Name: Procedura per lIngegneria del polmone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Scopri l'ingegneria del polmone per la medicina rigenerativa utilizzando matrici extracellulari decellularizzate e bioreattori biomimetici. Questo metodo consente di generare tessuto polmonare funzionale con scambio gassoso efficace.

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Ringraziamo Maegan B. Colehour per facilitare lo sviluppo di bioreattori. Questi studi sono stati finanziati dalla Yale University Dipartimento di Anestesia e dal NIH concedere HL 098220 (per LEN). THP è stato sostenuto da NIH T32 GM007171.

1. Bioreattore Assemblea Figura dettagliate (s) del bioreattore progettazione e montaggio sia per decellularization e la cultura sono forniti nelle figure 1 e 2, rispettivamente. Tutti i componenti devono essere sterilizzati prima del montaggio del bioreattore. I seguenti punti specifici sono indicati: COLLEGAMENTI: <ol><li> La cannula arteriosa è costituito da un raccordo luer-lock collegato ad un Y-splitter da un breve segmento di tubo. Il connettore luer-lock è collegato al tubo di perfusione, e il segmento del cromosoma Y che non è suturato l'arteria polmonare è collegato a una valvola unidirezionale. La valvola unidirezionale è orientato in modo che il liquido può essere redatto nel tubo (nella direzione opposta di perfusione), ma durante la perfusione degli organi tutti fluido scorre nei polmoni. </li><li> La cannula tracheale è composto anche di un connettore luer-lock collegato a un Y-splitter con tubi. Il luer-lock si connette a un circuito respiratorio tra il serbatoio trachea e la camera principale. Il segmento del connettore a Y che non è suturato alla trachea è anche collegato ad una valvola unidirezionale. La valvola unidirezionale è orientata nello stesso modo come la cannula arteriosa. </li></ol> FUNZIONI: <ol start="3"><li> Il senso unico valvole nella cannule arteriose e tracheale sono utilizzati per eliminare le bolle d'aria nel tubo, consentendo l'inversione del flusso nei tubi e quindi permettendo bolle d'aria da rimuovere. </li><li> Il "circuito respiratorio" comprende due valvole unidirezionali, posizionati in modo tale che la media segue un percorso diverso dentro e fuori del polmone. Una descrizione più dettagliata di questa funzione è disponibile in una pubblicazione preventiva da parte i nostri 2 di laboratorio. </li><li> Perfusione vascolare è fornito utilizzando una pompa a rulli. Medium è perfuso in arteria polmonare attraverso la cannula collegata, scorre attraverso il sistema vascolare polmonare, e la vena polmonare direttamente nel bioreattore principale, dove è tratto medio per perfusione. </li></ol> 2. Organ Harvest <ol><li> Euthanize adulti (3-6 mesi) Fischer 344 ratti per overdose di sodio pentobarbital, secondo le linee guida stabilite dalla American Veterinary Medical Association (60 mg / kg IP). Nota: la soluzione di pentobarbital include eparina a 100 unità / ml per la terapia anticoagulante. </li><li> Spray o pulire il torace e dell'addome con il 70% di etanolo. </li><li> Aprire la cavità toracica, esponendo il cuore ei polmoni, avendo cura di non danneggiare i polmoni. Cura fare una piccola finestra attraverso il diaframma nella cavità toracica, provocando i polmoni di ritrattare, e quindi espandere questa incisione orizzontale per esporre le basi dei polmoni. Fare due incisioni verticalmente attraverso le costole, e ritirare la gabbia toracica per esporre il cuore ei polmoni. </li><li> Preparare un sistema di perfusione gravità, cioè usando una siringa con stantuffo rimosso, un rubinetto a 3 vie, e ~ 20 centimetri di tubi con 1.5inch, 21-gauge. Mantenere la siringa a ~ 20cm sopra l'animale utilizzando un supporto ad anello. Assicurarsi che tutta l'aria viene rimossa dal tubo di perfusione. </li><li> Tagliare l'atrio destro per drenare il sangue, impedendogli di tornare ai polmoni. Taglio l'atrio sinistro per permettere il drenaggio del sangue facile e perfusato dai polmoni può anche essere utile, ma non è necessario. </li><li> Inserire l'ago nella base del ventricolo destro e aprire il rubinetto di perfusione polmonare con una soluzione di nitroprussiato eparina e sodio (50U/ml e 1ug/ml, rispettivamente) in PBS. Verificare che l'arteria polmonare si riempie di liquido di perfusione, e che il sangue è radura dai polmoni. Se necessario, riempire la siringa con il liquido di perfusione aggiuntivi. Tipicamente solo 10ml ~ è richiesto. </li><li> Continuare fino a quando la perfusione polmonare sono chiari di sangue, poi si ferma perfusione. </li><li> Sezionare il libero trachea, fino al collo per quanto possibile. Garantire trachea è separato dal esofago. Sezionare tutte le connessioni rimanenti al cuore, polmoni e trachea, e