Name: PGS elastomerico Ponteggi in Ingegneria tessuto arterioso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Scopri la fabbricazione di scaffold tubulari porosi in elastomeri biodegradabili per ingegneria tessuto arterioso. Questo metodo utilizza bioreattori a flusso pulsatile con cellule muscolari lisce vascolari per produrre matrice extracellulare nativa.

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L&#39;autore ringrazia il Dott. Jin Gao per la sintesi PGS, il Dott. Peter Crapo di discussione penetranti bioreattore per l&#39;installazione, Drs. Mohamed Ezzelarab e Wei Wu per espianto babbuino arterie carotidi. Questo studio è stato supportato da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (R01 HL089658).

1. Ponteggio tubolare di fabbricazione <ol><li> Preparare tubo di vetro (lunghezza = 70 mm, diametro esterno = 9,0 mm, spessore parete = 1,0 mm; parti piccole, Miramar, FL) come stampo per ponteggio. </li><li> Preparare 1,0 peso / volume% acido ialuronico (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), sciogliendo 100 mg di HA in 10 ml di acqua deionizzata. Mescolare con un rotore durante la notte fino a quando non vi siano bolle d'aria in soluzione. </li><li> Versare la soluzione HA 1,0% nella parte superiore del tubo di vetro. Lasciarla fluire lentamente lungo la parete interna dello stampo. Capovolgere il tubo quando la soluzione raggiunto il fondo dello stampo con il rotore e ripetere l'operazione fino a quando la parete interna dello stampo è uniformemente rivestito dalla soluzione. </li><li> Dopo il rivestimento, asciugare tutte le tubazioni di vetro nel forno a vuoto a 37 ° C per 24 h. </li><li> Grind e particelle di sale setaccio (size = 25-32 micron), utilizzato come porogens. </li><li> Assemblare un tubo di vetro (interno rivestito con una soluzione di HA 1,0%), anima (in acciaio inox rivestito da tubi in PTFE), termoretraibili (HS) manica, e l'anello in PTFE come descritto in precedenza 8. </li><li> Aggiungi particelle sale della dimensione desiderata per lo stampo di vetro con una spatola attraverso l'imbuto in gomma siliconica. Toccare delicatamente lo stampo per garantire un'equa distribuzione delle particelle di sale. Raschiare le particelle di sale in eccesso nella parte superiore dello stampo usando il lato della spatola. </li><li> Accendere l'ibridazione incubatore per 30 minuti prima di trasferire il sale ricco di muffa. Spegnere l'ibridazione incubatore e mettere il sale ricco di muffa nel ibridazione incubatore per la fusione di sale. </li><li> Togliere gli stampini dal ibridazione incubatore e asciugarli nel forno a vuoto a 37 ° C per 24 h. </li><li> Togliere il sale ricco di stampi da forno vuoto e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Rimuovere il mandrino in acciaio inox, spingendolo verso il basso con tenendo l'anello in PTFE. Se il mandrino è troppo stretto per lo stampo, utilizzare le pinze ad ago per tirarlo fuori. Rimuovere l'anello di PTFE dal fondo dello stampo. </li><li> Mettere gli stampi in forno a 120 ° C per 5 minuti a ridursi manica HS. Controllare se il manicotto HS si restringe. Rimuovere la copertura di SA dal sale ricco di stampi e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Tenere gli stampi in essiccatore fino a quando non vengono utilizzati. </li><li> Preparare la soluzione PGS sciogliendo 3 g di PGS in 15 ml di tetraidrofurano (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) per formare un 20 wt / soluzione% vol. </li><li> Aggiungere la soluzione PGS al lume di sale ricco di stampi facendola cadere con un spoid nel cappuccio Hume. Magra lo stampo di vetro di circa 45 ° e rilasciare la soluzione PGS in lume interno con rotazione dello stampo lentamente. Controllare se la soluzione PGS scende lungo la parete di muffa. Se la macchia secca è osservato, aggiungere altre soluzioni. </li><li> Dopo aver aggiunto la soluzione PGS, luogo gli stampi nel cofano Hume per almeno 30 minuti per l'evaporazione THF. </li><li> Mettere gli stampi in forno a vuoto per la pre-determinato tempo di maturazione (es. 24 / 36 / 48 h) a 100 mTorr e 150 ° C per PGS stagionatura. </li><li> Dopo la polimerizzazione, togliere gli stampini e metterli a temperatura ambiente per raffreddare. Immergere ogni stampo in acqua deionizzata con posizione verticale lentamente. Non immergerli in acqua perché il digiuno bolle d'aria possono causare strappi al patibolo. </li><li> Trasferire gli stampi a bagnomaria con cura e metterli in un angolo per 1 h con tubo in silicone per sciogliere HA facilmente. Controllare se HA è sciolta dallo stampo. Se non HA è rilasciato dallo stampo, spingere la fine del patibolo lentamente con una spatola per liberarla dallo stampo. Ripetere questo passaggio all'altra estremità del ponteggio e scuotere lo stampo avanti e indietro lentamente in bagnomaria. Controllare se il ponteggio viene spostato all'interno dello stampo. </li><li> Trasferire il patibolo per un altro bagno di acqua con agitatore attenzione. Non afferrare il patibolo con fermezza, che potrebbe rompere il patibolo. Posizionare il patibolo nel bagnomaria per almeno 3 giorni cambiando l'acqua per filtrare le particelle di