Fisiologici, caratterizzazione morfologica e neurochimica dei neuroni modulati Movimenti
21 aprile 2011
Una tecnica è descritta per quantificare in vivo la risposta fisiologica dei neuroni dei mammiferi durante il movimento e correlare la fisiologia del neurone con morfologia neuronale, fenotipo neurochimico e microcircuiti sinaptici.
L'obiettivo generale di questa procedura è registrare la risposta fisiologica di singoli neuroni durante il movimento e caratterizzare ulteriormente la morfologia e la neurochimica di questi neuroni. Questo viene ottenuto anestetizzando prima l'animale e preparandolo chirurgicamente. Il passaggio successivo consiste nel registrare elettrofisiologicamente la risposta intracellulare di singoli neuroni durante il movimento.
Dopo aver perfuso l'animale ed elaborato il cervello, il passaggio finale consiste nel visualizzare e analizzare la risposta fisiologica e la morfologia neuronale. In definitiva, le tecniche di registrazione neuronale intracellulare, di immunoistochimica e di analisi si combinano per mostrare le modulazioni del potenziale di membrana di singoli neuroni durante il movimento. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la coltura cellulare, è che vengono preservate le connessioni neuronali e gli input sinaptici, e i neuroni non sono esautotomizzati né posti in mezzi artificiali. Il giorno prima, l'esperimento prevede l'iniezione di un tracciante neuronale, come la perossidasi di rafano, nelle regioni bersaglio periferiche per etichettare retrogradamente i motoneuroni.
Il giorno successivo anestetizzare il ratto e posizionarlo su un tappetino riscaldante, rasare la cute sovrastante il cranio posteriore con forbici per animali utilizzando una tecnica asettica. Praticare un'incisione lungo la coscia interna, inserire una cannula nella vena femorale per un'ulteriore anestesia. Inserire un'altra cannula nell'arteria femorale per monitorare la pressione sanguigna.
Infine, inserire una cannula nella trachea. Successivamente, posizionare il ratto in un telaio stereotassico. Eseguire una craniotomia per esporre il cervelletto, avendo cura di evitare il grosso seno venoso situato esattamente sotto la giunzione tra le ossa parietali e interparietali.
Successivamente, ricoprire la superficie del cervello con olio minerale riscaldato. Ora incollare la mandibola a un'asta collegata a un vibratore elettromagnetico. Il movimento della mandibola è controllato da segnali di comando inviati al vibratore da un generatore di segnale.
Successivamente, posizionare un elettrodo di messa a terra sotto la cute adiacente alla craniotomia. Per preparare gli elettrodi intracellulari, tirare e riempire microelettrodi con una soluzione del colorante IDE o tetraetilrodamina. L'impedenza dell'elettrodo deve essere compresa tra 60 e 80 megaohm per gli assoni di grande diametro e tra 80 e 150 megaohm per gli assoni afferenti di piccole dimensioni e i neuroni intercalari.
Successivamente, posizionare l'elettrodo microscopico nella testata dell'elettrometro utilizzando un piccolo telescopio fissato in posizione dietro la testa dell'animale. Visualizzare l'elettrodo microscopico attraverso l'oculare chiuso 20x del telescopio. L'area bersaglio si trova a circa 0,5 millimetri caudalmente al margine inferiore del collicolo inferiore.
Ora creare una piccola apertura nella pie meningea per permettere una localizzazione accurata della superficie del cervello. Sovracompensare il feedback di capacità in modo che, quando l'elettrodo tocca il cervello, venga prodotto un segnale di feedback. Avanzare l'elettrodo fino a quando non entra nel cervello.
Il passo successivo consiste nell'attivare lo spostamento ripetuto della mandibola. Successivamente, utilizzando un motore passo-passo, avanzare l'elettrodo nel cervello. Quando un impalamento neuronale è indicato da una brusca diminuzione del potenziale in corrente continua e da un'attività sinaptica in corso, interrompere l'avanzamento dell'elettrodo.