rimuovere in blocco. </li><li> Usando un bisturi o taglienti forbici, tagliare l'apice del cuore, esponendo i ventricoli destro e sinistro. </li><li> Cannulate il tronco polmonare attraverso il ventricolo destro, e la sutura al suo posto. Rimuovere qualsiasi tessuto in eccesso del ventricolo sinistro. </li><li> Cannulate la trachea e la sutura al suo posto. Assicurarsi che sia la cannula tracheale e polmonare arteriosa sono posizionati in modo tale che non ci sia lo stress torsionali sulla trachea, polmoni, o grossi vasi (Figura 1). </li><li> Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella cannula arteriosa, dal momento che bolle d'aria intrappolate nel sistema può impedire il flusso costante di attraverso l'organo. In alcuni casi, una bolla d'aria può completamente fermare flow.To fluido ottenere questo risultato, luogo del cuore / polmone blocco in un vaso contenente PBS. Utilizzare una siringa con ago per iniettare una piccola quantità di PBS nella cannula cuore di espellere eventuali bolle. </li><li> Lavaggio delle vie aeree con PBS 4-5 volte, per eliminare l'aria il più possibile dal polmone. </li><li> Dopo il passaggio lavandas sono completi, gonfiare il polmone con PBS contenente sodio nitroprussiato (SNP) a 1ug/ml. Mettere un tappo sulla cannula tracheale, per cui la soluzione rimane nel polmone. Lasciare che il polmone di incubare per 30 minuti, come la stessa soluzione passa attraverso il sistema vascolare attraverso l'arteria polmonare, per permettere vasodilatazione. </li><li> Collegare cuore / polmoni per un berretto bioreattore utilizzando il luer-lock connessioni legate alla forma di Y cannule, descritto in "Assemblea bioreattore" di cui sopra. (Figura 1). </li></ol> 3. Organo Decellularization <ol><li> Collegare il tappo (con i polmoni in allegato) agli apparecchi decellularization (Figura 1). La cannula arteriosa polmonare dovrebbe collegarsi alla linea di perfusione, e la cannula tracheale dovrebbe flottante. Assicurarsi che tutte le linee sono chiare d'aria. Come descritto in precedenza, l'aria nelle linee può essere una fonte di decellularization poveri, impedendo il flusso di liquido decllularization. L'aria intrappolata nel sistema può anche persistere nel tempo la cultura, quando essa potrebbe avere un impatto negativo sulla sopravvivenza delle cellule 3. </li><li> Gonfiare il polmone con PBS / SNP fino polmoni sono pieni, ma non troppo inflazionato. Immediatamente cappuccio della cannula tracheale in modo che il polmone rimane gonfiato. </li><li> Perfusione polmonare con PBS / SNP per almeno 15 min a ~ 15 mmHg (20 cm H 2 O di pressione). Dopo 15 minuti o più, togliere il tappo dalla cannula tracheale per consentire al polmone a sgonfiarsi. </li><li> Continua perfusione con PBS / SNP per 30min. Se necessario, riempire PBS / SNP per garantire la pressione di perfusione è mantenuta a 10-15 mmHg. </li><li> Iniziare perfusione con soluzione decellularization (CHAPS 8mm, 1M NaCl, 25mM EDTA in PBS 1X). Aver cura di garantire tutte le linee sono chiare d'aria. Un sistema di vuoto può essere utile per fornire aspirazione. </li></ol> Profumato con la soluzione decellularization fino a 500 ml di soluzione ha perfuso attraverso il polmone. Pressione ottimale è &lt;15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Questo di solito richiede 2,5 ore. Le portate sono in genere molto lento (0.2-0.5ml/minute) inizialmente, e di aumentare rapidamente nel corso della seconda ora a circa 1ml/minute o superiore. Periodicamente, rimuovere il liquido decellularization utilizzati da bioreattore, assicurando abbastanza fluido rimane per sostenere il polmone e cannula tracheale. 4. Lavaggio e sterilizzazione degli organi <ol><li> Trasferimento del polmone e bioreattori a un cappuccio coltura di tessuti. Iniziare risciacquo con PBS sterile, eliminando il barattolo da 500 ml che conteneva il liquido decellularization e la sostituzione con un vasetto sterile contenente fino a 1 litro di PBS sterile. Usa aspirazione vuoto per garantire le linee sono chiare d'aria. </li><li> Profumato PBS attraverso il sistema vascolare a 10-15 mmHg, nello stesso modo come per decellularization. Periodicamente, rimuovere i rifiuti dalla PBS bioreattore e sostituire e / o di riempire il vaso con PBS fresco, PBS sterile. Si consiglia di usare la tecnica sterile. </li><li> Continuare a sciacquare fino a quando almeno 2,5 l di PBS sterile hanno perfusi del polmone. </li><li> Trasferimento del polmone ad un nuovo sistema di bioreattore sterili contenenti PBS fresco. Assicurarsi che sia la perfusione intero ciclo e le linee aeree intero sono pieni di liquido. Tutte le fasi successive si utilizza una pompa di perfusione pulsatile i polmoni a 5ml/min. </li><li> Sterilizzare il patibolo, tramite