Name: Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Impara a generare innesti vascolari ingegnerizzati con cellule staminali PiPSC in un modello murino. Questo metodo utilizza bioreattori per la doppia semina su scaffold decellularizzati, dimostrando la fattibilità per applicazioni in medicina rigenerativa.

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Questo lavoro è stato supportato da The British Heart Foundation e The Oak Foundation.

Eseguire tutti gli esperimenti su animali secondo protocolli approvati dal Comitato istituzionale per l&#39;uso e la cura di animali da laboratorio. 1. Preparazione della cultura media <ol><li> Fai terreni di coltura per la linea cellulare di fibroblasti umani CCL-153: F-12K Medium, siero fetale bovino 10% (FBS) e 100 U / ml di penicillina e la streptomicina. </li><li> Fai riprogrammazione supporti per la generazione PiPSC: mezzo di Eagle modificato di Knockout Dulbecco (DMEM) contenente il 20% Knockout siero sostituzione, 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 0.1 Minimum mM Essential Medium (MEM) non-aminoacidi essenziali, 10 ng / ml di base del fattore di crescita dei fibroblasti 2 (bFGF-2) e 100 U / ml di penicillina e streptomicina. Aggiungi bFGF-2 al momento ogni volta prima di usare i media. </li><li> Rendere Differenziazione media (DM) per indurre cellule muscolari lisce (SMC) differenziazione: α-MEM supporti contenente 10% FBS, 0,1 mM β-mercaptoetanolo, 100 U / ml penicillina e streptomicina e 25 ng / ml Platelet Derived Growth Factor(PDGF-ββ). </li><li> Fai endoteliale Differenziazione media (CE-DM) per indurre cellule endoteliali (EC) differenziazione: crescita endoteliale media-2 (EGM-2) supporto contenente 50 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) e 100 U / ml di penicillina e la streptomicina. </li></ol> 2. fibroblasti umani Riprogrammare in Parzialmente-cellule staminali pluripotenti indotte (PiPSC) <ol><li> Culture linea cellulare di fibroblasti umani CCL-153 0,04% su fiasche rivestite soluzione di gelatina in mezzo di coltura. </li><li> Cellule Passage ogni 3 giorni con un rapporto di 1: 6. Utilizzare le cellule prima del passaggio 9 per l&#39;efficienza ottimale di generazione PiPSC. Le cellule sono pronte per la trasfezione upon raggiunge l&#39;80 - 90% di confluenza. </li><li> Linearizza pCAG2LMKOSimO plasmide policistronica contenente 4 fattori di riprogrammazione ottamero vincolante fattore di trascrizione 4 (OCT4), SOX2, fattore Kruppel-like 4 (Klf4) e C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 mg di plasmide con 5 unità di enzima di restrizione Pvul per 3 ore a 37 ° C. Purificareil plasmide con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. </li><li> Trasfettare 2 x 10 6 fibroblasti umani con 4 mg di linearizzato pCAG-OSKM plasmide di elettroporazione con kit di fibroblasti del derma umano (NHDF) nucleofection secondo il protocollo del produttore. Sementi delicatamente cellule trasfettate sul pre 0,04% di gelatina rivestito pallone T25 contenente 5 ml di pre-riscaldato Riprogrammazione media. </li><li> Dopo 24 ore, cambiare mezzo con supplementi di 25 mg / ml neomicina per selezionare una popolazione pura di cellule trasfettate. </li><li> Cambiare medio a giorni fino al giorno 4. Nota: fibroblasti umani diventano PiPSC dopo 4 giorni di riprogrammazione. </li></ol> 3. Differenziazione dei PiPSC in endoteliali e cellule muscolari lisce <ol><li> PiPSC Seed su piatti collagene IV pre-rivestite contenenti DM per 4 giorni di indurre la differenziazione in SMC. Cambiare medio a giorni fino al giorno 4. </li><li> PiPSC Seed sul collagene IV pre-rivestite piatti containing endoteliale-DM per 6 giorni per indurre il differenziamento in cellule endoteliali. Cambiare medio a giorni fino al giorno 6. </li></ol> 4. decellularized Aorta Graft Preparazione Nota: Tutte le soluzioni e le attrezzature devono essere sterili. <ol><li> Sacrifica il mouse per dislocazione cervicale e fissare il mouse in posizione supina al microscopio di dissezione. </li><li> Tagliare lo sterno e intorno alla gabbia