PGS elastomerico Ponteggi in Ingegneria tessuto arterioso

PGS elastomerico ponteggi con cellule muscolari lisce vascolari in coltura in un bioreattore flusso pulsatile può portare a promettenti costruisce arterie di piccolo diametro con la produzione ECM nativo in un relativamente breve periodo di coltura.

Questo video mostra come fabbricare scaffold tubolari porosi e sottoporli a condizionamento meccanico dinamico per l'ingegneria del tessuto arterioso. Ciò si ottiene fabbricando prima gli scaffold utilizzando un elastomero biodegradabile e un metodo di fusione d'assalto. Gli scaffold vengono quindi preparati per la semina cellulare e assemblati in un sistema di bioreattore.

Nel bioreattore le cellule muscolari lisce vascolari seminano gli scaffold e vengono coltivate. Settimane dopo, il tessuto viene raccolto e analizzato mediante microscopia elettronica a scansione, colorazione h ed e e autofluorescenza dell'elastina. La muscolatura liscia risultante è sia multistrato che orientata perpendicolarmente.

Il vantaggio principale di questa tecnica, come lo sbiancamento particellare, è quello di utilizzare lo stampo di vetro per fabbricare un'impalcatura tubolare porosa e acido ialuronico. Quando uno stampo viene eliminato, lo stampo dell'impalcatura viene preparato da un pezzo di tubo di vetro. Metti il tubo in un supporto e versa la soluzione di acido ialuronico preparata il giorno prima nel tubo.

L'acido ialuronico scorre lentamente lungo la parete interna. Quando raggiunge il fondo dello stampo, capovolgere lo stampo. Ripetere questo passaggio fino a quando la parete interna dello stampo non è uniformemente rivestita dalla soluzione.

Dopo la verniciatura, asciugare tutti gli stampi di vetro preparati in forno sottovuoto a 37 gradi Celsius per 24 ore. In genere, vengono preparati quattro stampi contemporaneamente mentre gli stampi di vetro si asciugano. Preparare le particelle di sale versa, macinare e SVE le particelle di sale a 25-32 micrometri.

Il giorno successivo, assemblare il mandrino dello stampo in vetro preparato, il tubo in PTFE, il manicotto termorestringente e l'anello in PTFE. Per prima cosa, caricare il mandrino in tubi in PTFE di 65 millimetri e cuocerli a 120 gradi Celsius per cinque minuti. Per ridurre il PTFE in attesa dell'anteguerra, un incubatore di ibridazione a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti.

Una volta che il tubo ha avvolto i mandrini, spingere il manicotto termorestringente sul mandrino in modo che si muova liberamente. Quindi posizionare il mandrino all'interno dello stampo di vetro e fissare l'anello A-P-T-F-E alla parte inferiore del mandrino. Verificare che l'anello in PTFE sia ben aderente al fondo dello stampo in vetro.

Quindi, usando una spatola e un imbuto di gomma siliconica, aggiungi i porridge di particelle di sale allo stampo di vetro. Quindi picchiettare delicatamente lo stampo con la spatola per una distribuzione uniforme delle particelle e raschiare via il sale in eccesso. Ora spegni l'incubatrice riscaldata e caricala rapidamente Con gli stampini confezionati con il sale, il sale si fonderà nei successivi 30 minuti, dopodiché asciuga gli stampini in un forno sottovuoto a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno successivo al raffreddamento, rimuovere il mandrino in acciaio inossidabile dagli stampi spingendolo verso l'esterno e fissando l'anello in PTFE. Se necessario, utilizzare una pinza ad ago. Quindi rimuovere l'anello in PTFE dal fondo dello stampo.

Quindi, cuocere gli stampini per restringere la manica e rimuovere le maniche rimpicciolite dagli stampi. Lasciare raffreddare gli stampini fino al momento dell'utilizzo e conservarli in un essiccante in una cappa. Usando il contagocce apo, inclinare gli stampi di vetro a 45 gradi e far cadere la soluzione PGS nel loro lume interno mentre ruotano lentamente lo stampo.

Controllare se la soluzione PGS scorre lungo la parete dello stampo. Se c'è un punto asciutto, aggiungere altro PGS Ora lasciare evaporare il THF nella cappa per almeno 30 minuti. Una volta esaurito il THF, polimerizzare gli stampi in un forno sottovuoto.

Dopo l'indurimento per un giorno, raffreddare gli stampini a temperatura ambiente e immergerli lentamente e verticalmente in acqua deionizzata a 24 gradi Celsius. Inclinarli troppo rapidamente crea bolle d'aria, che strappano l'impalcatura. Trasferire con cura gli stampi a bagnomaria.

