Trapianto di polmone bioingegnerizzato utilizzando polmoni di topo decellularizzati e cellule endoteliali umane primarie

La bioingegneria degli organi di dimensioni umane richiede una grande quantità di risorse, che spesso supera la capacità dei laboratori accademici. La riduzione dei costi dello sviluppo di protocolli iterativi accelererà il progresso della ricerca in questo campo. Lo scopo di questo studio è fornire il protocollo standardizzato per la bioingegneria polmonare utilizzando blocchi cuore-polmone di topo. Non è ancora noto quali cellule siano appropriate per la bioingegneria degli organi e come tali cellule dovrebbero essere integrate nella coltura del bioreattore d'organo. È necessario confrontare più tipi di cellule e condizioni per stabilire protocolli scalabili e riproducibili.

I topi sono animali da esperimento piccoli e facili da maneggiare. Tuttavia, sebbene siano piccoli, l'architettura di base del polmone è simile tra i mammiferi. Ottimizzando il protocollo su questa piccola piattaforma, possiamo ingrandire i modelli di animali laser semplicemente moltiplicando i risultati ottimizzati in base alle dimensioni degli animali. Questa piattaforma di bioingegneria polmonare delle dimensioni di un topo consente ai ricercatori di testare le loro cellule staminali in modo efficiente. Queste cellule geneticamente modificate possono essere preziose o costose da utilizzare per l'intera ingegneria polmonare. Inoltre, le cellule derivate dai pazienti possono essere utilizzate anche per creare modelli di malattia in vitro.

Gli sforzi attuali riguardano la sperimentazione di più tipi di cellule staminali ingegnerizzate e cellule progenitrici, per capire il potenziale di proliferazione richiesto e la capacità differenziale per la bioingegneria polmonare. Una volta identificate le cellule adatte, questa ricerca sarà estesa a un modello animale più grande come quello suino.