perfusione durante la notte con PBS + 10% FBS + 10% pen-streptococco soluzione o per 3 ore con 0,1% di acido peracetico in PBS. Quest'ultimo necessita di risciacquo del polmone con 3 cambi di 250ml PBS per diverse ore per rimuovere l'acido residuo. Per ogni lavaggio, il polmone deve essere ventilato e perfuso per garantire che tutte le parti del tessuto perfetta efficienza. </li><li> Trasferire il polmone a 37 ° C in incubatore e profumato con PBS che ha il 10% FBS e il 10% penicillina / streptomicina per ~ 1 ora o fino a quando la temperatura è equilibrato, in preparazione per il trattamento benzonasi. </li><li> Trattare polmone con benzonasi per rimuovere il DNA residuo: <ol><li> Caldo il buffer benzonasi (vedi tabella dei reagenti) a 37 ° C. </li><li> Per ogni polmone, riempire una siringa da 10 ml con tampone benzonasi solo e una siringa da 10 ml con benzonasi 90U/ml nel buffer. </li><li> Interrompere la perfusione del polmone. </li><li> Gonfiare le vie aeree con tampone benzonasi. </li><li> Lasciare che il polmone a sgonfiarsi (per ~ 1 minuto). Poi, gonfiare il polmone con la soluzione benzonasi. Durante l'inflazione con il tampone benzonasi &amp; benzonasi, cercare di evitare di iniettare l'aria nei polmoni. </li><li> Lasciare che il polmone di sedersi senza perfusione o ventilazione a 37 ° C per 1 ora dopo il gonfiaggio con benzonasi. </li></ol></li><li> Riprendere con la perfusione + PBS 10% FBS, 10% penicillina / streptomicina che è già nel bioreattore, e continuare durante la notte. Il giorno seguente, il polmone può essere conservato a 4 ° C (per un massimo di 3 mesi) o preparati per la semina delle cellule. </li><li> Per preparare il patibolo per ripopolamento cellulare, sostituire la PBS / FBS / soluzione benzonasi con ~ 250 ml di terreno di coltura. Profumato per almeno un'ora prima che le cellule vengono introdotte, un° sostituzione con terreno di coltura fresco direttamente prima di seminare le cellule. </li></ol> 5. Recellularization La scelta della fonte di cellule per la nuova semina organo è lasciata ai singoli ricercatori. Molte fonti di cellule può essere utilizzata, comprese le popolazioni disponibili in commercio, appena isolate cellule neonatali o polmonare fetale, le cellule staminali embrionali, o cellule fonti disponibili in commercio. Protocolli di isolamento specifici per queste popolazioni di cellule può essere trovato altrove 4,5,6. Qui forniamo istruzioni su come semi sia le popolazioni delle cellule endoteliali ed epiteliali. Semina endoteliale: <ol><li> Preparare una sospensione di desiderato popolazione di cellule endoteliali, nel terreno di coltura appropriato. Cellula sospensione filtrare attraverso un colino per eliminare cellule 40um grumi di cellule. Una semina tipica endoteliali nel nostro laboratorio avrebbero utilizzato circa 30 milioni di ratto polmone cellule endoteliali microvascolari in 60ml di terreno di coltura. </li><li> Dispensare sospensione cellulare in un piccolo serbatoio temporaneamente incorporata nel ciclo perfusione del bioreattore (Figura 2). Assicurarsi che il tubo da questo serbatoio e l'intero ciclo di perfusione è chiaro di bolle d'aria. </li><li> Infondere cellule in arteria polmonare a 3ml/min utilizzando una pompa a rulli. </li><li> Dopo l'infusione delle cellule, continuare perfusione con mezzo di ricircolo dal bioreattore principale a frequenza desiderata. </li><li> Su base giornaliera, in modo che il tubo perfusione è chiaro di bolle d'aria. </li><li> Medio dovrebbe essere sostituito con mezzo fresco regolarmente, questo è spesso fatto ogni 3-4 giorni. </li></ol> Semina epiteliale: <ol><li> Preparare una sospensione di cellule della popolazione desiderata delle cellule epiteliali. Nel nostro laboratorio, questo consiste tipicamente di circa 50-100 milioni di cellule di ratto neonatale polmonare. Filtrare la popolazione attraverso il filtro delle cellule 40um e sospendere in 15ml di terreno di coltura in una siringa. Riempire il serbatoio delle vie aeree con 80ml di terreno di coltura. </li><li> Posizionare il bioreattore a 37 ° C tessuto cultura incubatore, e collegare la pompa a siringa per la ventilazione. Assicurarsi che tutte le linee sono chiare ventilazione di aria. <ol><li> Semi di cellule nel polmone, iniettando 15 ml di sospensione cellulare in un unico bolo nella cannula tracheale. </li><li> Iniziare immediatamente un unico respiro lento utilizzando la pompa a siringa. Questo respiro è amministrato da ritiro 60ml di aria dal bioreattore principale 3ml/minute, quindi della durata di circa 20 minuti. Assicurarsi che i filtri dell'aria sul bioreattore principale sono ricoperti immediatamente dopo l'iniezione e la sospensione cellulare prima di iniziare il respiro lento. </li></ol></li><li> Lasciare