toracica per aprire la cavità toracica. Rimuovere il cuore, i polmoni e dell&#39;esofago per esporre l&#39;aorta. Rimuovere delicatamente il grasso peri-aorta con una pinza. </li><li> Tagliare l&#39;aorta dalla estremità anteriore con le forbici e tenere delicatamente l&#39;estremità con una pinza smussato. Staccare l&#39;aorta dalla colonna spina dorsale dietro per via smussa. Chiudere accuratamente tutte le arterie si diramano dall&#39;aorta da legatura con elettrocoagulatore bipolare e il taglio dal fondo della legatura con le forbici. </li><li> Utilizzare una siringa da 5 ml per irrigare il lume aorta con 3 ml di soluzione salina contenente 100 U di eparina per prevenire la formazione di coaguli di sangue. </li><li> Tagliare l&#39;estremità posteriore della aorta prima si dirama nel renale. Mantenendo l&#39;integrità della aorta è molto importante durante l&#39;intera procedura. </li><li> Lavare lume aorta con 5 ml di soluzione 0,075% sodio dodecil solfato (SDS) diluita in tampone fosfato (PBS). </li><li> Mettere a bagno l&#39;aorta toracica in 0,075% soluzione SDS in una capsula di Petri 10 cm. Porre la capsula Petri in un agitatore orbitale per 2 ore a 150 rpm a RT. </li><li> Lavare lume aorta con 5 ml di PBS. </li><li> Immergere l&#39;aorta in PBS in una capsula di Petri 10 cm. Porre la capsula Petri sul agitatore orbitale per 2 ore a 150 giri al minuto a temperatura ambiente. Aggiorna PBS ogni 20 min. </li><li> Lavare lume aorta con 5 ml di PBS. </li><li> Tenere decellularized trapianto dell&#39;aorta in PBS a 4 ° C per un massimo di una settimana. </li></ol> 5. Doppio Semina di PiPSC e bioreattore condizionata Nota: Tutti soluziones ed apparecchiature devono essere sterili. Eseguire tutte le operazioni in una cappa di coltura di tessuti. <ol><li> Assemblare il circuito di flusso bioreattore come illustrato in figura 1. Collegare camera di incubazione, serbatoio media, pompa peristaltica e la camera rispetto tubazione. Il volume minimo di supporto necessari per la circolazione è di 40 ml. </li><li> Pre-condizione di nave decellularized con terreno di coltura immergendo l&#39;aorta in mezzo DM in una capsula di Petri 10 cm. Porre la capsula Petri l&#39;agitatore orbitale per 1 ora a 50 rpm a RT. </li><li> Inserire uno centimetri tubi lunghezza Nylon (OD 0,9 millimetri, ID 0,75 millimetri) in entrambe le estremità della nave decellularized al microscopio. Legare la nave e le provette con 8-0 punti di sutura in seta. </li><li> Montare l&#39;innesto aorta decellularized nella camera di incubazione collegando i tubi di nylon con le porte di ingresso e di uscita (1/32 &quot;tubi) dalla parete della camera. Mantenere camera di incubazione con 5mls di media ogni volta. </li><li> Trypsinize PiPSC aggiungendo pre-riscaldatotripsina per coprire il piatto cultura e oscillare delicatamente il piatto 10 volte. Eliminare la tripsina e lasciare il piatto in incubatrice per 2 - 3 min. Aggiungere mezzo di coltura pre-riscaldato nel piatto e miscelare il mezzo con le cellule. </li><li> Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare due aliquote di sospensioni cellulari contenenti 5 x 10 5 cellule ciascuno per 5 min a 300 x g. Aspirare completamente il surnatante. </li><li> Dopo aspirando completamente il surnatante, risospendere 1 pellet delle PIP pellet cellulari in 50 ml di DM. Iniettare la sospensione cellulare nel lume del vaso decellularized. </li><li> Poi, risospendere il pellet altro Pips cellulare in 100 ml di Matrigel. Pipetta con cura il composto sulla aorta trapianto decellularized. </li><li> Attendere 10 - 15 minuti fino a quando la miscela si trasforma in uno stato simile a gel e uniformemente avvolge intorno alla superficie esterna del serbatoio. Riempire la camera di incubazione con DM. </li><li> Mettere il tutto in una impostazione di CO 2 incubatore 5% bioreattore a 37 ° C. Ruotare manualmente l&#39;innesto decellularized 90 ° intorno all&#39;asse longitudinale ogni mezz&#39;ora nel primo 2 hr. </li><li> Tenere cultura statica per 12 ore per permettere l&#39;adesione