Procedura per l'Ingegneria del polmone

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare tessuto polmonare in coltura che sia morfologicamente e fisiologicamente paragonabile al tessuto polmonare nativo. Ciò si ottiene prelevando prima il cuore e i polmoni da un ratto adulto. Il passo successivo consiste nell'incannulare l'arteria polmonare e la trachea e nel collegare i polmoni cannulati a un bioreattore per la decellularizzazione.

Dopo la decellularizzazione e il risciacquo, il polmone viene trasferito in un bioreattore di coltura sterile e preparato per la seduta. La fase finale della procedura consiste nel seminare il compartimento polmonare desiderato con una popolazione cellulare preparata. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano che la matrice extracellulare decellularizzata viene ripopolata in modo efficiente con cellule che esprimono marcatori polmonari specifici a livello regionale attraverso la microscopia a immunofluorescenza.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di coltura di cellule polmonari in vitro è che le cellule mantengono fenotipi differenziati per un lungo periodo di tempo, in modo da poter essere studiate per diverse settimane in un substrato tridimensionale di derivazione biologica. Per la decellularizzazione, i polmoni sono collegati al cappuccio del bioreattore tramite la cannula vascolare e il cappuccio è collegato all'apparato di decellularizzazione. La bottiglia di vetro sopra i polmoni è tenuta in posizione da un supporto ad anelli e da un morsetto attaccato.

A questo punto, il materiale cellulare può essere rimosso per produrre un'impalcatura di matrice extracellulare, che può essere ripopolata con materiale cellulare. L'assemblaggio del bioreattore per la semina e la coltura del tessuto polmonare ingegnerizzato è mostrato in questo diagramma. Il connettore di blocco dell'esca della cannula tracheale si collega a un circuito di respirazione tra il serbatoio della trachea e la camera principale.

L'ansa respiratoria comprende due valvole unidirezionali. Posiziona in modo tale che il mezzo segua un percorso diverso dentro e fuori dal polmone. Un piccolo serbatoio è temporaneamente incorporato nella linea di perfusione per la semina delle cellule endoteliali.

Una pompa pulsatile viene utilizzata per trasportare le cellule dal serbatoio al compartimento vascolare del polmone. La perfusione vascolare viene fornita utilizzando una pompa a rulli. Il terreno viene perfuso nell'arteria polmonare tramite la cannula collegata, scorre attraverso il sistema vascolare polmonare e fuoriesce dalla vena polmonare direttamente nel bioreattore principale dove viene prelevato il terreno per la perfusione.

L'epitelio polmonare viene inserito mediante iniezione nel circuito respiratorio. La camera principale contenente il polmone e il serbatoio della trachea sono utilizzati per la coltura polmonare a lungo termine. Quando i polmoni sono stati estratti e l'arteria e la trachea sono cannulate correttamente, i polmoni appena estratti dovrebbero trattenere l'aria senza perdite.

Questo può essere verificato gonfiandoli con aria mentre sono immersi in un liquido. Non dovrebbero esserci bolle che indichino perdite d'aria. Per iniziare il protocollo, i polmoni vengono gonfiati con PBS contenente nitropressa di sodio lato fino a quando i polmoni non sono pieni, ma non gonfiati eccessivamente, tappare immediatamente la cannula tracheale in modo che i polmoni rimangano gonfiati.

Successivamente, perfondere i polmoni con PBS e SNP per almeno 15 minuti a 15 millimetri di mercurio. Successivamente, rimuovere il tappo dalla cannula tracheale per consentire ai polmoni di sgonfiarsi. Continuare la perfusione con PBS e SNP per 15-30 minuti, se necessario.

Riempire PBS e SNP per garantire che la pressione di profusione sia mantenuta a 10-15 millimetri di mercurio. Per iniziare la procedura di decellularizzazione lunga, il tappo del bioreattore viene collegato all'apparato di decellularizzazione. Quindi i polmoni sono collegati al tappo.