sale. </li><li> Dopo lisciviazione particelle di sale, trasferire ogni impalcatura alla provetta da centrifuga 15 ml riempito con l'acqua deionizzata e metterli in condizioni di asciutto-ghiaccio box per 1 ora di congelare. Mettere provette nel liofilizzatore (tutte le cabine tubo deve essere aperto) e liofilizzare li per 2 giorni. </li><li> Mettere tutti ponteggi in essiccatore prima fino a quando non vengono utilizzati. </li></ol> 2. Preparazione patibolo per la semina cella <ol><li> Estrarre ponteggi dal essiccatore e tagliarli come 25-30mm di lunghezza. </li><li> Preparare due tappi di gomma di silicone (diametro = 20 mm, spessore parete = 6.35 mm, diametro del foro centrale = 3 mm) e collegare due tubi in PTFE (diametro esterno = 3.97 mm, diametro interno = 2.38 mm, spessore parete = 0,79 mm, lunghezza = 60 mm e 40 mm) attraverso i fori centro di ogni tappo. </li><li> Tagliare un anello di HS come 1,5 mm di lunghezza e lo mise in cima ad una delle estremità del ponteggio. Inserire una tubi in PTFE (collegato tappo di gomma di silicone) in fine una delle impalcature più piccolo parte sovrapposte possibile. </li><li> Mettere il tubo di ponteggio e PTFE in forno a 120 ° C per 10 minuti a ridursi anello SA. Controllare se l'anello SA si restringe e ponteggi sono collegati a tubi in PTFE con fermezza. </li><li> Estrarre il tubo ponteggio e PTFE e metterli a temperatura ambiente per raffreddare. Mettere il patibolo-PTFE assemblaggio tubo nel tubo di policarbonato (diametro esterno = 15,5 mm, diametro interno = 9 mm, lunghezza = 50 mm) come una camera di bioreattore. </li><li> Collegare un altro l'estremità del tubo in PTFE al patibolo come passi 2.3) e 2.4). </li><li> Regolare due tappi di gomma di silicone per attaccare le loro superfici interne ad entrambe le estremità del tubo in policarbonato. Fissare entrambe le superfici esterne dei tappi di gomma di silicone a due piastre in lega di alluminio (alto e basso, larghezza = 20 mm, lunghezza = 70 mm, spessore = 6,35 mm). Mettere due barre filettate nel foro laterale della piastra e fissare il tubo di policarbonato (incluso l'interno scaffold) per le piastre di serraggio dado pollice sulla piastra. </li><li> Misurare la lunghezza di ogni seedable patibolo (una lunghezza compresa tra due anelli SA) e calcolare l'area della superficie interna (π x lunghezza x diametro interno seedable) di ogni impalcatura per la semina delle cellule. </li><li> Avvolgere una camera unità bioreattore con foglio di alluminio e sterilizzarlo in autoclave a 120 ° C per 30 min. Sterilizzare ogni parte (serbatoio media, i tubi delle pompe, scambiatori di gas, collettori e valvola a spillo) del bioreattore in autoclave a 120 ° C per 30 min e li assembla all'interno della cappa colture cellulari. </li><li> Pre-trattamento e risciacquare impalcature con una serie di perfusione (70, 50, e 25% di etanolo per 1 h, PBS (PBS, Mediatech, Herndon, VA) per 2 ore e mezzo di coltura SMC per 24 ore utilizzando una pompa peristaltica a 1,0 ml / min nel circuito di flusso. </li></ol> 3. Semina delle cellule e Cultura <ol><li> Isolare cellule primarie arterie muscolari lisce (SMC) dalle arterie carotidee di giovani babbuini maschi (Papio Anubis) e caratterizzare in due-dimensionali (2D) cultura prima passaging e semina come descritto in precedenza 9. </li><li> Espandere SMC utilizzando il MCDB 131 di media (Mediatech, Herndon, VA) con il 10% di siero fetale bovino (Lonza, Walkersville, MD), 1% di L-glutamina (Mediatech), 50 mg / ml di acido ascorbico (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), e un antibiotico-antimicotico soluzione (10.000 UI / ml di penicillina, 10.000 mg / ml di streptomicina, e 25 mg / ml di amfotericina B; Mediatech). </li><li> Staccare ogni camera bioreattore dal circuito di flusso nel bioreattore. SMC Seed (passaggio 4-6) al patibolo con una densità di 2x10 6 cellule / cm 2, iniettando sospensione con siringa da 5 ml nel lume di ponteggi, dopo il taglio sia abluminal (ingresso) e luminale (uscita) dei flussi. </li><li> Mettete tutte le camere bioreattore nel ibridazione incubatore a 37 ° C e ruotarle a 2 giri per le 4 ore per consentire alle cellule di diffondersi in modo uniforme al patibolo. </li><li> Estrarre camere bioreattore dalla ibridazione riattaccare incubatore a flusso circuito del bioreattore nel cappuccio. Trasferire tutto il sistema bioreattore nella cultura incubatore cellulare. </li><li> Collegare il tubo della pompa (diametro interno = 1,6 mm) per la cartilagine di pompa peristaltica e caricare mezzo fresco cultura nel serbatoio. Avviare il tramite parete perfusione (luminale a abluminal) a 1,0 ml / min per 15 minuti seguito da flusso luminale solo. </li><li> Aumentare la portata e la pressione gradualmente da 1,0 ml / min (stress lume di taglio: 1,1 dyne / cm 2) e 20 mmHg il giorno 1-14,2 ml / min (15,3 dyne / cm 2) e 120 mm Hg il giorno 21, rispettivamente. Cambiare il tubo della pompa (diametro interno = 3,2 mm) al giorno 4 e il mezzo una volta alla settimana. </li></ol> 4. Tessuto raccolta e preparazione del campione per l'analisi <ol><li> Dopo 21 giorni di cultura, fermare la pompa e pinza tubi (ingresso e uscita) del serbatoio