cellulare. </li><li> Invia DM attraverso il lume dalla pompa peristaltica di indurre il differenziamento delle cellule muscolari lisce. Inizia portata iniziale a 5 ml / min e aumento graduale a 20 ml / min oltre 24 ore. </li><li> Mantenere il flusso medio circolante a 20 ml / min per 24 ore. </li><li> Arrestare il flusso medio e spostare la definisce dell&#39;incubatore bioreattore. </li><li> Re-seme lume dell&#39;innesto con PiPSC. Trypsinize, contare e centrifugare 1 x 10 6 PiPSC come in passaggi 5,5-5,6. Risospendere le cellule in 50 ml di EGM-2 di media contenenti 50 ng / ml VEGF. Iniettare la miscela di cellule nel lume del trapianto. </li><li> Cambiare la media nella camera di incubazione e tutta la circolazione a EGM-2 terreno contenente 50 ng VEGF / ml di indurre il differenziamento endoteliale. </li><li> Spostare l&#39;impostazione torna th bioreattoree incubatore. Ruotare manualmente l&#39;innesto di 90 ° ogni 30 min nelle prime 2 ore e poi mantenere una cultura statica per 12 ore. </li><li> Inizia circolante flusso da 5 ml / min e aumento graduale a 35 ml / min. Mantenere la portata a 35 ml / min per 5 giorni. Cambia circolante e media camera ogni altro giorno. </li><li> Raccolto l&#39;innesto progettato per un&#39;ulteriore innesto di mouse. </li></ol> 6. Accrescimento di doppia testa di serie PiPSC Graft in Mice <ol><li> Utilizzare NOD.CB17-Prkdc SCID / NcrCrl topi maschi come destinatari nave innesto. Assicurarsi sempre che i topi sono circa 10 settimane di vita, pesano circa 25 - 35 g, e sono in buone condizioni di salute. </li><li> Anestetizzare topo ricevente somministrando una combinazione di Hypnorm (25 mg / kg) e Hypnovel (25 mg / kg) per via intraperitoneale. Applicare vaselina pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Confermare anestesia efficiente assicurando che i topi hanno muscoli rilassati e respirano costantemente. <ol><li> Fissare il mouse in posizione supina con il collo rasato ed esteso. Somministrare atropina solfato (1,7 mg / kg) in combinazione con gli anestetici per assicurare che il tratto respiratorio mouse rimane chiaro. </li></ol></li><li> Preparare una incisione mediana della mandibola sterno del mouse. Sotto un microscopio da dissezione con 5- a 10 volte di amplificazione, sollevare le ghiandole salivari giuste lateralmente e rimuovere il muscolo cleidomastoid diritto di esporre la carotide comune destra. </li><li> Rimuovere delicatamente tessuti allegate mobilitare destra carotide comune dall&#39;estremità distale verso l&#39;estremità prossimale. Legare la porzione centrale della carotide comune due volte con una sutura di seta 8-0 e sezionare tra i due legami. </li><li> Passare attraverso un bracciale in tubo di nylon autoclavabile in ogni estremità nave e fissare ogni estremità con fascette microhemostat. </li><li> Rimuovere sutura cravatta su un&#39;estremità e applicare una goccia di eparina (100 U / ml). Subito dopo, invertire l&#39;estremità distale della the dell&#39;arteria per coprire l&#39;intero corpo bracciale e fissare il vaso invertita con una sutura di seta 8-0 al bracciale. <ol><li> Ripetere la stessa procedura per l&#39;altra porzione dell&#39;arteria. Arteria Lavare con soluzione fisiologica per rimuovere coaguli di sangue. </li></ol></li><li> Impiantare un innesto nave decellularized tra due estremità della carotide facendo scorrere le estremità dei vasi decellularized degli oltre polsini arteria e fissandolo con suture di seta 8-0. Rimuovere pinze vascolari da entrambi termina prima di valutare la pulsazione dell&#39;innesto. </li><li> Posizionare la ghiandola salivare destra nella sua posizione originaria. Chiudere la pelle sul luogo chirurgica con sutura interrotta con una sutura 6-0 polyglactin. </li><li> Coerentemente osservare i segni vitali del mouse dopo la procedura è completata, fino a quando non riprende coscienza. Sacrificio topi riceventi da cervicali dislocazione e dei vasi di raccolta innesti o 24 ore o 3 settimane più tardi per ulteriori analisi. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari in conflitto.

