizzando un piccolo telescopio fissato in posizione dietro la testa dell'animale. Visualizza il microelettrodo attraverso il redle 20 x incluso nel telescopio. L'area target è di circa 0,5 millimetri di diametro rispetto al bordo inferiore del collicolo inferiore.

Ora fai una piccola apertura nella pia madre per consentire una posizione precisa della superficie del cervello. Sovracompensa il feedback di capacità in modo che quando l'elettrodo tocca il cervello, viene prodotto un segnale di feedback. Far avanzare l'elettrodo fino a quando non entra nel cervello.

Il passo successivo consiste nell'attivare lo spostamento ripetuto della mandibola. Quindi, utilizzando un motore passo-passo, fai avanzare l'elettrodo nel cervello. Quando un impalamento neuronale è indicato da un improvviso calo del potenziale DC e dell'attività sinaptica in corso, interrompere l'avanzamento dell'elettrodo.

Quando la penetrazione è ritenuta stabile, avviare la rampa e la presa e i movimenti sinusoidali della mascella. Registra la risposta neuronale e caratterizza il neurone in base alla sua risposta. Successivamente, per mappare il campo recettivo del neurone, utilizzare una sonda smussata per esplorare la pelle intorno alla testa e alla cavità intraorale.

Esplora la risposta del neurone ad altri stimoli come la contrazione muscolare o gli stimoli nocivi. Al termine delle registrazioni, iniettare da uno a quattro nano amp, corrente CC per un'iniezione totale da 15 a 70 nano amp minuti. Monitorare la penetrazione dell'elettrodo e interrompere l'iniezione di corrente.

Se il potenziale di membrana diventa più positivo di meno 30 millivolt, il passo successivo è quello di sezionare il tessuto cerebrale. Dopo l'eutanasia e la perfusione dell'animale, rimuovere il cervello. Quindi tagliare sezioni da 50 a 100 micron sul piano frontale, sagittale o orizzontale.

Per visualizzare la relazione tra il neurone sensoriale marcato e una varietà di motoneuroni, elaborare il tessuto per H-R-P-D-A-B o rosso Texas, a seconda del tessuto, ulteriori analisi possono essere eseguite con un microscopio fluorescente o confocale o utilizzando un software di colocalizzazione quantitativa. A piacere, è possibile eseguire l'elaborazione immunochimica per la sinaptofisina per localizzare con precisione le sinapsi all'interno dei neuroni marcati. Questa figura mostra un neurone del tronco encefalico a cui è stato iniettato IDE dopo la caratterizzazione elettrofisiologica.

Sulla base della risposta neuronale durante il movimento, questo neurone può essere identificato come un neurone afferente del fuso muscolare secondario. Il contorno marrone indica la posizione del nucleo motore del trigemino. Questa figura mostra la risposta fisiologica di un neurone sensoriale durante lo spostamento della mascella.

La risposta del neurone è rappresentata come frequenza di attivazione istantanea. Si noti che la risposta imita da vicino lo spostamento mandibolare, indicando che questo particolare neurone fornisce un feedback sensoriale correlato alla posizione mandibolare. Questa figura mostra un neurone sensoriale che ha risposto durante il sondaggio muscolare.

Il neurone è stato colorato con ide in seguito a un processo immunochimico. I bastoni sinaptici che appaiono come rigonfiamenti rossi sono visti colocalizzati con la sinaptofisina gialla. Il verde è una macchia fluorescente per missili.

Questa figura è un'animazione di un assone da un neurone afferente primario del fuso muscolare. Per generare l'animazione sono state utilizzate più sezioni ottiche del neurone marcato. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'elettromicroscopia, la microscopia confocale e la marcatura neuronale di grado anteriore o retrogrado per rispondere a ulteriori domande sulle caratteristiche ultra strutturali della colocalizzazione neuronale dei neurotrasmettitori con BNS sinaptico e connettività neuronale.