mezzo. Staccare il tubo della pompa dalla cartilagine di pompa peristaltica e bioreattori sistema di trasferimento all'interno della cappa. </li><li> Morsetto di ingresso e uscita tubi di ogni camera di bioreattori e staccarlo dal ciclo di flusso. Aprire il tubo di aspirazione e di preparare un piatto a Petri-il tubo di uscita per raccogliere terreno di coltura all'interno del tubo in policarbonato. Aprire il tubo di uscita lentamente e rimuovere il supporto dalla camera. </li><li> Staccare l'ago abluminal manometro e tubi in silicone luminale dalla camera e staccare le piastre di alluminio attraverso il rilascio di viti ad alette. Rimuovere il tubo di policarbonato e staccare una delle estremità del tessuto costruire dal tubo in PTFE. </li><li> Preparare un piatto di Petri-riempite con 10 ml di PBS e staccare altra estremità del costruire dal tubo in PTFE. Mettere costruire in PBS e risciacquare tre volte. </li><li> Tagliare il costrutto con una lama di rasoio a 5 mm di lunghezza. Congelare congelatore a -80 ° C per analisi biochimiche o trasferirlo a 15 ml per centrifuga tubo riempito con 5 ml di terreno fresco per prove meccaniche o congelare scattano nelle Tissue-Tek mescola ottimale temperatura di taglio (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA ) per istologia / immunoflucolorazione orescence. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: I ponteggi tubolari PGS sono stati fabbricati utilizzando elastomeri biodegradabile con il metodo di fusione del sale (Fig. 1A). Ogni camera bioreattore fornito ponteggi con flussi sia luminale e abluminal e potrebbe essere distaccato come unità separata da un ciclo di flusso principale (Fig. 1B). Bioreattore sistema è stato progettato per la coltura quattro ponteggi in un momento di controllo e monitoraggio del flusso e di pressione (Fig. 1 C &amp; D). Schematica della cultura bioreattore è stato mostrato in fig. 2. Dopo la semina SMC, ciascuna camera bioreattore è stata ruotata a 37 ° C per 4 ore a distribuire uniformemente le cellule nel lume del patibolo. E poi, il flusso pulsatile è stato applicato a ponteggi fino al giorno 14 con portata via via crescente (Fig. 2A) e della pressione (Fig. 2B). Dopo il giorno 14, il flusso e la pressione mantenuta costante fino alla fine della cultura (giorno 21). Morfologia superficiale del patibolo PGS è stata esaminata da microscopia elettronica a scansione (SEM). Scansione microscopio elettronico ha mostrato che patibolo aveva parete coerente spessori (539 ± 18 micron) (Fig. 3A) e distribuiti in modo casuale macro e micro-pori sulla superficie luminale (Fig. 3B). Parametri morfometrici del patibolo è stato misurato da microcomputed tomografia (micro-CT) e analisi di imaging. Dimensione dei pori media è di 23,3 ± 3,9 micron e l'interconnessione dei pori è 99,4 ± 0,62%, il che significa che tutti i pori sono completamente interconnessi in patibolo. Porosità misurata con spostamento etanolo è 75,6 ± 2,7%. Morfologia cellulare del costrutto PGS è stato esaminato da SEM (Fig. 4). SMC multistrato completamente coperto la superficie luminale ed erano orientato perpendicolarmente alla direzione del flusso. Questi risultati mostrano che il condizionamento meccanico da bioreattore flusso pulsatile supporta l'orientamento SMC nel patibolo. La presenza della matrice extracellulare (ECM) e fibre elastiche sono stati esaminati dalla colorazione H &amp; E e elastina autofluorescenza (Fig. 5). Colorazione H &amp; E ha dimostrato che le cellule e proteine ​​ECM completamente ricoperto il lume della PGS costrutto. Elastina autofluorescenza ha anche mostrato circonferenza organizzato fibre elastiche sulla superficie luminale del costrutto. Produzione di proteine ​​ECM nei costrutti PGS sono stati misurati da test biochimici. L'elastina insolubile e il contenuto di collagene era 20,2 ± 9,1 mcg / mg di tessuto e del 6,3 ± 1,9 mcg / mg di tessuto, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Impalcatura fabbricazione e il sistema di bioreattori. (A) Schema di ponteggio tubolare di fabbricazione. (B) camera di bioreattori. Ponteggi erano collegati a tubi in PTFE, posta nel tubo di policarbonato, e fissato da tappi di gomma di silicone e piastre in lega di alluminio. Ogni camera dispone di due percorsi di flusso: flussi luminale (da tubi in silicone) e abluminal (da gauge). (C) sistema di bioreattori posto all'interno dell'incubatore. Esso comprende serbatoio di media, modulo della pompa peristaltica, scambiatore di gas, trasduttori di pressione, due collettori (alto e basso) e valvola a spillo. (D) sistema di bioreattori collocato all'esterno dell'incubatrice. Esso comprende monitorare la pressione, unità di controllo di flusso, sistema di acquisizione dati, e il computer. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Schematica della cultura bioreattore. (A) protocollo Cultura. (B) applicata profili di pressione in ogni momento (giorno 1, 4, 7 e 14). <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Morfologia superficiale del patibolo PGS. (A) Sezione. (B) Lumen. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Morfologia cellulare del PGS costrutto. (A) Lumen. (B) Sezione taglio di 45 °. Frecce in entrambe le figure rappresentano la direzione del flusso. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Istologia ed elastina autofluorescenza del PGS costrutto. (A) H &amp; E colorazione. (B) autofluorescenza elastina corrispondente. L: lumen. Ingrandimento: 40X. Scala grafica: 50 micron.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La tecnica di fabbricazione utilizzando un elastomero biodegradabile qui descritto ha caratteristiche diverse. (1) Abbiamo usato acido ialuronico (HA) in un comunicato stampo. Dal momento che HA è solubile in acqua, patibolo era facilmente liberato dallo stampo di vetro dopo aver immerso in acqua. In questo rapporto, abbiamo usato 1,0 peso / volume% di soluzione HA perché a bassa concentrazione (&lt;0,5 peso / volume%) di soluzione non è viscoso e scorre così velocemente quando ci si versa sulla parte superiore del tubo di vetro. Alla soluzione di cappotto HA uniformemente, abbiamo capovolto i tubi di vetro quando la soluzione volò giù nella parte inferiore del tubo e ripetuto questo passaggio. Questo rivestimento HA è una critica alla nostra procedura di fabbricazione per il rilascio ponteggi finale. (2) Abbiamo usato termoretraibile (HS) manica per trattenere i sali nel tubo di vetro. Dal momento che i sali erano densamente nello spazio tra la parete interna del tubo di vetro e la manica HS, HS manica mantenuto sali dopo aver rimosso mandrino e anello in PTFE nella parte inferiore del tubo. Potremmo togliere manica HS facilmente mettendo lo stampo in forno a 120 ° C per 5 minuti, e quindi ottenere il sale modelli tubolari. (3) Abbiamo usato il metodo di fusione del sale. E &#39;noto che la fusione metodo di sale in grado di migliorare l&#39;interconnessione dei pori e le proprietà meccaniche, variando il tempo di fusione 10. Inoltre, dal momento che abbiamo usato PGS, macro-pori sono stati prodotti dalle particelle di sale durante il processo di lisciviazione, mentre la micro-pori erano probabilmente generato dal vapore glicerolo formano durante PGS curare come abbiamo descritto in precedenza 11. Così, questo metodo ha un potenziale per fabbricare poroso ponteggi tubolari con diverse macro-e micro-strutture variando particelle di sale e PGS curare condizione. Il condizionamento meccanico dal bioreattore ha fornito perfusione flusso pulsatile (massima media di flusso = 14 ml / min, la massima sollecitazione di taglio = 15.3 dyne / cm 2, frequenza = 0,5-1,7 Hz) e fisiologicamente pressione pertinente con l&#39;impalcatura PGS, che ha portato alla SMC crescita e di orientamento (Fig. 4). Questi risultati sono coerenti con gli studi precedenti rapporti che si estendono ciclico a questa frequenza e lo stress di taglio aumenta la proliferazione SMC 12, e la produzione di proteine ​​ECM 13,14. Oltre alla crescita SMC e di orientamento, PGS costruire sostenuto la produzione di proteine ​​ECM, specialmente circonferenza organizzato fibre elastiche (Fig. 5) entro 3 settimane cultura del bioreattore. Alcuni studi con un elastomero patibolo come un piccolo diametro costruire arteriosa hanno dimostrato resistenza meccanica e la pressione di scoppio paragonabile ad arterie native 15, e una rapida integrazione SMC ponteggi compatibile con ogiva fiasco 16,17, mentre le fibre elastiche non sono stati trovati in questi costrutti. I nostri risultati suggeriscono che la distensione ciclico radiale dal bioreattore migliorato trasduzione del segnale meccanico in modo più efficace di SMC in PGS patibolo, che probabilmente ha contribuito alla sintesi di elastina e di organizzazione. Dal SMC vascolari sono state le uniche cellule che producevano proteine ​​ECM nel nostro approccio, endotelio quiescente e migliorare la resistenza meccanica sono necessarie per sviluppare una clinica di successo costruisce arteriosi di piccolo diametro. Ci hanno riferito che le cellule endoteliali co-coltura con SMC generato un monostrato confluente e sostenuto l&#39;espressione della proteina fenotipo sotto i nostri condizioni di coltura e di condizionamento meccanico 9. Pertanto, sulla base delle nostre approccio qui descritto, modifiche di co-coltura condizioni di esperimento sarebbe un passo successivo per migliorare le funzioni di costrutti che ne risulta e generare nonthrombogenic, robusto, e compatibile con arteriosa costruire simili alle arterie native.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Acido ialuronico sale sodico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7630 </td></tr><tr><td> Tetraidrofurano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td></tr><tr><td> MCDB 131 </td><td> Mediatech </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Lonza </td><td> BW14-502F </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CV </td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> Fisher Scientific </td><td> A62-500 </td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotico soluzione </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato (PBS) </td><td> Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Tissue-Tek mescola ottimale temperatura di taglio, 4583 </td><td> Sakura Finetek </td><td> 25608-930 </td></tr></tbody></table>