Il protocollo attuale indica un suono, veloce strategia, semplice, efficiente e riproducibile in cui i vasi ingegneria tessutale funzionali possono essere generati utilizzando PiPSC da fibroblasti umani. Questa tecnica rappresenta uno strumento prezioso per la medicina rigenerativa, l&#39;ingegneria dei tessuti e terapia cellulare potenzialmente paziente-specifica in un prossimo futuro. Passaggi critici per assicurare l&#39;efficacia del protocollo comprendono la preparazione di PiPSC, preparazione di innesti aortica st...

La costruzione di condotti vascolari è una strategia fondamentale per la riparazione chirurgica di vasi danneggiati e feriti derivanti da malattie cardiovascolari. Ad oggi, materiali protesici utilizzati in chirurgia includono polimeri sintetici biocompatibili (politetrafluoroetilene [Teflon], politetrafluoroetilene espanso [ePTFE, Gore-Tex] o polietilene tereftalato [Dacron]), trapianti, tessuto autologo (pericardio o vena safena) e xenotrapianti 1. Mentre innesti artificiali (ad esempio, Gore-Tex e Dacron) sono più comunemente utilizzati, questi materiali possono causare numerose complicazioni a breve e lungo termine, che includono la stenosi, deposizione di calcio, trombo-embolizzazione e infezioni. Anche se i pazienti con innesti biologici presentano diminuite eventi tromboembolici, che ancora incontrano limitazioni come ad esempio il fallimento del trapianto secondario e durata accorciata a causa di calcificazione degrado 2. Pertanto, nonostante i significativi miglioramenti in t chirurgicaechniques corso degli anni, ricercatori e clinici sono ancora gravati con la necessità di individuare il condotto ideale per le malattie vascolari. Più recentemente, il campo di ricerca di ingegneria del tessuto vascolare ha generato un concetto in cui le cellule sono incorporati in scaffold biodegradabili, con lo scopo di creare un ambiente biomimetico che esemplifica una nave funzionale per successo innesto 1. Fondamentalmente, il successo dei costrutti vascolari dipendono tre componenti essenziali; cellule che compongono il ponteggio, cioè, uno strato interno di cellule endoteliali e di uno strato di cellule muscolari lisce, un&#39;impalcatura contenente la matrice extracellulare appropriata per fornire proprietà meccaniche paragonabili alla vascolarizzazione nativa, e la segnalazione molecolare / cellulare che è richiesto per avviare / regolazione riparazione. Lungo pervietà dell&#39;innesto termine e lo sviluppo sostenibile dei neo-tessuti sono altamente dipendenti semina cellulare efficace di ponteggi, thereby rendendo la decisione di tipo di cellula di importanza critica. Diverse relazioni dimostrano l&#39;uso di cellule endoteliali mature e cellule muscolari lisce da varie fonti di sviluppare condotte di piccolo diametro 3-6. Sebbene promettenti, la mancanza di vasi autologhi sufficienti per ottenere endoteliali mature e cellule muscolari lisce rimangono un onere considerevole. Più di recente, le cellule staminali provenienti da diverse fonti sono state sfruttate per applicazioni di ingegneria dei tessuti vascolari. Cellule mononucleate Infatti, una varietà di tipi di cellule staminali comprese le cellule staminali embrionali 7, indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, derivate dal midollo osseo 12, cellule staminali mesenchimali 13, cellule progenitrici endoteliali della parete vasale e adulti -derived cellule staminali antigene-1 (Sca-1) + cellule staminali / progenitrici 14,15 sono stati tutti dimostrato di essere in grado di differenziarsi in cellule endoteliali sia funzionale o muscolari lisce in risposta ai media definiti econdizioni di coltura. Inoltre, la capacità di auto rinnovamento illimitata delle cellule staminali le rendono migliori candidati a differenza endoteliali mature e cellule della muscolatura liscia che può dividere solo per un numero finito di volte prima di subire l&#39;arresto della crescita e senescenza. La selezione del materiale per generare scaffold tessuto successo nave progettata per l&#39;innesto dipende da diversi fattori quali la biocompatibilità, le proprietà biomeccaniche, e il tasso di biodegradazione. Fondamentalmente, i materiali usati per creare scaffold per gli innesti devono essere biodegradabili e non verranno montati destinatario inutili risposte immunitarie. Inoltre, esso deve comprendere una porosità e microstruttura adatto per il fissaggio e la sopravvivenza cellulare successiva. Ad oggi, i materiali più comuni utilizzati per ponteggi in ingegneria dei tessuti vascolari comprendono polimeri dell&#39;acido poliglicolico, acido polilattico, e poli ε-caprolattone 16. Più recentemente, materiali biologici decellularized hannoanche state applicate con successo. Diversi laboratori hanno dimostrato che la semina umana decellularized, cane o vasi suina con cellule autologhe fornito un innesto biologico che ha resistito coagulazione e iperplasia intimale 17-19. Altre strategie di ingegneria del tessuto vascolare includono innesti vascolari extracellulari a base di proteine ​​della matrice ad esempio, cellule semina in fibrina gel 13 e generando fogli cellulari senza supporto impalcatura 20, 21. L&#39;attuale protocollo dimostra la differenziazione di PiPSC umana in endoteliale funzionale e cellule muscolari lisce, la generazione di un bioreattore costituito da un ponteggio nave decellularized per porto cellule vascolari PiPSC-derivati ​​funzionali, e l&#39;innesto dei vasi ingegneria tessutale in grave immunodeficienza combinata (SCID ) topi. PiPSC sono un tipo di cellule ottimale da utilizzare per l&#39;ingegneria dei tessuti di innesti per vasi, perché queste cellule non formano tumori in topi o sollevano eticorisposte allo-immunitarie. Inoltre, abbiamo dimostrato che la strategia per la generazione di cellule muscolari Pip-cellule endoteliali e semi-liscio è efficiente e riproducibile 10,11. Successivamente, abbiamo progettato una nave decellularized per la semina delle cellule vascolari PiPSC derivate per imitare da vicino le proteine ​​della matrice che esiste all&#39;interno di un vaso nativo, aumentando così l&#39;innesto e la sopravvivenza di efficacia. Inoltre, la decellularization dei vasi prima PiPSC semina impedisce il verificarsi di risposte infiammatorie montati da tipi di cellule immunitarie quali macrofagi. Ancora più importante, questo protocollo non rappresenta solo un metodo per generare promettenti condotti vascolari per la traduzione in esseri umani, ma fornisce anche strumenti preziosi di studio e la comprensione dei meccanismi molecolari che regolano la rigenerazione del tessuto vascolare attraverso modelli di mouse.