Utilizzando le connessioni di blocco dell'esca collegate alla cannula a forma di YS, la cannula dell'arteria polmonare deve collegarsi alla linea di perfusione e la cannula tracheale deve galleggiare liberamente. Per garantire la completa decellularizzazione del tessuto, è fondamentale mantenere l'aria fuori dal sistema. Le valvole unidirezionali nella cannula arteriosa e tracheale aiutano a eliminare le bolle d'aria nel tubo consentendo l'inversione del flusso nel tubo.

Pertanto, consentendo la rimozione delle bolle d'aria con la siringa, assicurarsi che tutte le linee siano libere dall'aria. Iniziare la perfusione con la soluzione di decellularizzazione. Perfuso con soluzione di decellularizzazione.

Fino a quando 500 millilitri di soluzione non si sono perfusi attraverso i polmoni, la pressione ottimale è inferiore a 15 millimetri di mercurio. Ciò richiede in genere 2,5 ore. Le portate sono in genere molto lente inizialmente e aumentano rapidamente durante la seconda ora fino a circa un millilitro al minuto o più.

Durante la perfusione periodicamente rimossa, è stato utilizzato il liquido di decellularizzazione dal bioreattore, garantendo al contempo che rimanga abbastanza liquido per sostenere il polmone e la cannula tracheale. Quando la perfusione con il liquido di decellularizzazione è completa, trasferire i polmoni e il bioreattore in una cappa di coltura tissutale. Per iniziare il risciacquo degli organi, rimuovere il barattolo da 500 millilitri che contiene il liquido di decellularizzazione e sostituirlo con un barattolo sterile contenente fino a un litro di PBS sterile.

Utilizzare l'aspirazione a vuoto o una siringa per assicurarsi che le linee siano libere dall'aria per perfondere il PBS attraverso il sistema vascolare a 10-15 millimetri di mercurio allo stesso modo. Per quanto riguarda la decellularizzazione, utilizzando tecniche sterili si rimuovono periodicamente i residui di PBS dal bioreattore e si sostituisce o si riempie nuovamente il barattolo di PBS. Con PBS fresco e sterile, continuare a risciacquare fino a quando almeno 2,5 litri di PBS sterile hanno perfuso i polmoni.

Questo in genere richiede due giorni dall'inizio del processo di decellularizzazione, quando il risciacquo è completo. Il trasferimento dei polmoni in un nuovo sistema di bioreattore sterile contenente PBS fresco più il 10% di FBS e il 10% di streptococco Pen assicurano che sia l'intero ciclo di perfusione che le intere linee delle vie aeree siano riempite di liquido. Da qui in poi verrà utilizzata una pompa pulsatile per perfondere i polmoni a cinque millimetri al minuto.

Sterilizzare l'impalcatura della matrice extracellulare polmonare mediante perfusione notturna con PBS che contiene il 10% di FBS e il 10% di streptomicina penicillina. Dopo aver completato questo passaggio, trasferire i polmoni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora o fino a quando la temperatura non si sarà stabilizzata. In preparazione al trattamento con Ben Nase, il passo successivo è quello di trattare i polmoni con Ben Nase.

Per rimuovere il DNA residuo per ciascun polmone, riempire prima una siringa da 10 millilitri con solo tampone Prewarm Ben Nase e una siringa da 10 millilitri con 90 unità per millilitro. Ben Nase diluito in tampone Ben Nase. Fermare la perfusione dei polmoni.

Quindi gonfiare le vie aeree con tampone Ben Nase evitando di iniettare aria nel polmone. Lasciare sgonfiare il polmone per un minuto. Quindi gonfiare il polmone con la soluzione di Ben Nase.

Ancora una volta, facendo attenzione a non introdurre aria nel polmone dopo aver gonfiato con Ben Nase. Lasciare riposare i polmoni senza perfusione o ventilazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'ora riprendere la perfusione con il PBS più il 10% di FBS e il 10% di penicillina streptomicina già presente nel bioreattore, e continuare la perfusione durante la notte del giorno successivo.

