PGS elastomerico Ponteggi in Ingegneria tessuto arterioso

Questo video mostra come fabbricare scaffold tubolari porosi e sottoporli a un condizionamento meccanico dinamico per l'ingegneria dei tessuti arteriosi. Questo risultato si ottiene innanzitutto fabbricando gli scaffold utilizzando un elastomero biodegradabile e il metodo di fusione per assalto. Gli scaffold vengono quindi preparati per la semina cellulare e assemblati in un sistema di bioreattore.

Nel bioreattore, le cellule muscolari lisce vascolari colonizzano gli scaffold e vengono coltivate. Settimane dopo, il tessuto viene raccolto e analizzato mediante microscopia elettronica a scansione, colorazione ematossilina ed eosina e autofluorescenza dell'elastina. Il muscolo liscio risultante è sia multistratificato che orientato perpendicolarmente.

Il principale vantaggio di questa tecnica, simile alla sbiancatura particellare, consiste nell'utilizzare lo stampo in vetro per fabbricare uno scaffold tubolare poroso in acido ialuronico. Una volta rimosso lo stampo, lo scaffold viene preparato a partire da un pezzo di tubo di vetro. Posizionare il tubo in un supporto e versare all'interno la soluzione di acido ialuronico preparata il giorno precedente.

L'acido ialuronico scorre lentamente lungo la parete interna. Quando raggiunge il fondo dello stampo, capovolgere lo stampo. Ripetere questo passaggio fino a quando la parete interna dello stampo non è uniformemente ricoperta dalla soluzione.

Dopo il rivestimento, asciugare tutti gli stampi di vetro preparati in un forno a vuoto a 37 gradi Celsius per 24 ore. Solitamente, vengono preparati contemporaneamente quattro stampi mentre gli stampi di vetro si asciugano. Preparare le polveri di particelle di sale, macinare e setacciare le particelle di sale a 25-32 micrometri.

Il giorno successivo, assemblare il mandrino in vetro preparato, il tubo in PTFE, la guaina termorestringente e l'anello in PTFE. In primo luogo, inserire il mandrino in tratti di tubo in PTFE lunghi 65 millimetri e cuocerli a 120 gradi Celsius per cinque minuti. Mentre si attende che il PTFE si restringa, preriscaldare un incubatore per ibridazione a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti.

Dopo che il tubo ha ricoperto completamente i mandrini, posizionare il manicotto termoretraibile sul mandrino in modo che possa muoversi liberamente. Quindi inserire il mandrino all'interno dello stampo di vetro e fissare l'anello A-P-T-F-E alla base del mandrino. Verificare che l'anello in PTFE sia ben aderente alla base dello stampo di vetro.

Successivamente, utilizzando una spatola e un imbuto in gomma siliconica, aggiungere le poltiglie di particelle di sale nello stampo di vetro. Quindi battere leggermente lo stampo con la spatola per ottenere una distribuzione uniforme delle particelle ed eliminare l'eccesso di sale. Spegnere ora l'incubatrice riscaldata e caricarla rapidamente con gli stampi riempiti di sale; il sale si fonderà nei successivi 30 minuti, dopodiché asciugare gli stampi in un forno a vuoto a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno successivo al raffreddamento, rimuovere il mandrino in acciaio inossidabile dagli stampi spingendolo verso l'esterno mentre si tiene fermo l'anello in PTFE. Se necessario, utilizzare una pinza a becco lungo. Successivamente, rimuovere l'anello in PTFE dalla base dello stampo.

Successivamente, cuocere gli stampi per restringere la guaina ed estrarre le guaine ristrette dagli stampi. Lasciare raffreddare gli stampi fino al momento dell'utilizzo e conservarli in un essiccatore sotto cappa. Utilizzando un contagocce, inclinare gli stampi di vetro a 45 gradi e far cadere la soluzione di PGS nel loro lume interno ruotando lentamente lo stampo.

Verificare se la soluzione di PGS scorre lungo la parete dello stampo. Se è presente una zona asciutta, aggiungere ulteriore PGS. Lasciare quindi evaporare il THF sotto cappa per almeno 30 minuti. Una volta evaporato il THF, polimerizzare gli stampi in un forno sotto vuoto.

Dopo un giorno di polimerizzazione, raffreddare gli stampi a temperatura ambiente e immergerli lentamente in verticale in acqua deionizzata a 24 gradi Celsius. Inclinare gli stampi troppo rapidamente provoca bolle d'aria, che strappano l'impalcatura. Trasferire con attenzione gli stampi nel bagno d'acqua.

Posizionarli ad angolo utilizzando un tubo di silicone e lasciare che l'acido ialuronico si sciolga nell'arco di un'ora. Se dopo un'ora l'acido ialuronico non si è staccato dallo stampo, mantenendo lo stampo ancora immerso, utilizzare una spatola per spingere lentamente l'acido ialuronico da entrambe le estremità, quindi agitare lentamente lo stampo. A questo punto, verificare che gli scaffold non si siano spostati all'interno dello stampo di vetro; in caso affermativo, tirare lentamente lo scaffold con una pinza per staccarlo dallo stampo.