<table><tbody><tr><td>Fibroblasti umani CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Fibroblasti embrionali umani prenatali</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Medium (modifica di Kaighn del terreno F-12 di Ham)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino ATCC</td><td></td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM medium ottimizzato per cellule staminali embrionali</td><td>Tecnologie per la vita (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologie per la vita sostitutiva del siero knockout</td><td>(Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2&nbsp di base umano&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alfa-MEM medium</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF</td><td>R& D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di gelatina 2%</td> <td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Enzima di restrizione PvuI</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sterilizzazione (kit NHDF)</td> <td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, illuminazione per stereomicroscopia</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Illuminazione a luce fredda per stereomicroscopia</td></tr><tr><td>Nikon Zoom Steromicroscopio SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sale sodico</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS Soluzione madre Reagente di biologia molecolare</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di Dulbecco Soluzione salina tamponata</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10mg/ml)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore IKA Vibrax con piattaforma di agitazione VX 7&nbsp;</td><td>Jepson Bolton's, Janke & Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Azionamento digitale</td><td>della pompa Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6 canali, testa della pompa a cartuccia a 6 rulli</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S cartucce grandi per testa della pompa</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Tubo della pompa in silicone polimerizzato al platino Masterflex, L/S 14, 25 piedi</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>Il tubo passa attraverso la pompa peristaltica</td></tr><tr><td>0,5 mm di diametro interno, 0,8 mm di diametro esterno Tubo in silicone</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>I tubi collegano la camera di incubazione, il serbatoio del terreno e la camera di conformità&nbsp;</td></tr><tr><td>Raccordo Riduttore da 0,5 a 1,6, naturale Polipropilene</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adattatore collegare sopra due tipi di tubi</td></tr><tr><td>Tubo da 1/32", ID 0,01" (250&micro; m) Materiale: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Tubo attraverso la parete della camera di incubazione che collega l'innesto con il tubo esterno</td></tr><tr><td>Raccordi monopezzo&nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Fissare i tubi di cui sopra attraverso la parete della camera di incubazione</td></tr><tr><td>Tubi in nylon (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm)&nbsp;</td>I tubi <td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>si inseriscono in due estremità del NOD dell'innesto dell'aorta</td></tr><tr><td>. CB17-Prkdcscid/NcrCrl topo</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture chirurgiche, seta 8-0&nbsp;</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgesico per l'uso nei topi</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Induzione di anestesia</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in nylon</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0,65 mm di diametro e 1 mm di lunghezza; per fare la cuffia delle arterie</td></tr><tr><td>Elettrocoagulatore</td><td>Martin&nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Legatura dei rami delle arterie sull'aorta</td></tr><tr><td>Micro pinza emostatica bipolare</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Fissazione delle estremità dei vasi</td></tr><tr><td>Dilatatore dei vasi</td><td>S& T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Dilatatore del vaso</td><td>S & T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>dilatatore del vaso</td><td>S & T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini applicatore&nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Clip per micro emostati</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Suture chirurgiche, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