pgs elastomerico ponteggi in ingegneria tessuto arterioso

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di mortalità negli Stati Uniti e soprattutto, malattia coronarica aumenta con l&#39;invecchiamento della popolazione e l&#39;aumento dell&#39;obesità 1. Attualmente, la chirurgia di bypass utilizzando vasi autologhi, trapianti e innesti sintetici sono conosciuto come un comunemente usato per i sostituti arteriosa 2. Tuttavia, questi innesti hanno applicazioni limitate quando un diametro interno delle arterie è inferiore a 6 mm a causa della scarsa disponibilità, complicanze trombotiche, mancata corrispondenza rispetto, e alla fine iperplasia intimale 3,4. Per superare queste limitazioni, l&#39;ingegneria dei tessuti è stata applicata con successo come alternativa promettente per sviluppare costruisce arterie di piccolo diametro che sono nonthrombogenic, robusti e conformi. Diversi studi precedenti hanno sviluppato costruisce arteriosi di piccolo diametro con tri-struttura lamellare, eccellenti proprietà meccaniche e la pressione di scoppio paragonabile ad arterie native 5,6. Mentre elevata resistenza alla trazione e pressione di scoppio, aumentando la produzione di collagene da un materiale rigido o cella foglio patibolo, questi costrutti ancora bassa produzione di elastina e di conformità, che è un grosso problema per causare il fallimento dell&#39;innesto dopo l&#39;impianto. Considerando questi aspetti, abbiamo ipotizzato che un elastomero biomateriale combinato con condizionamento meccanico fornirà elasticità e condurre segnali meccanici in modo più efficiente alle cellule vascolari, che aumentano la produzione della matrice extracellulare e supporto all&#39;orientamento cellulare. L&#39;obiettivo della presente relazione è quello di introdurre una tecnica di fabbricazione di poroso ponteggi tubolari e un condizionamento meccanico dinamica di applicazione a ingegneria dei tessuti delle arterie. Abbiamo usato un elastomero biodegradabile, poli (sebacato glicerolo) (PGS) 7 per la realizzazione di ponteggi tubolari poroso dal metodo di fusione del sale. Adulto primaria cellule muscolari lisce babbuino (SMC) sono stati seminati sul lume di ponteggi, che colta nel nostro bioreattore progettato flusso pulsatile per 3 settimane. Ponteggi PGS aveva spessore costante e distribuiti in modo casuale macro e micro-pori. Condizionamento meccanico da bioreattore flusso pulsatile supportato SMC orientamento e una maggiore produzione di ECM in ponteggi. Questi risultati suggeriscono che i ponteggi elastomerici e condizionamento meccanico della cultura bioreattore può essere un metodo promettente per l&#39;ingegneria tissutale arteriosa.

PGS elastomerico ponteggi con cellule muscolari lisce vascolari in coltura in un bioreattore flusso pulsatile può portare a promettenti costruisce arterie di piccolo diametro con la produzione ECM nativo in un relativamente breve periodo di coltura.

PGS elastomerico Ponteggi in Ingegneria tessuto arterioso

Le malattie cardiovascolari rappresentano una delle principali cause di mortalità negli Stati Uniti e, in particolare, la cardiopatia coronarica aumenta con l'invecchiamento della popolazione e ...