Successivamente, rimuovere le particelle di sale trasferendo con attenzione gli scaffold delicati in un bagno di acqua deionizzata con agitazione delicata. Questo processo richiederà almeno tre giorni e necessita il cambio quotidiano dell'acqua. Una volta che tutto il sale è stato rimossa, trasferire ciascuno scaffold in un tubo da centrifuga da 15 millilitri riempito con acqua deionizzata e congelarli per un'ora in una scatola di ghiaccio secco. Posizionare i tubi da centrifuga congelati in un liofilizzatore per tre giorni con i tappi aperti.

Dopo la liofilizzazione, conservare gli scaffold in un ambiente essiccato fino al momento dell'uso. Iniziare tagliando gli scaffold in lunghezze comprese tra 25 e 30 millimetri. Successivamente, preparare due tappi di gomma siliconica infilando un tubo in PTFE attraverso i fori centrali di ciascun tappo.

Quindi tagliare spezzoni lunghi un millimetro e mezzo dell'anello hs e infilarne uno su una estremità dell'impalcatura. Inserire un tubo in PTFE collegato al tappo nella stessa estremità dell'impalcatura, con un sovrapposizione sufficiente a posizionarsi sotto l'anello HS per collegare saldamente l'impalcatura al tubo, quindi restringere l'anello HS in un forno e lasciare raffreddare l'insieme alla temperatura ambiente. A questo punto, un tubo in policarbonato lungo 50 millimetri, che funge da camera del bioreattore, viene infilato sull'impalcatura e fissato sulla superficie interna del tappo in gomma siliconica.

Come in precedenza, un altro tubo in PTFE e un tappo vengono fissati all'altra estremità dell'impalcatura con un anello hs per completare la camera. Il secondo tappo viene collegato all'altra estremità del tubo in policarbonato. Successivamente, le superfici esterne dei tappi vengono fissate a due piastre in lega di alluminio.

Inserire due barre filettate nei fori laterali di ciascuna piastra e fissare le piastre con viti a testa zigrinata. Collegare l'impalcatura al biorreattore. Misurare ora la lunghezza visibile di ciascun impalcatura, ovvero la distanza tra i due anelli hs, e calcolarne le aree superficiali interne.

Per la semina cellulare. In un autoclave, sterilizzare le camere, ciascuna avvolta singolarmente nella carta stagnola, insieme a ogni componente dell'unità del biorreattore. Una volta sterilizzate, assemblare il biorreattore all'interno di una cappa da coltura cellulare.

Pretrattare e risciacquare l'impalcatura mediante una serie di perfusioni utilizzando una pompa peristaltica a un millimetro al minuto nel circuito di flusso. Iniziare risciacquando con etanolo al 70%, etanolo al 50% e poi etanolo al 25% per un'ora ciascuno. Dopo i tre risciacqui con etanolo, effettuare un risciacquo con PBS per due ore.

Infine, perfondere il bioreattore con il mezzo di coltura per le cellule muscolari lisce per 24 ore, dopo le quali sarà pronto per la semina cellulare e per gli esperimenti. A questo punto, seguendo le istruzioni riportate nel manoscritto allegato, seminare il bioreattore con 2 milioni di cellule per centimetro quadrato e, nei successivi 21 giorni, sostituire il mezzo nei tubi e apportare aggiustamenti alla velocità della pompa. Gradualmente, la pressione all'interno del costrutto aumenterà da circa quattro millimetri di mercurio nel primo giorno di coltura a oltre 100 millimetri di mercurio dopo due settimane di coltura; dopo tre settimane di coltura, raccogliere le cellule e prepararle per l'analisi come specificato nel manoscritto allegato.

Questi scaffold tubolari in PGS sono stati realizzati mediante il metodo di fusione con sale. Micrografie al microscopio elettronico a scansione hanno dimostrato che tutti gli scaffold presentavano spessori delle pareti omogenei e non mostravano difetti parziali nelle loro sezioni trasversali. Porosità macro e micro sono state osservate in modo casuale sulla superficie luminale di tutti gli scaffold.

Dopo la coltura cellulare, i SMC multistrato si sono sviluppati con un'orientazione perpendicolare alla direzione del flusso. Inoltre, le cellule e le proteine del DCM hanno completamente ricoperto la superficie luminale di tutte le strutture in PGS. L'autofluorescenza dell'elastina ha inoltre mostrato fibre elastiche organizzate in modo circonferenziale sulla superficie luminale della struttura.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe aver compreso come realizzare un impalcatura tubulare porosa, osservare le cellule e coltivare l'impalcatura utilizzando un bioreattore pre-progettato.