Quando la penetrazione è considerata stabile, iniziare movimenti rampa-e-pausa e movimenti sinusoidali delle mascelle. Registrare la risposta neuronale e caratterizzare il neurone in base alla sua risposta. Successivamente, per mappare il campo recettivo del neurone, utilizzare una sonda ottusa per esplorare la cute intorno alla testa e la cavità intraorale.
Esplorare la risposta del neurone ad altri stimoli, come la contrazione muscolare o stimoli nocicettivi. Al termine delle registrazioni, iniettare da uno a quattro nanoampere di corrente continua per un'iniezione totale compresa tra 15 e 70 nanoampere al minuto. Monitorare la penetrazione dell'elettrodo e interrompere l'iniezione di corrente.
Se il potenziale della membrana diventa più positivo di meno 30 millivolt, il passo successivo consiste nel sezionare il tessuto cerebrale. Dopo l'eutanasia e la perfusione dell'animale, rimuovere il cervello. Quindi tagliare sezioni di 50-100 micron nei piani frontale, sagittale o orizzontale.
Per visualizzare la relazione tra il neurone sensoriale marcato e una varietà di neuroni motori, processare il tessuto con H-R-P-D-A-B o Texas red, a seconda del tessuto; analisi aggiuntive possono essere effettuate mediante microscopio fluorescente o confocale oppure utilizzando software di colocalizzazione quantitativa. Se necessario, è possibile eseguire un'ulteriore processazione immunochemica per la sinaptofisina al fine di localizzare con precisione le sinapsi all'interno dei neuroni marcati. Questa figura mostra un neurone del tronco encefalico che è stato iniettato con IDE dopo la caratterizzazione elettrofisiologica.
In base alla risposta neuronale durante il movimento, questo neurone può essere identificato come un neurone afferente del fuso muscolare secondario. Il contorno marrone indica la posizione del nucleo motore del trigemino. Questa figura mostra la risposta fisiologica di un neurone sensoriale durante lo spostamento della mandibola.
La risposta del neurone è rappresentata come frequenza istantanea di scarica. Si noti che la risposta riproduce fedelmente lo spostamento della mandibola, indicando che questo particolare neurone fornisce un feedback sensoriale relativo alla posizione mandibolare. Questa figura mostra un neurone sensoriale che ha risposto durante la stimolazione muscolare.
Il neurone è stato colorato con ide dopo il trattamento immunochemico. I bastoncini sinaptici, che appaiono come rigonfiamenti rossi, sono visibili co-localizzati con la sinaptofisina gialla. Il verde è una colorazione fluorescente a missile.
Questa figura è un'animazione di un assone di un neurone afferente primario del fuso muscolare. Sono state utilizzate numerose sezioni ottiche del neurone marcato per generare l'animazione. Dopo questa procedura, altri metodi come microscopia elettronica, microscopia confocale e marcatura neuronale anterograda o retrograda possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardo alle caratteristiche ultrastrutturali del neurone, alla colocalizzazione di neurotrasmettitori con le sinapsi e alla connettività neuronale.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta una tecnica per quantificare la risposta fisiologica in vivo dei neuroni dei mammiferi durante il movimento. Tale tecnica correla la fisiologia neuronale con la morfologia, il fenotipo neurochimico e la microcircuitazione sinaptica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Neuroanatomia
Sfondo
- La registrazione delle risposte fisiologiche dei neuroni è fondamentale per comprenderne la funzione.
- I metodi esistenti spesso alterano le connessioni neuronali.
- Questa tecnica preserva l'ambiente naturale dei neuroni.
- I traccianti neuronali vengono utilizzati per etichettare neuroni specifici da studiare.
Scopo dello studio
- Registrare la risposta fisiologica di singoli neuroni durante il movimento.
- Caratterizzare la morfologia e la neurochimica di questi neuroni.
- Analizzare la relazione tra attività neuronale e struttura.
Metodi Utilizzati
- Anestetizzare e preparare chirurgicamente l'animale.
- Registrazione elettrofisiologica delle risposte intracellulari durante il movimento.
- Perfondere l'animale ed elaborare il cervello per l'analisi.
- Visualizzare e analizzare la morfologia neuronale e le risposte fisiologiche.
Risultati principali
- Dimostrate modulazioni del potenziale di membrana dei neuroni durante il movimento.