[Narratore] Per iniziare, posiziona il topo soppresso in posizione supina su un tavolo chirurgico e fissa gli arti. Spruzzare uniformemente etanolo al 70% sul torace e sulla superficie addominale per sterilizzarlo. Successivamente, apri la cavità addominale lungo la linea mediana che si estende fino al collo, usando le forbici inossidabili, e spacca lo sterno. Resecare il diaframma dalla parete toracica. Tagliare la parete toracica ventrale per esporre le cavità toraciche e rimuovere il timo. Utilizzando una sutura di seta 4/0, legare la vena cava inferiore e la vena cava superiore destra. Tagliare l'aorta addominale con forbici inossidabili per il drenaggio. Utilizzando una siringa sterile da cinque millilitri dotata di un ago calibro 27, iniettare tre millilitri di PBS sterile nel ventricolo destro perforando la parete del ventricolo. Usa la pinza Dumont per avvolgere una sutura di seta 4/0 attorno all'arteria polmonare principale. Quindi, tagliare una finestra di due millimetri sotto le valvole dell'arteria polmonare, usando le forbici a molla, per accedere alla parete del ventricolo destro. Inserire il catetere dell'arteria polmonare attraverso la finestra e fissarlo con la sutura di seta 4/0 pre-avvolta. Iniettare lentamente due millilitri di PBS attraverso il catetere dell'arteria polmonare, utilizzando una siringa da cinque millilitri. Incannulare la trachea con un catetere tracheale e legarla in posizione con una sutura di seta 4/0. Ora, iniettare lentamente due millilitri di aria attraverso il catetere tracheale utilizzando una siringa vuota da cinque millilitri. Trattenere l'aria per 10 secondi per assicurarsi che non vi siano perdite d'aria dai polmoni. Rimuovere il blocco terminale del cuore e dei polmoni. Successivamente, trasferire il blocco cuore-polmone resecato in una capsula di Petri di plastica di 10 centimetri di diametro contenente acqua deionizzata, per la decellularizzazione dei polmoni. Incubare il blocco per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, utilizzando una siringa da cinque millilitri, iniettare tre volte due millilitri di acqua deionizzata sterile attraverso il catetere tracheale. Fare una pausa dopo ogni iniezione per consentire al liquido di fuoriuscire mentre i polmoni si ritraggono indietro. Allo stesso modo, iniettare due millilitri di acqua attraverso il catetere dell'arteria polmonare. Iniettare due millilitri di soluzione di Triton X-100 allo 0,1% nei cateteri dell'arteria tracheale e polmonare. Trasferire il blocco cuore-polmone in una capsula di Petri e incubare staticamente nella soluzione Triton X-100 per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, per rimuovere la soluzione di Triton X-100 dai polmoni, iniettare due millilitri di acqua deionizzata nel catetere tracheale e nel catetere dell'arteria polmonare e ripetere l'operazione con due millilitri di soluzione desossicolato al 2%. Dopo aver rimosso la soluzione desossicolata dai polmoni, iniettare due millilitri di soluzione di cloruro di sodio molare nei cateteri dell'arteria tracheale e polmonare. Incubare il blocco cuore-polmone per un'ora. Dopo aver rimosso la soluzione di cloruro di sodio con acqua deionizzata, iniettare due millilitri di soluzione di lavoro DNasi I nei cateteri dell'arteria tracheale e polmonare. Incubare il blocco cuore-polmone per un'ora. Iniettare PBS sterile nei cateteri dell'arteria tracheale e polmonare per rimuovere la soluzione di DNasi I. Dopo la decellularizzazione, verificare che i polmoni siano bianchi e trasparenti ai bordi. Aggiungere 70 millilitri di terreno di coltura EGM-2 (terreno di coltura EGM-2) al contenitore di vetro e posizionare il tappo di silicone sopra il contenitore per sigillarlo. Assemblare un tappo in silicone, un contenitore di vetro, un tappo a vite GL45 con tubo, una bottiglia di vetro autoclavabile da 250 millilitri e un tubo L/S 14 con raccordi per esche utilizzando rubinetti a tre vie. Inserire un ago calibro 20 nel setto di silicone del tappo a vite GL45. Riempire i tubi A, B e C con terreni di coltura utilizzando una siringa da 10 millilitri collegata ai rubinetti uno e tre. Collegare il catetere arterioso polmonare del blocco cuore-polmone decellularizzato al tubo C tramite un raccordo per esche. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria nel catetere o nel tubo. Per l'iniezione per gravità di cellule endoteliali, posizionare un serbatoio cellulare contenente cellule endoteliali della vena ombelicale umana, o HUVEC, su un agitatore magnetico, assicurandosi che il serbatoio si trovi a 30 centimetri sopra la camera dell'organo. Accendere l'agitatore magnetico a una velocità di 120 giri/min. Aprire i rubinetti uno e due per consentire alla sospensione cellulare di fluire nell'impalcatura decellularizzata, tramite il tubo A, il tubo C e il catetere dell'arteria polmonare. Per la perfusione della coltura d'organo, posizionare la camera d'organo in un incubatore ad anidride carbonica. Collegare il tubo B a una testa della pompa collegata a una pompa pulsatile. Chiudere lo sportello in vetro dell'incubatrice. Assicurarsi che il tubo sia posizionato correttamente tra la porta e la guarnizione in gomma. Incubare l'impalcatura decellularizzata a 37 gradi Celsius per tre ore per consentire alle cellule endoteliali di stabilirsi all'interno dell'impalcatura. Avviare la pompa a una velocità di sei giri/min, ottenendo una perfusione del fluido di due millilitri al minuto utilizzando tubi L/S 14. Osservare il polmone decellularizzato che si espande leggermente a causa della perfusione mediatica. Quindi, chiudere lo sportello dell'incubatrice. Per eseguire la sostituzione del fluido, arrestare l'azionamento della pompa. Collegare una siringa sterile da 50 millilitri al rubinetto tre ed estrarre 50 millilitri di terreno dalla camera. Riempire un'altra siringa sterile da 50 millilitri con 50 millilitri di terreno preriscaldato. Iniettare la soluzione in un contenitore di vetro e trasferire il fluido nella camera tramite il rubinetto tre, assicurandosi che il rubinetto sia commutato correttamente. Riavviare la pompa pulsatile. Prelevare il blocco cuore-polmone ricullularizzato dopo due giorni di coltura di organi di perfusione. I polmoni di topo apparivano bianchi e traslucidi dopo la decellularizzazione, indicando la rimozione dei componenti cellulari, pur preservando la struttura polmonare complessiva. L'analisi istologica dei polmoni di topo decellularizzati ha rivelato strutture alveolari intatte, senza componenti cellulari rimanenti. I polmoni dei topi ricellularizzati con tre volte 10 alla potenza di sette HUVEC dopo due giorni di coltura del bioreattore basata sulla perfusione, hanno mostrato una distribuzione omogenea di HUVEC. Gli HUVEC sono migrati nelle aree alveolari periferiche, formando una rete simile a quella dei capillari, come osservato nei polmoni recullulari.