Posizionali ad angolo usando un tubo di silicone e lascia che l'acido ialuronico si sciolga per un'ora. Se dopo un'ora l'acido ialuronico non è uscito dallo stampo, con lo stampo ancora sommerso, utilizzare una spatola per spingere lentamente l'acido ialuronico da entrambe le estremità, quindi agitare lentamente lo stampo. Ora, controlla che le impalcature non si siano spostate all'interno dello stampo di vetro e, in tal caso, tira lentamente l'impalcatura con una pinza per liberarla dallo stampo.

Quindi, lisciviare le particelle di sale trasferendo con cura le delicate impalcature in un bagno d'acqua deionizzato mescolando delicatamente. Questo richiederà almeno tre giorni e richiede che l'acqua venga cambiata ogni giorno Dopo che il sale è stato lisciviato, trasferisci ogni impalcatura in una provetta da centrifuga da 15 millilitri riempita con acqua deionizzata e congelali in una scatola di ghiaccio secco per un'ora. Mettere le provette da centrifuga congelate in un liofilizzatore per tre giorni con i tappi aperti.

Una volta liofilizzati, conservare gli scaffold in un essiccante fino al momento dell'utilizzo. Inizia tagliando le impalcature in lunghezze da 25 a 30 millimetri. Quindi, preparare due tappi in gomma siliconica inserendo il tubo in PTFE attraverso i fori centrali di ciascun tappo.

Quindi tagliare un millimetro e mezzo di anello e farne scorrere una lunghezza su un'estremità dell'impalcatura. Spingere un tubo in PTFE attaccato al tappo nella stessa estremità dell'impalcatura con una sovrapposizione appena sufficiente da essere sotto l'anello HS per collegare saldamente l'impalcatura al tubo, restringere l'anello HS in un forno e lasciare raffreddare il gruppo a temperatura ambiente. Ora, un tubo in policarbonato da 50 millimetri, che funge da camera del bioreattore, viene fatto scivolare sopra l'impalcatura e fissato sulla superficie interna del tappo in gomma siliconica.

Proprio come prima, un altro tubo in PTFE e un tappo sono fissati all'altra estremità dell'impalcatura con un anello hs per completare la camera. Il secondo tappo è fissato all'altra estremità del tubo in policarbonato. Successivamente, le superfici esterne dei tappi sono fissate a due piastre in lega di alluminio.

Inserire due barre filettate nel foro laterale su ciascuna piastra e fissare le piastre con viti a testa zigrinata. Fissare l'impalcatura al bioreattore. Ora misura la lunghezza visibile di ogni impalcatura, che è la distanza tra due anelli hs, e calcola le loro aree di superficie interna.

Per la semina cellulare. In un'autoclave, sterilizzare le camere avvolte singolarmente in un foglio insieme a ciascuna parte dell'unità del bioreattore. Una volta sterilizzato, assemblare il bioreattore all'interno di una cappa di coltura cellulare.

Pretrattare e risciacquare il ponteggio con una serie di perfusioni utilizzando una pompa peristaltica ad un millimetro al minuto nel circuito di flusso. Inizia risciacquando con etanolo al 70%, etanolo al 50% e poi etanolo al 25% per un'ora ciascuno. Seguire i tre risciacqui con etanolo con un risciacquo PBS di due ore.

Infine, perfondere il bioreattore con terreno di coltura SMC per 24 ore, dopodiché è pronto per la semina cellulare e la sperimentazione. Ora, seguendo le istruzioni nel manoscritto allegato, seminare il bioreattore con 2 milioni di cellule per centimetro quadrato e, nei prossimi 21 giorni, cambiare il mezzo del tubo e apportare modifiche alla velocità della pompa. Gradualmente, la pressione nel costrutto aumenterà da circa quattro millimetri di mercurio il primo giorno di coltura a oltre 100 millimetri di mercurio dopo due settimane di coltura, dopo tre settimane di coltura, raccoglierà le cellule e le preparerà per l'analisi come specificato nel manoscritto di accompagnamento.

Questi scaffold tubolari PGS sono stati fabbricati con il metodo della fusione salina. Le micrografie elettroniche a scansione hanno dimostrato che tutti gli scaffold avevano spessori di parete omogenei e non c'erano difetti parziali nelle loro sezioni trasversali. Macro e micropori distribuiti in modo casuale sono stati osservati sulla superficie luminale di tutti gli scaffold.

Dopo la coltura cellulare, le SMC multistrato sono cresciute con un orientamento perpendicolare alla direzione del flusso. Inoltre, le cellule e le proteine DCM coprivano completamente il lume di tutti i costrutti PGS. L'autofluorescenza dell'elastina ha anche mostrato fibre elastiche organizzate circonferenzialmente sulla superficie luminale del costrutto.

Dopo aver visto questo video, dovresti aver capito come realizzare un'impalcatura tubolare porosa, vedere le cellule e l'impalcatura di coltura utilizzando un bioreattore pre-progettato.