Dopo il risciacquo e la sterilizzazione, il lungo scaffold della matrice extracellulare può essere preparato per il ripopolamento cellulare. Sostituire la soluzione di benzo B-B-S-F-B-S con 250 millilitri di coltura. Coltivare il terreno per almeno un'ora prima dell'introduzione delle cellule e sostituirlo con terreno di coltura fresco direttamente prima della semina delle cellule.

Molte fonti cellulari possono essere utilizzate per la ritirata degli organi. Qui verrà dimostrata la seduta con una popolazione di cellule epiteliali. Per prima cosa, preparare una siringa contenente 15 millilitri di una sospensione cellulare della popolazione di cellule epiteliali desiderata.

Quindi, riempire il serbatoio delle vie aeree con 80 millilitri di terreno di coltura e assicurarsi che tutte le linee di ventilazione siano libere dall'aria. Quindi posizionare il bioreattore in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius e collegare la pompa a siringa per la ventilazione. Seminare le cellule nei polmoni utilizzando un singolo bolo rapido iniettando la sospensione cellulare da 15 millilitri nella cannula tracheale.

Assicurarsi che i filtri dell'aria sul bioreattore principale siano chiusi. Quindi iniziare immediatamente un singolo respiro lento utilizzando la pompa a siringa per prelevare 60 millilitri di aria dal bioreattore principale a tre millilitri al minuto. Questo durerà circa 20 minuti.

Lasciare che i polmoni rimangano statici per circa 18 ore. Iniziare la perfusione vascolare lenta a circa 0,5 millilitri al minuto. Durante la coltura d'organo, la perfusione viene in genere eseguita da uno a tre millilitri al minuto.

Utilizzando una pompa a rulli durante la coltura epiteliale, la ventilazione viene in genere fornita a una velocità continua di un respiro al minuto e un volume corrente da cinque a 10 millilitri. Utilizzando una pompa a siringa, l'aria viene ciclicamente prelevata e iniettata nel bioreattore per influenzare la respirazione alternando pressione negativa e pressione atmosferica all'interno della camera principale. A causa della necessità di mantenere il bioreattore ermetico durante la ventilazione, la ventilazione deve essere sospesa quotidianamente e l'aria nella camera principale deve essere scambiata.

Inoltre, il mezzo deve essere cambiato circa ogni tre o quattro giorni. Durante la coltura, circa la metà del volume totale deve essere sostituita ogni volta mediante coltura dell'epitelio polmonare e dell'endotelio vascolare. All'interno dello scaffold montato sul bioreattore, siamo in grado di generare tessuto polmonare in grado di partecipare allo scambio di gas per brevi intervalli di tempo.

Una colorazione standard di emato, toin ed eoin del polmone di ratto nativo è mostrata qui per il confronto con una colorazione H ed e di un polmone di ratto decellularizzato. La matrice extracellulare decellularizzata finale deve essere completamente priva di materiali cellulari e mantenere le caratteristiche macroscopiche, microscopiche e ultra strutturali del polmone nativo. La colorazione h ed e consentirà la visualizzazione di qualsiasi DNA residuo, che si attacca all'impalcatura a causa di una decellularizzazione o di un risciacquo insufficienti, condizioni ottimali per la semina cellulare e la successiva coltura del polmone.

E il bioreattore dovrebbe produrre cellule ben distribuite all'interno di tutti e cinque i lobi del polmone e dovrebbe fornire una copertura di circa il 70% dell'impalcatura della matrice extracellulare. Queste immagini confrontano il polmone nativo con il polmone ripopolato quando colorato mediante immunofluorescenza. Per i marcatori polmonari chiave, la popolazione di cellule in coltura è positiva per la proteina secretoria delle cellule Clara pro la proteina secrezionale C e l'acquaporina cinque.

I marcatori di interesse sono mostrati in rosso e i nuclei colorati DAPI sono in blu in tutti i pannelli. Una volta padroneggiata questa procedura, dalla decellularizzazione alla ritirata, può essere eseguita in quattro o cinque giorni se eseguita correttamente.