i polmoni di sedersi staticamente per circa 18hrs, e poi iniziare a lenta perfusione vascolare (circa 0,5 ml / min). </li></ol> 6. Organo Cultura Sebbene i dettagli di perfusione e ventilazione variano in base alla progettazione sperimentale, i seguenti punti sono noti: <ol><li> Durante cultura endoteliale, la perfusione è tipicamente effettuata a 1-3 ml / min con una pompa a rulli. Durante cultura epiteliale, la ventilazione è tipicamente fornita a un tasso costante di 1 respiro al minuto con una pompa a siringa. Ritiro di 5-10ml di aria dal bioreattore principale è in genere necessario effettuare la ventilazione polmonare a un volume normale di marea. A causa della necessità di mantenere la tenuta bioreattore durante la ventilazione, la ventilazione dovrebbe essere messo in pausa ogni giorno e l'aria nella camera principale dovrebbe essere scambiati. Tutta l'aria nel sistema è aria della stanza, che è circa il 21% di ossigeno a pressione parziale. Il 5-10ml di aria dal ritiro del bioreattore (che induce una 5-10ml ispirazione del fluido del polmone) si basa sulle dimensioni del polmone e quanti lobi vengono colti (lobi possono essere legati off per l'analisi, mentre il lobi rimanenti continuano a cultura). La quantità di aria ritirato dalla pompa siringa è scelto di approssimare il "volume corrente" del polmone colta. </li><li> Medio dovrebbe essere cambiato circa ogni 3-4 giorni durante cultura. </li><li> Durante la co-cultura di entrambe le epitelio ed endotelio, gli esperimenti di laboratorio nel nostro solito prima l'epitelio per 4-8 giorni, durante i quali è ventilato l'ingegneria tessutale. L'endotelio viene poi seminato attraverso perfusione, dopo di che il tessuto sia perfuso e ventilato. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Decellularization Quando il protocollo è eseguita correttamente, i polmoni appena estratti dovrebbe tenere l'aria senza perdite. Gonfiaggio con aria in immersione in un liquido può controllare questo - non ci dovrebbero essere tutte le bolle che indicano perdite d'aria. Il decellularization successivo dovrebbe consentire ~ 500 ml di liquido decellularization a fluire attraverso i polmoni, nel corso di 2,5 - 3 ore a 37 ° C, e PBS dovrebbe alla fine essere in grado di fluire attraverso i polmoni a circa 10 ml / min (sotto ~ 15 mm Hg della pressione idrostatica) alla fine del lavaggio. Dopo il trattamento con 0,1% di acido peracetico e benzonasi, i polmoni possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 3 mesi, e ancora adatto per recellularization. La matrice extracellulare decellularized finale deve essere completamente privo di materiali cellulari, e conservino le caratteristiche lordo, microscopica e ultrastrutturale del polmone nativo. Decellularization insufficiente o risciacquo può provocare resto DNA "attaccare" al patibolo, che può essere visualizzato con una standard e ematossilina eosina (vedi Figura 3 per il confronto). Ripopolamento di matrice acellulare e della cultura del tessuto polmonare Se le cellule vengono isolate da appena 7 giorni cuccioli di ratto vecchio neonatale, come descritto nel supplemento linea che accompagna il lavoro di Petersen e colleghi 4, ci si può aspettare una resa cellula di 120-150 milioni di cellule per ogni cucciolata di 10 cuccioli (poco più di 10 milioni celle per neonato). Condizioni ottimali per la semina delle cellule e la cultura successiva del polmone nel bioreattore dovrebbe produrre ben distribuita all'interno di tutte le cellule 5 lobi del polmone, e dovrebbe fornire una copertura di circa il 70% della matrice extracellulare patibolo (Figura 3). La popolazione di cellule in coltura sarà positiva per i principali marcatori delle cellule delle vie respiratorie, come pro-secretoria proteina-C (SPC), proteina secretoria delle cellule di Clara (CCSP), e aquaporin-5 (AQP), in ordine di abbondanza relativa (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Posizioni cannule e bioreattore decellularization <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Bioreattori usati per la semina e la cultura del tessuto polmonare ingegnerizzati <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Istologia di natale, decellularized, e ripopolata polmone <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Colorazione di immunofluorescenza per gli indicatori chiave del polmone

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LEN detiene azioni in Humacyte, una società di medicina rigenerativa. Humacyte non finanziare questi studi, e non hanno influenzato la progettazione, interpretazione o segnalazione di qualsiasi esperimenti o metodi descritti. Gli autori (LEN, THP, EAC) e Yale University hanno depositato una domanda di brevetto relative a ingegneria dei tessuti di polmoni.