Questo video mostra come fabbricare scaffold tubolari porosi e sottoporli a un condizionamento meccanico dinamico per l'ingegneria dei tessuti arteriosi. Questo risultato si ottiene innanzitutto fabbricando gli scaffold utilizzando un elastomero biodegradabile e il metodo di fusione per assalto. Gli scaffold vengono quindi preparati per la semina cellulare e assemblati in un sistema di bioreattore.Nel bioreattore, le cellule muscolari lisce vascolari colonizzano gli scaffold e vengono coltivate. Settimane dopo, il tessuto viene raccolto e analizzato mediante microscopia elettronica a scansione, colorazione ematossilina ed eosina e autofluorescenza dell'elastina. Il muscolo liscio risultante è sia multistratificato che orientato perpendicolarmente.Il principale vantaggio di questa tecnica, simile alla sbiancatura particellare, consiste nell'utilizzare lo stampo in vetro per fabbricare uno scaffold tubolare poroso in acido ialuronico. Una volta rimosso lo stampo, lo scaffold viene preparato a partire da un pezzo di tubo di vetro. Posizionare il tubo in un supporto e versare all'interno la soluzione di acido ialuronico preparata il giorno precedente.L'acido ialuronico scorre lentamente lungo la parete interna. Quando raggiunge il fondo dello stampo, capovolgere lo stampo. Ripetere questo passaggio fino a quando la parete interna dello stampo non è uniformemente ricoperta dalla soluzione.Dopo il rivestimento, asciugare tutti gli stampi di vetro preparati in un forno a vuoto a 37 gradi Celsius per 24 ore. Solitamente, vengono preparati contemporaneamente quattro stampi mentre gli stampi di vetro si asciugano. Preparare le polveri di particelle di sale, macinare e setacciare le particelle di sale a 25-32 micrometri.Il giorno successivo, assemblare il mandrino in vetro preparato, il tubo in PTFE, la guaina termorestringente e l'anello in PTFE. In primo luogo, inserire il mandrino in tratti di tubo in PTFE lunghi 65 millimetri e cuocerli a 120 gradi Celsius per cinque minuti. Mentre si attende che il PTFE si restringa, preriscaldare un incubatore per ibridazione a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti.Dopo che il tubo ha ricoperto completamente i mandrini, posizionare il manicotto termoretraibile sul mandrino in modo che possa muoversi liberamente. Quindi inserire il mandrino all'interno dello stampo di vetro e fissare l'anello A-P-T-F-E alla base del mandrino. Verificare che l'anello in PTFE sia ben aderente alla base dello stampo di vetro.Successivamente, utilizzando una spatola e un imbuto in gomma siliconica, aggiungere le poltiglie di particelle di sale nello stampo di vetro. Quindi battere leggermente lo stampo con la spatola per ottenere una distribuzione uniforme delle particelle ed eliminare l'eccesso di sale. Spegnere ora l'incubatrice riscaldata e caricarla rapidamente con gli stampi riempiti di sale; il sale si fonderà nei successivi 30 minuti, dopodiché asciugare gli stampi in un forno a vuoto a 37 gradi Celsius per 24 ore.Il giorno successivo al raffreddamento, rimuovere il mandrino in acciaio inossidabile dagli stampi spingendolo verso l'esterno mentre si tiene fermo l'anello in PTFE. Se necessario, utilizzare una pinza a becco lungo. Successivamente, rimuovere l'anello in PTFE dalla base dello stampo.Successivamente, cuocere gli stampi per restringere la guaina ed estrarre le guaine ristrette dagli stampi. Lasciare raffreddare gli stampi fino al momento dell'utilizzo e conservarli in un essiccatore sotto cappa. Utilizzando un contagocce, inclinare gli stampi di vetro a 45 gradi e far cadere la soluzione di PGS nel loro lume interno ruotando lentamente lo stampo.Verificare se la soluzione di PGS scorre lungo la parete dello stampo. Se è presente una zona asciutta, aggiungere ulteriore PGS. Lasciare quindi evaporare il THF sotto cappa per almeno 30 minuti. Una volta evaporato il THF, polimerizzare gli stampi in un forno sotto vuoto.Dopo un giorno di polimerizzazione, raffreddare gli stampi a temperatura ambiente e immergerli lentamente in verticale in acqua deionizzata a 24 gradi Celsius. Inclinare gli stampi troppo rapidamente provoca bolle d'aria, che strappano l'impalcatura. Trasferire con attenzione gli stampi nel bagno d'acqua.Posizionarli ad angolo utilizzando un tubo di silicone e lasciare che l'acido ialuronico si sciolga nell'arco di un'ora. Se dopo un'ora l'acido ialuronico non si è staccato dallo stampo, mantenendo lo stampo ancora immerso, utilizzare una spatola per spingere lentamente l'acido ialuronico da entrambe le estremità, quindi agitare lentamente lo stampo. A questo punto, verificare che gli scaffold