La costruzione di condotti vascolari è una strategia fondamentale per la riparazione chirurgica di vasi danneggiati e feriti derivanti da malattie cardiovascolari. L'attuale protocollo presenta una strategia efficiente e riproducibile in cui è possibile generare innesti di vasi funzionali di ingegneria tissutale utilizzando cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte (PiPSC) da fibroblasti umani. Abbiamo progettato un bioreattore decellularizzato per scaffold navali, che imita da vicino la struttura proteica della matrice e il flusso sanguigno che esiste all'interno di un vaso nativo, per la semina di cellule endoteliali PiPSC o cellule muscolari lisce prima dell'innesto nei topi. Questo approccio si è dimostrato vantaggioso perché i topi immunodeficienti innestati con gli innesti derivati da PiPSC presentavano un tasso di sopravvivenza marcatamente aumentato 3 settimane dopo l'intervento chirurgico. Questo protocollo rappresenta uno strumento prezioso per la medicina rigenerativa, l'ingegneria tissutale e la terapia cellulare potenzialmente paziente-specifica nel prossimo futuro.

La generazione di successo di PiPSC stata confermata 4 giorni dopo nucleofecting fibroblasti umani con un plasmide pCAG2LMKOSimO linearizzato portando 4 fattori di trascrizione, Oct4, Sox2 Klf4 e c-Myc (OSKM). PiPSC visualizzato un fenotipo nettamente distinti rispetto ai fibroblasti (Figura 2A) ed espressa 4 fattori di riprogrammazione a mRNA (Figura 2B) e di proteine ​​(Figura 2C) 10 livelli. L&#39;efficacia di un innesto vascolare basato PiPSC è fortemente...

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare ingegneria dei tessuti dei vasi innesti che sono funzionali per l&#39;innesto in topi con un doppio semina cellule staminali pluripotenti indotte in parte (PiPSC) - derivato cellule muscolari lisce e PiPSC - cellule endoteliali derivate su una nave decellularized ponteggio bioreattore.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare innesti vascolari ingegnerizzati a livello tissutale che siano funzionali per il trapianto in topi. Questo viene ottenuto innanzitutto riprogrammando fibroblasti umani in cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte in vitro, le quali sono in grado di differenziarsi in cellule endoteliali e cellule muscolari lisce. Successivamente, viene rimossa un'aorta da un topo sacrificato e decellularizzata con soluzione di sodio dodecil solfato o soluzione SDS per preparare gli innesti aortici decellularizzati.Successivamente, il circuito di flusso del bioreattore viene predisposto per il seeding doppio di cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte. L'ultimo passaggio consiste nell'impianto del graft di cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte, precedentemente sottoposte a seeding doppio, nei topi. Infine, l'analisi dei tassi di mortalità nei topi a tre settimane dall'impianto viene utilizzata per dimostrare la funzionalità dei grafts vascolari ingegnerizzati.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie cardiovascolari poiché è stato dimostrato che genera con successo vasi sanguigni fu

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Bioingegneria

Descriviamo una tecnica in cui viene trapiantato una sezione dell'aorta addominale di un topo ortotopicamente a appena sotto le arterie renali di un destinatario allogenici o singenici. Questa tecnica può essere utile in studi in cui si considera il trapianto di grandi arterie di dimensioni uniformi vantaggiosa.