Gli aspetti più critici del sistema indicati comprendono la manutenzione della sterilità, e un attento monitoraggio delle pressioni applicate al letto vascolare in tutto il processo di preparazione e semina il patibolo e la coltura del polmone ripopolato. La sterilità è meglio mantenuta in autoclave tutto il materiale prima dell&#39;uso, e montando il polmone in un sistema chiuso poco dopo l&#39;espianto ed evitare successive violazione di questa barriera. Dopo la matrice decellularized è stato accuratamente sciacquati e trasferito in un bioreattore sterile per la cultura, il tappo in silicone e altre guarnizioni e le connessioni non deve essere disturbato o rimosso. Per mantenere la pressione sotto controllo, il flusso spinto dalla forza di gravità è preferibile, quando possibile. Quando una pompa è richiesto per il ricircolo del liquido, a partire dopo il risciacquo con PBS e continua durante cultura, vi consigliamo direttamente la misurazione della pressione appena prima che il fluido entra l&#39;arteria polmonare con un trasduttore di pressione. L&#39;entità della pressione esercitata non deve superare i 15 mm Hg. Recellularized polmoni possono essere coltivate per diversi periodi di tempo, di solito vanno da 4 giorni fino a 3 settimane. Perfusione vascolare in genere viene eseguita a 1-3 ml / min durante cultura endoteliali, mentre la ventilazione è di norma applicato ad una velocità di 1 respiro / min durante cultura epiteliali. Durante i periodi di cultura combinato, ventilazione simultanea e perfusione è appropriata. Ventilazione può essere effettuata sia con mezzo liquido o aria. Nel corso degli ultimi decenni, diversi gruppi hanno fatto importanti lavori di ingegneria dei tessuti che mostrano la possibilità di differenziare l&#39;epitelio polmonare in vitro e di replicare diversi aspetti del polmone microanatomia 7,8,9, 10. Tuttavia, fino a poco tempo, nessuno di questi 4,5 tentativi di ingegnere tessuto polmonare ha portato ad un organo impiantabili che era in grado di mantenere la separazione tra il sangue e comparti delle vie aeree e che possono partecipare allo scambio di gas. Pertanto, anche se i metodi descritti sono solo un primo passo verso l&#39;obiettivo a lungo termine di produrre tessuto funzionale del polmone, questo lavoro è un passo incoraggiante verso la possibilità di aumentare la quantità di tessuto polmonare disponibili per il trapianto. Inoltre, questo lavoro elabora lavoro svolto dal Ott et al. Uygun e 11,12 e colleghi, che dimostrano l&#39;efficacia di una matrice extracellulare decellularized come impalcatura per l&#39;ingegneria dei tessuti complesse strutture tridimensionali e sostenere la crescita e la sopravvivenza di vari tipi di cellule . Questo lavoro è anche significativo per il suo contributo alla armamentario di cellule respiratorie e biologi molecolari. Fornendo un unico ambiente tridimensionale che può anche fornire adeguati stimoli meccanici, e che non condivide il rischio di compagno di una rapida de-differenziazione che si possono verificare durante roditore epitelio coltura in laboratorio con metodi più tradizionali 13, gli scienziati potrebbero usare il nostro sistema di approfondire la conoscenza dei interazioni cellula-cellula e cellula-matrice che svolgono un ruolo nella differenziazione cellulare e la funzione. Questa conoscenza può essere particolarmente potente se usato come leva per guidare il destino di diverse popolazioni di cellule staminali, come gruppo Cortiella ha dimostrato in studi iniziali 14.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Eutanasia </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio nitroprussiato </td><td> Fluka </td><td> 71778 </td><td></td></tr><tr><td> Euthasol eutanasia soluzione </td><td> Virbac AH </td><td> 710101 </td><td> 390 mg / ml soluzione madre di sodio pentobarbital deve essere diluita opportunamente per la somministrazione IP </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell Soluzione </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> AB01915 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-01 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Bioreattore Componenti </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 480 ml barattolo </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-3460560 </td><td></td></tr><tr><td> Tappo in silicone, taglia 14 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-26 </td><td></td></tr><tr><td> Y-connettori </td><td> Cole Parmer </td><td> DE-30614-08 </td><td> Utilizzato per cannule arteriose e tracheale </td></tr><tr><td> Tubi di silicone </td><td> Masterflex </td><td> 96420-14, 16 </td><td> L / S 14, 16 </td></tr><tr><td> Trasduttori di pressione </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX-212 </td><td></td></tr><tr><td> Valvola di ritegno </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-98553-20 </td><td> Valvola unidirezionale </td></tr><tr><td> 4-way rubinetti </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 594WSC </td><td></td></tr><tr><td> Siringa filtro </td><td> Cole Parmer </td><td> 2915-08 </td><td> PTFE, 0.2μm </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell e apparati risciacquo (integrazioni al bioreattore) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 e 1000 ml, bottiglie di vetro </td><td> Corning </td><td> 1395-500;-1L </td><td> Utilizzato per decell e risciacquo per gravità </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Benzonasi Trattamento </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> AB14043 </td><td> 1M, pH 8,0 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> JT Baker </td><td> 2444-01 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonasi nucleasi </td><td> Sigma </td><td> E1014 </td><td> Endonucleasi usato per rimuovere residui di DNA da matrici </td></tr></tbody></table>