- Mostrato il mantenimento delle connessioni neuronali e degli input sinaptici.
- La combinazione di tecniche ha fornito informazioni sul comportamento neuronale.
- Evidenziati vantaggi rispetto ai metodi tradizionali di coltura cellulare.
Conclusioni
- Questa tecnica offre un approccio innovativo allo studio della fisiologia neuronale in vivo.
- Migliora la comprensione della relazione tra l'attività neuronale e la morfologia.
- Studi futuri potranno basarsi su questo metodo per esplorare diverse funzioni neuronali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere come rispondono i singoli neuroni durante il movimento è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze. Questa tecnica consente un'analisi meccanicistica correlando l'attività fisiologica con la morfologia e la neurochimica nei circuiti integri, sostenendo la fiducia predittiva nell'interazione con l'obiettivo. Affronta una lacuna chiave nella ricerca sensoriomotoria in cui metodi statici o extracellulari non riescono a catturare la dinamica funzionale durante il comportamento.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando i modelli di scarica neuronale durante il movimento a specifici tipi cellulari e vie neurali.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico mediante l'osservazione diretta della modulazione neuronale in condizioni fisiologicamente rilevanti.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia sul bersaglio caratterizzando i fenotipi neurochimici e la connettività sinaptica dei neuroni modulati.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi neuronali validati con risposte fisiologiche quantificate per lo screening di composti successivi.
- Riproducibilità: Standardizza la caratterizzazione morfologica e neurochimica per garantire letture consistenti tra esperimenti.
- Scalabilità: Favorisce il riutilizzo della piattaforma permettendo un dettagliato mappatura neuronale che può essere combinata con immunoistochimica o microscopia elettronica per analisi multiplex.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica preservando la circuitria nativa durante studi di movimento in vivo.
- De-risking Meccanicistico: Riduce l'ambiguità nella funzione del bersaglio correlando l'attività con caratteristiche ultrastrutturali e input sinaptici.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione attraverso un profilo neuronale completo che supporta l'allineamento dei biomarcatori e la validazione del percorso.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel processo di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino alla caratterizzazione preclinica, fornendo dati strutturali e funzionali sui neuroni attivi durante il movimento.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la registrazione delle risposte intracellulari durante comportamenti motori definiti, come il movimento della mascella.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso la visualizzazione e la quantificazione riproducibili della morfologia neuronale e della modulazione fisiologica.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative del potenziale di membrana e dati di colocalizzazione neurochimica che consentono un confronto oggettivo degli stati neuronali.
- Ricerca traslazionale: Si collega ai lavori preclinici preservando la microcircuitazione sinaptica, permettendo una continuità dalla risposta fisiologica alla validazione strutturale.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma di caratterizzazione riutilizzabile, applicabile a sistemi sensoriali, motori e interneuronali in diversi modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce un'elevata previsione riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso la correlazione di fisiologia, morfologia e neurochimica.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità mediante una preparazione chirurgica fissa, protocolli per elettrodi e passaggi standardizzati di elaborazione dei tessuti.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi sui bersagli grazie a una caratterizzazione completa dei neuroni in vivo.
- Impatto sul portafoglio: Sostiene la priorizzazione basata sulla gestione del rischio fornendo dati multimodali che informano le decisioni di selezione e avanzamento dei bersagli.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in elettrofisiologia intracellulare, preparazione chirurgica e tecniche di iniezione di traccianti neuronali.
- Si basa su strumentazione specializzata, inclusi elettrometri, generatori di segnale, motori passo-passo e sistemi microscopici per imaging a luce, elettronico o confocale.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro per quanto riguarda i protocolli di anestesia, i metodi di perfusione e il taglio dei tessuti, al fine di garantire la coerenza dei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento quando la tecnica viene applicata a diversi tipi neuronali o aree cerebrali al di fuori del sistema trigeminale.
- È limitata dalla difficoltà tecnica di mantenere registrazioni intracellulari stabili durante i movimenti, che dipende dall'impedenza dell'elettrodo e dalla stabilizzazione del cervello.