Aortica trapianto ortotopico in Mouse per lo studio della malattia vascolare

Descriviamo i protocolli per i nostri arteriosclerois innesto del mouse (GA) modelli che comportano l'interposizione di un segmento di vaso del mouse in un destinatario dello stesso ceppo inbred. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, il modello è in grado di valutare l'effetto di geni specifici in GA.

Modelli murini per l&#39;arteriosclerosi Graft

Il modello murino di trapianto di cuore cervicale è adatto per immunologica nonché studi danno da ischemia riperfusione. Abbiamo modificato la procedura utilizzando una tecnica bracciale non sutura ed eseguito più di 1.000 trapianti di successo con questo approccio.  Qui, forniamo ulteriori dettagli di questa tecnica per integrare il video.

Murino cervicale Cuore trapianto Modello utilizzando una tecnica Cuff Modificato

Per migliorare la nostra conoscenza della formazione neotissue cellulare e molecolare, un modello murino della TEVG è stata sviluppata di recente. Gli innesti sono stati impiantati come infrarenali innesti vena cava interposizione di C57BL / 6 topi. Questo modello raggiunge risultati simili a quelli ottenuti nella nostra ricerca clinica, ma nel corso di un time-course di gran lunga ridotto.

L&#39;impianto di Vena cava inferiore Interposizione Graft in modello murino

Un protocollo step-by-step per il collocamento inter-posizionale di ingegneria tessutale Vessels (TEV) nella carotide di una pecora con anastomosi end-to-end e di valutazione digitale in tempo reale in vivo fino al sacrificio degli animali.

Tecnica chirurgica per l&#39;impianto di ingegneria tessutale vascolari Innesti e successive<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio

Per studiare l'allotrapianto combinato di organi solidi e composito vascolarizzato, descriviamo un nuovo modello eterotopico di trapianto di parete toracica, timo e cuore nei topi utilizzando una tecnica di cuffia cervicale senza sutura.

A Novel microchirurgica modello per eterotopica, in blocco parete toracica, Timo, e trapianto cardiaco nei topi

Vi presentiamo un modello aortico trapianto ortotopico utilizzando la tecnica di manica in topi. È un metodo molto rapido anastomosi, che possa essere impiegato negli studi della malattia vascolare.

Utilizzando la tecnica di manica in un modello murino di trapianto aortico - un Video didattico

Stenosi dell'innesto per rappresentare un ostacolo critico in sostituzione di tessuto ingegnerizzato delle vie respiratorie. Per studiare i meccanismi cellulari alla base di stenosi, utilizziamo un modello murino di tessuti ingegnerizzati sostituzione tracheale con cellule mononucleari seminato del midollo osseo (BM-MNC). Qui, abbiamo dettaglio nostro protocollo, compreso produzione dell'impalcatura, BM-MNC isolamento, innesto semina e l'impianto.

Semina e impianto di un innesto trachea tessutale biosintetico in un modello murino

I modelli di trapianto cardiaco murino rappresentano preziosi strumenti di ricerca per lo studio dell'immunologia dei trapianti. Il presente protocollo descrive il trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo che prevede il posizionamento di polsini sull'arteria carotide comune del ricevente e sul tronco dell'arteria polmonare del donatore per consentire il flusso sanguigno laminare.

Trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo utilizzando bracciali vascolari

Qui, viene presentato un protocollo per l'impianto di un innesto vascolare di ingegneria tissutale nell'arteria carotide di topo utilizzando la tecnica della cuffia, fornendo un modello animale adatto per studiare i meccanismi di rigenerazione del tessuto vascolare.

Impianto di innesto vascolare di ingegneria tissutale nell'arteria carotide di topo tramite tecnica della cuffia

Questo studio presenta un modello suino per la valutazione di innesti di piccolo diametro nelle arterie femorali. Il modello imita la dinamica vascolare umana e valuta in modo completo la pervietà dell'innesto, l'emodinamica e il rimodellamento vascolare. Offre una preziosa piattaforma per testare gli innesti vascolari e monitorarli con l'ecografia Doppler e l'angiografia.

Impianto di innesto vascolare femorale in un modello suino per testare innesti vascolari di piccolo diametro

Impara a generare innesti vascolari ingegnerizzati con cellule staminali PiPSC in un modello murino. Questo metodo utilizza bioreattori per la doppia semina su scaffold decellularizzati, dimostrando la fattibilità per applicazioni in medicina rigenerativa.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

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