procedura per l&#39;ingegneria del polmone

Procedure for Lung Engineering

Tessuto polmonare, tra cui il cancro al polmone e malattie polmonari croniche come la broncopneumopatia cronica ostruttiva, cumulativamente rappresentano circa 280.000 morti all&#39;anno; malattia polmonare ostruttiva cronica è attualmente la quarta causa di morte negli Stati Uniti 1. Contribuire a questo mortalità è il fatto che i polmoni in genere non riparare o rigenerare al di là del microscopico, a livello cellulare. Pertanto, tessuto polmonare che è danneggiato da degenerazione o infezione, o nel tessuto polmonare che è chirurgicamente resecato non è funzionalmente sostituito in vivo. Per esplorare se tessuto polmonare possono essere generati in vitro, abbiamo trattato polmoni di ratti adulti utilizzando una procedura che rimuove i componenti cellulari per produrre un acellulare polmone matrice extracellulare patibolo. Questa impalcatura mantiene le strutture gerarchiche ramificazione delle vie aeree e vasi, così come una membrana basale in gran parte intatta, che comprende collagene IV, laminina e fibronectina. Il ponteggio è montato in un bioreattore progettata per imitare gli aspetti critici della fisiologia del polmone, quali la ventilazione a pressione negativa e perfusione vascolare pulsatile. Da epitelio polmonare coltura ed endotelio vascolare all&#39;interno del bioreattore montato un&#39;impalcatura, siamo in grado di generare tessuto polmonare che è fenotipicamente paragonabile a tessuto polmonare nativa e che è in grado di partecipare allo scambio di gas per brevi intervalli di tempo (45-120 minuti). Questi risultati sono incoraggianti e suggeriscono che il ripopolamento del polmone matrice è una strategia praticabile per la rigenerazione del polmone. Questa possibilità rappresenta un&#39;opportunità non solo di lavorare per aumentare l&#39;offerta di tessuto polmonare per i trapianti, ma anche per lo studio delle cellule delle vie respiratorie e la biologia molecolare in vitro per periodi di tempo più lunghi e in un microambiente più accurata rispetto al passato possibile.

Abbiamo sviluppato una matrice extracellulare del polmone decellularized e bioreattore romanzo biomimetici che può essere utilizzato per generare il tessuto funzionale del polmone. Con la semina delle cellule e nella matrice coltura nel bioreattore, generiamo tessuto che dimostra efficace scambio di gas quando trapiantate in vivo per brevi periodi di tempo.

Procedura per l&#39;Ingegneria del polmone

Il tessuto polmonare, incluse le patologie come il tumore al polmone e le malattie polmonari croniche quali la broncopneumopatia cronica ostruttiva, rappresenta cumulativamente circa 280.000 decessi...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un tessuto polmonare in coltura che sia morfologicamente e fisiologicamente paragonabile al tessuto polmonare nativo. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando il cuore e i polmoni da un ratto adulto. Il passaggio successivo consiste nel cannuccolare l'arteria polmonare e la trachea e nel collegare i polmoni cannucciati a un biorreattore per la decellularizzazione.Dopo la descelularizzazione e il risciacquo, il polmone viene trasferito in un bioreattore sterile per colture e preparato per il seeding. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'inoculare il comparto desiderato del polmone con una popolazione cellulare preparata. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano la matrice extracellulare descelularizzata efficientemente ripopolata con cellule che esprimono marcatori specifici regionali del polmone, mediante microscopia a fluorescenza immunoistochimica.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per la coltivazione di cellule polmonari in vitro è che le cellule mantengono fenotipi differenziati per un periodo prolungato, consentendone lo studio per diverse settimane all'interno di un substrato biologico tridimensionale. Per la decellularizzazione, i polmoni vengono collegati al cappuccio del biorreattore tramite la cannula vascolare, e il cappuccio viene collegato all'apparato di decellularizzazione. La bottiglia di vetro posizionata sopra i polmoni è tenuta ferma da un sostegno ad anello e da una pinza fissata.A questo punto, il materiale cellulare può essere rimosso per produrre un impalcatura di matrice extracellulare, che può essere ripopolata con materiale cellulare. L'assemblaggio del bioreattore per la semina e la coltura del tessuto polmonare ingegnerizzato è mostrato in questo diagramma. Il connettore