non si siano spostati all'interno dello stampo di vetro; in caso affermativo, tirare lentamente lo scaffold con una pinza per staccarlo dallo stampo.Successivamente, rimuovere le particelle di sale trasferendo con attenzione gli scaffold delicati in un bagno di acqua deionizzata con agitazione delicata. Questo processo richiederà almeno tre giorni e necessita il cambio quotidiano dell'acqua. Una volta che tutto il sale è stato rimossa, trasferire ciascuno scaffold in un tubo da centrifuga da 15 millilitri riempito con acqua deionizzata e congelarli per un'ora in una scatola di ghiaccio secco. Posizionare i tubi da centrifuga congelati in un liofilizzatore per tre giorni con i tappi aperti.Dopo la liofilizzazione, conservare gli scaffold in un ambiente essiccato fino al momento dell'uso. Iniziare tagliando gli scaffold in lunghezze comprese tra 25 e 30 millimetri. Successivamente, preparare due tappi di gomma siliconica infilando un tubo in PTFE attraverso i fori centrali di ciascun tappo.Quindi tagliare spezzoni lunghi un millimetro e mezzo dell'anello hs e infilarne uno su una estremità dell'impalcatura. Inserire un tubo in PTFE collegato al tappo nella stessa estremità dell'impalcatura, con un sovrapposizione sufficiente a posizionarsi sotto l'anello HS per collegare saldamente l'impalcatura al tubo, quindi restringere l'anello HS in un forno e lasciare raffreddare l'insieme alla temperatura ambiente. A questo punto, un tubo in policarbonato lungo 50 millimetri, che funge da camera del bioreattore, viene infilato sull'impalcatura e fissato sulla superficie interna del tappo in gomma siliconica.Come in precedenza, un altro tubo in PTFE e un tappo vengono fissati all'altra estremità dell'impalcatura con un anello hs per completare la camera. Il secondo tappo viene collegato all'altra estremità del tubo in policarbonato. Successivamente, le superfici esterne dei tappi vengono fissate a due piastre in lega di alluminio.Inserire due barre filettate nei fori laterali di ciascuna piastra e fissare le piastre con viti a testa zigrinata. Collegare l'impalcatura al biorreattore. Misurare ora la lunghezza visibile di ciascun impalcatura, ovvero la distanza tra i due anelli hs, e calcolarne le aree superficiali interne.Per la semina cellulare. In un autoclave, sterilizzare le camere, ciascuna avvolta singolarmente nella carta stagnola, insieme a ogni componente dell'unità del biorreattore. Una volta sterilizzate, assemblare il biorreattore all'interno di una cappa da coltura cellulare.Pretrattare e risciacquare l'impalcatura mediante una serie di perfusioni utilizzando una pompa peristaltica a un millimetro al minuto nel circuito di flusso. Iniziare risciacquando con etanolo al 70%, etanolo al 50% e poi etanolo al 25% per un'ora ciascuno. Dopo i tre risciacqui con etanolo, effettuare un risciacquo con PBS per due ore.Infine, perfondere il bioreattore con il mezzo di coltura per le cellule muscolari lisce per 24 ore, dopo le quali sarà pronto per la semina cellulare e per gli esperimenti. A questo punto, seguendo le istruzioni riportate nel manoscritto allegato, seminare il bioreattore con 2 milioni di cellule per centimetro quadrato e, nei successivi 21 giorni, sostituire il mezzo nei tubi e apportare aggiustamenti alla velocità della pompa. Gradualmente, la pressione all'interno del costrutto aumenterà da circa quattro millimetri di mercurio nel primo giorno di coltura a oltre 100 millimetri di mercurio dopo due settimane di coltura; dopo tre settimane di coltura, raccogliere le cellule e prepararle per l'analisi come specificato nel manoscritto allegato.Questi scaffold tubolari in PGS sono stati realizzati mediante il metodo di fusione con sale. Micrografie al microscopio elettronico a scansione hanno dimostrato che tutti gli scaffold presentavano spessori delle pareti omogenei e non mostravano difetti parziali nelle loro sezioni trasversali. Porosità macro e micro sono state osservate in modo casuale sulla superficie luminale di tutti gli scaffold.Dopo la coltura cellulare, i SMC multistrato si sono sviluppati con un'orientazione perpendicolare alla direzione del flusso. Inoltre, le cellule e le proteine del DCM hanno completamente ricoperto la superficie luminale di tutte le strutture in PGS. L'autofluorescenza dell'elastina ha inoltre mostrato fibre elastiche organizzate in modo circonferenziale sulla superficie luminale della struttura.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe aver compreso come realizzare un impalcatura tubulare porosa, osservare le cellule e coltivare l'impalcatura utilizzando un bioreattore pre-progettato.