a baionetta della cannula tracheale si collega a un circuito respiratorio tra la riserva della trachea e la camera principale.Il circuito respiratorio comprende due valvole unidirezionali. Le posizioni sono tali per cui il mezzo segue un percorso diverso in entrata e in uscita dal polmone. Un piccolo serbatoio è temporaneamente incorporato nella linea di perfusione per il seeding delle cellule endoteliali.Una pompa pulsatile viene utilizzata per trasportare le cellule dal serbatoio al compartimento vascolare del polmone. La perfusione vascolare è garantita mediante una pompa a rulli. Il mezzo di coltura viene perfuso nell'arteria polmonare attraverso la cannula collegata, scorre attraverso la vascolarizzazione polmonare ed esce dalla vena polmonare direttamente nel bioreattore principale, dove il mezzo viene aspirato per la perfusione.L'epitelio polmonare viene posizionato mediante iniezione nel circuito respiratorio. La camera principale contenente il polmone e la riserva di trachea viene utilizzata per la coltura polmonare a lungo termine. Dopo l'estrazione dei polmoni e la corretta canulazione dell'arteria e della trachea, i polmoni appena estratti dovrebbero trattenere l'aria senza perdite.Questo può essere verificato gonfiandoli con aria mentre sono immersi in un liquido. Non devono essere presenti bolle che indichino perdite d'aria. Per iniziare il protocollo, i polmoni vengono gonfiati con PBS contenente nitroprussiato di sodio fino a quando non sono pieni, ma non sovragonfiati; immediatamente si chiude il cannula tracheale in modo che i polmoni rimangano gonfi.Successivamente, perfondere i polmoni con PBS e SNP per almeno 15 minuti a 15 millimetri di mercurio. Dopodiché, rimuovere il tappo dalla cannula tracheale per permettere ai polmoni di sgonfiarsi. Continuare la perfusione con PBS e SNP per 15-30 minuti, se necessario.Riempire nuovamente con PBS e SNP per garantire che la pressione di perfusione sia mantenuta tra 10 e 15 millimetri di mercurio. Per iniziare la procedura di decellularizzazione prolungata, il cappuccio del bioreattore viene collegato all'apparato di decellularizzazione. Successivamente, i polmoni vengono collegati al cappuccio.Utilizzando i collegamenti a bloccaggio dell'esca collegati alla cannula a forma di YS, la cannula dell'arteria polmonare deve essere connessa alla linea di perfusione, mentre la cannula tracheale deve rimanere libera. Per garantire una completa descellularizzazione del tessuto, è fondamentale mantenere l'aria fuori dal sistema. Le valvole unidirezionali presenti nella cannula arteriosa e in quella tracheale contribuiscono a rimuovere le bolle d'aria dai tubi consentendo un flusso inverso all'interno dei tubi stessi.Pertanto, consentire la rimozione delle bolle d'aria mediante siringa, assicurarsi che tutte le linee siano libere da aria. Iniziare la perfusione con la soluzione di descellularizzazione. Perfuso con soluzione di descellularizzazione.Fino a quando 500 millilitri di soluzione non sono perfusi attraverso i polmoni, la pressione ottimale è inferiore a 15 millimetri di mercurio. Ciò richiederà tipicamente 2,5 ore. Le velocità di flusso sono inizialmente molto lente e aumentano rapidamente durante la seconda ora fino a raggiungere circa un millilitro al minuto o superiore.Durante la perfusione, rimuovere periodicamente il fluido di descellularizzazione dal bioricettacolo, assicurandosi che rimanga una quantità sufficiente di liquido per sostenere il polmone e la cannula tracheale. Al termine della perfusione con il fluido di descellularizzazione, trasferire i polmoni e il bioricettacolo in una cappa a flusso laminare per colture cellulari. Per iniziare il risciacquo dell'organo, rimuovere il barattolo da 500 millilitri contenente il fluido di descellularizzazione e sostituirlo con un barattolo sterile contenente fino a un litro di PBS sterile.Utilizzare l'aspirazione a vuoto o una siringa per assicurarsi che i tubi siano privi di aria ed eseguire la perfusione di PBS attraverso la vascolarizzazione a 10-15 millimetri di mercurio, nello stesso modo. Per quanto riguarda la descellularizzazione, utilizzando tecniche sterili, rimuovere periodicamente il PBS di scarto dal biorreattore e sostituire o riempire il contenitore di PBS. Continuare a lavare con PBS fresco e sterile fino a quando almeno 2,5 litri di PBS sterile non abbiano perfuso i polmoni.Questo richiederà tipicamente due giorni a partire dall'inizio del processo di descellularizzazione, una volta completato il risciacquo. Trasferire i polmoni in un nuovo sistema di bioreattore sterile contenente PBS fresco più 10% FBS più 10% Pen strep, assicurandosi che sia l'intero circuito di perfusione sia l'intere linee delle vie aeree siano riempite di liquido. Da questo momento in poi verrà utilizzata una pompa pulsatile per perfondere i polmoni a cinque millimetri al minuto.Sterilizzare lo scaffold della matrice extracellulare polmonare mediante perfusione notturna con PBS contenente 10% di FBS e 10% di penicillina-streptomicina. Al termine di questo passaggio, trasferire i polmoni in un incubatore a 37 gradi Celsius per un'ora o fino al raggiungimento dell'equilibrio termico. In preparazione al trattamento con Ben Nase, il passaggio successivo consiste nel trattare i polmoni con Ben Nase.Per rimuovere il DNA residuo da ciascun polmone, riempire prima una siringa da 10 millilitri solo con il buffer Prewarm Ben Nase e una siringa da 10 millilitri con 90 unità per millilitro di Ben Nase diluito nel buffer Ben Nase. Arrestare la perfusione dei polmoni.Quindi gonfiare le vie aeree con il buffer Ben Nase evitando di iniettare aria nel polmone. Lasciare sgonfiare il polmone per un minuto. Successivamente, gonfiare il polmone con la soluzione Ben Nase.Anche in questo caso, fare attenzione a non introdurre aria nel polmone dopo averlo gonfiato con Ben Nase. Lasciare i polmoni a riposo senza perfusione o ventilazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'ora, riprendere la perfusione con il PBS più 10% FBS e 10% penicillina-streptomicina già presente nel biorreattore e continuare la perfusione per tutta la notte fino al giorno seguente.Dopo il risciacquo e la sterilizzazione, la lunga matrice extracellulare può essere preparata per la ripopolazione cellulare. Sostituire la soluzione di P-B-S-F-B-S benzo a con 250 millilitri di mezzo di coltura. Permettere la perfusione per almeno un'ora prima dell'introduzione delle cellule e sostituire con mezzo di coltura fresco immediatamente prima della semina delle cellule.È possibile utilizzare diverse fonti cellulari per la rigenerazione degli organi. In questo caso, verrà dimostrato l'impiego di una popolazione di cellule epiteliali. Per prima cosa, preparare una siringa contenente 15 millilitri di una sospensione cellulare della popolazione desiderata di cellule epiteliali.Successivamente, riempire il serbatoio dell'aria con 80 millilitri di mezzo di coltura e assicurarsi che tutte le linee di ventilazione siano libere da aria. Quindi posizionare il bioreattore in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e collegare la pompa a siringa per la ventilazione. Seminare le cellule nei polmoni utilizzando un'unica iniezione rapida, iniettando la sospensione cellulare da 15 millilitri nella cannula tracheale.Assicurarsi che i filtri dell'aria sul biorreattore principale siano chiusi. Quindi iniziare immediatamente un'unica inspirazione lenta utilizzando la pompa a siringa per prelevare 60 millilitri di aria dal biorreattore principale a una velocità di tre millilitri al minuto. Questa operazione durerà circa 20 minuti.Lasciare i polmoni a riposo in modo statico per circa 18 ore dopo tale procedura. Iniziare la perfusione vascolare lenta a circa 0,5 millilitri al minuto. Durante la coltura dell'organo, la perfusione viene generalmente eseguita da uno a tre millilitri al minuto.Utilizzando una pompa a rulli durante la coltura epiteliale, la ventilazione viene tipicamente fornita a un ritmo continuo di un respiro al minuto e con un volume corrente compreso tra cinque e dieci millilitri. Utilizzando una pompa per siringa, l'aria viene periodicamente aspirata e iniettata nel bioreattore per simulare la respirazione alternando tra pressione negativa e pressione atmosferica all'interno della camera principale. A causa della necessità di mantenere il bioreattore ermetico durante la ventilazione, la ventilazione deve essere sospesa quotidianamente e l'aria nella camera principale deve essere sostituita.Inoltre, il mezzo dovrebbe essere cambiato circa ogni tre o quattro giorni. Durante la coltura, ogni volta dovrebbe essere scambiata circa la metà del volume totale mediante la coltivazione dell'epitelio polmonare e dell'endotelio vascolare. All'interno dello scaffold montato nel biorreattore, siamo in grado di generare tessuto polmonare capace di partecipare allo scambio gassoso per brevi intervalli di tempo.Viene mostrata qui una colorazione standard ematossilina, eosina e eosina di un polmone di ratto nativo, a scopo comparativo con una colorazione ematossilina e eosina (H e E) di un polmone di ratto descellularizzato. La matrice extracellulare descellularizzata finale dovrebbe essere completamente priva di materiali cellulari e mantenere le caratteristiche macroscopiche, microscopiche e ultrastrutturali del polmone nativo. La colorazione H e E permetterà la visualizzazione di qualsiasi residuo di DNA aderente allo scaffold a causa di una descellularizzazione o di un risciacquo insufficienti, condizioni ottimali per la semina cellulare e la successiva coltura del polmone.E il bioreattore dovrebbe produrre cellule ben distribuite all'interno di tutti e cinque i lobi del polmone e garantire una copertura di circa il 70% della matrice extracellulare. Queste immagini confrontano il polmone nativo con il polmone ripopolato, colorato mediante immunofluorescenza. Per i principali marcatori polmonari, la popolazione cellulare coltivata risulta positiva per la proteina segretoria delle cellule di Clara, la proteina segretoria pro C e l'acquaporina cinque.I marcatori di interesse sono mostrati in rosso e i nuclei colorati con DAPI sono in blu in tutti i pannelli. Una volta padroneggiata questa procedura, dalla descelularizzazione al reimpiego, può essere completata in quattro o cinque giorni se eseguita correttamente.

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