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Bioengineering

Bioingegneria

Il nostro gruppo ha sviluppato un sistema di coltura bioreattore che imita lo stress pulsatile fisiologica del sistema cardiovascolare per rigenerare impiantabili protesi vascolari di piccolo diametro.

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Questo protocollo si concentra sulla utilizzando la capacità intrinseca delle cellule staminali a prendere spunto dalla loro matrice extracellulare che circonda ed essere indotte a differenziarsi in fenotipi multipli. Questo manoscritto metodi estende la nostra descrizione e caratterizzazione di un modello utilizzando un idrogel doppo strato, costituito da PEG-fibrina e collagene, contemporaneamente alla co-differenziare derivate da tessuto adiposo cellule...

Progettazione di un Hydrogel doppo strato di controllo differenziazione ASC

È stata riportata la sintesi e la fabbricazione di fibre lunghe elettrofilate coprono un'area più grande deposito tramite un collettore di nuova concezione da un polimero biodegradabile romanzo chiamato poli (glicerolo-dodecanoato) (PGD). Le fibre sono in grado di sostenere la crescita di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti di topo.

Elettrofilate Fibrosa Ponteggi di Poli (glicerolo-dodecanedioate) per l&#39;ingegneria neurale tessuti da cellule staminali embrionali di topo

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare ingegneria dei tessuti dei vasi innesti che sono funzionali per l'innesto in topi con un doppio semina cellule staminali pluripotenti indotte in parte (PiPSC) - derivato cellule muscolari lisce e PiPSC - cellule endoteliali derivate su una nave decellularized ponteggio bioreattore.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

Gli scaffold per l'ingegneria tissutale devono ricapitolare il complesso microambiente biochimico e biofisico della nicchia cellulare. Qui, mostriamo l'uso di fibre interfacciali di complessazione polielettrolitica come piattaforma per creare scaffold polimerici compositi e multicomponente con rilascio biochimico sostenuto.

Ponteggi composto di fibre di interfacce polielettrolita per rilascio controllato di Biomolecole temporalmente

Un iniettabili impalcatura ingegneria tissutale composta da poli (N-isopropilacrilammide) solfato -graft-condroitina (PNIPAAm-g-CS) contenenti, microparticelle di alginato è stato preparato. La forza adesiva, gonfiore proprietà e in biocompatibilità vitro vengono analizzati in questo studio. Le tecniche di caratterizzazione sviluppate qui possono essere applicabili ad altri sistemi thermogelling.

Sintesi di Thermogelling poli (N-isopropilacrilammide) -graft-condroitin solfato compositi con alginato microparticelle per ingegneria dei tessuti

In questo lavoro, sono stati preparati scaffold in poli(acido lattico)/polietilenglicole (PLA/PEG) utilizzando una combinazione di miscelazione per fusione e lisciviazione selettiva. Il metodo qui discusso ha permesso di sviluppare scaffold a tre strati controllando altamente sia la porosità che la dimensione dei pori. Le proprietà meccaniche sono state valutate anche in ambiente fisiologico.

Un Facile ed ecologico percorso per fabbricare poli (acido lattico) Ponteggi con Graded dimensione dei pori

Un protocollo di passo dopo passo per controlli non distruttivi e di lungo periodo monitoraggio del processo di rimodellamento vascolare e la degradazione di impalcatura nella cultura in tempo reale di biodegradabili polimerici basati su impalcatura tessutale vasi sanguigni con stimolazione pulsatile usando la tomografia ottica di coerenza è descritto qui.

Non distruttive monitoraggio dello sviluppo del vaso sanguigno tessutale basati su Scaffold degradabile usando la tomografia a coerenza ottica

Presentato qui è un set-up biostampa tridimensionale semplice da usare, nucleo/guscio, tridimensionale per la fabbricazione in un solo passaggio di scaffold cavi, adatto per l'ingegneria tissutale di strutture vascolari e altre strutture tubolari.

Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari

La ricostruzione esofagea è una procedura impegnativa e lo sviluppo di un esofago tissutale che consente la rigenerazione della mucosa e del muscolo esofageo e che può essere impiantato come un innesto artificiale. Qui, presentiamo il nostro protocollo per generare un esofago artificiale, tra cui la produzione di scaffold, la coltivazione di bioreattori e varie tecniche chirurgiche.

Innesto ingegnerizzato per la ricostruzione esofagea circonferenza nei ratti

L'obiettivo di questo protocollo è quello di eseguire una co-coltura dinamica di macrofagi e miofibroblasti umani in scaffold elettrofilari tubolari per studiare la rigenerazione tissutale guidata dal materiale, utilizzando un bioreattore che consente il disaccoppiamento dello stress da taglio e dell'allungamento ciclico.

Un bioreattore multi-cue per valutare la capacità infiammatoria e rigenerativa dei biomateriali sotto flusso e allungamento

Scopri la fabbricazione di scaffold tubulari porosi in elastomeri biodegradabili per ingegneria tessuto arterioso. Questo metodo utilizza bioreattori a flusso pulsatile con cellule muscolari lisce vascolari per produrre matrice extracellulare nativa.

PGS elastomerico Ponteggi in Ingegneria tessuto arterioso

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