Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

L'obiettivo generale di questa procedura è generare innesti di vasi di ingegneria tissutale funzionali per l'innesto nei topi. Ciò si ottiene riprogrammando prima i fibroblasti umani in cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte in vitro, che sono in grado di differenziarsi in cellule endoteliali e muscolari lisce. Un'aorta viene quindi rimossa da un topo sacrificato e decellularizzata con doda solfato di sodio o soluzione SDS per preparare gli innesti di aorta decellularizzata.

Successivamente, il circuito di flusso del bioreattore è impostato per la doppia semina di cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte. La fase finale è l'innesto di cellule staminali pluripotenti a doppia semina e parzialmente indotte nei topi. In definitiva, l'analisi dei tassi di mortalità dei topi tre settimane dopo l'innesto viene utilizzata per mostrare la funzionalità degli innesti di vasi di ingegneria tissutale.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia delle malattie cardiovascolari perché è stato dimostrato che genera con successo vasi sanguigni funzionali utilizzando le cellule PIPS in un breve periodo di tempo. In generale, è molto importante mantenere l'innesto del vaso intatto e sterile durante l'intera procedura, soprattutto per le persone che non conoscono questo metodo. Iniziare questa procedura con la riprogrammazione dei fibroblasti umani in cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte o cellule PIPS sezionando le cellule con quattro microgrammi di plasmide OSKM linearizzato utilizzando un kit di affezione nucleare di fibroblasti dermici umani.

I fibroblasti umani diventano cellule PIPS dopo quattro giorni di riprogrammazione. A seguito del sacrificio del topo per lussazione cervicale. Mescolare il topo in posizione supina sotto un microscopio da dissezione.

Quindi tagliare lo sterno e intorno alla gabbia toracica per aprire la cavità toracica. Rimuovere il cuore, i polmoni e l'esofago per esporre l'aorta, quindi rimuovere delicatamente il grasso della peri aorta con una pinza. Taglia l'aorta dall'estremità anteriore con le forbici e tieni delicatamente l'estremità con una pinza smussata.

Quindi staccare l'aorta dalla colonna vertebrale dietro mediante dissezione smussata. Chiudere accuratamente tutte le arterie ramificate dall'aorta mediante legatura con elettrocoagulatore bipolare e taglio dall'estremità della legatura con le forbici. Utilizzare una siringa da cinque millilitri per lavare il lume dell'aorta con tre millilitri di soluzione salina contenente 100 unità di eparina.

Per prevenire la formazione di coaguli di sangue, tagliare l'estremità posteriore dell'aorta prima che si ramifica nel renale. Mantenere l'integrità dell'aorta è molto importante durante l'intera procedura. Successivamente, lussureggia il lume dell'aorta con cinque millilitri di 0,075.

Il solfato di sodio dool o la soluzione SDS diluita in soluzione salina tampone fosfato o PBS immergono l'aorta rasica in una soluzione SDS allo 0,075% in una capsula di Petro da 10 centimetri su un agitatore orbitale per due ore a 150 giri/min a temperatura ambiente. Quindi spazzolare il lume dell'aorta con cinque millilitri di PBS. Successivamente, immergere l'aorta in PBS in una capsula di Petro da 10 centimetri e posizionare la capsula di Petro sull'agitatore orbitale a 150 RPM per due ore a temperatura ambiente.

Aggiornamento del PBS ogni 20 minuti dopo due ore. Arrossire il lume dell'aorta con cinque millilitri di PBS. Per iniziare, assemblare il circuito di flusso del bioreattore come descritto nel protocollo di testo.

Successivamente, ricondizionare il vaso decellularizzato con terreno di coltura immergendo l'aorta in terreno di differenziazione in una capsula di Petri di 10 centimetri sull'agitatore orbitale per un'ora a 50 giri/min a temperatura ambiente. Inserire al microscopio tubi di nylon lunghi un centimetro in entrambe le estremità del recipiente decellularizzato. Quindi legare il vaso e i tubi con otto punti di sutura di seta zero.

Assemblare l'innesto di aorta decellularizzata nella camera di incubazione collegando i tubi di nylon con le porte di ingresso e di uscita dalla parete della camera. Mantenere la camera di incubazione con cinque millilitri di terreno ogni volta. Successivamente, la tripsina osserva le cellule PIPS aggiungendo viaggi di preriscaldamento.

Copri il piatto di coltura e fai oscillare delicatamente il piatto 10 volte. Scartare i viaggi e lasciare il piatto nell'incubatrice per due o tre minuti. Quindi aggiungere il terreno di coltura preriscaldato nel piatto e mescolare il terreno con le cellule.

Quindi, contare il numero di cellule utilizzando una centrifuga emocitometrica. Due aliquote di sospensioni cellulari contenenti mezzo milione di cellule ciascuna per cinque minuti a 300 volte G. Dopo il supinato risospendere completamente un pellet dei pellet di cellule PIPS. In 50 microlitri di dm, iniettare la sospensione cellulare nel lume del vaso decellularizzato.

Quindi sospendere nuovamente l'altro pellet di cella PIPS in 100 microlitri di matrigel. Pipettare con cura la miscela sull'innesto di aorta decellularizzata. Attendere da 10 a 15 minuti fino a quando la miscela si trasforma in uno stato gelatinoso e si avvolge uniformemente attorno alla superficie esterna del recipiente.

A quel punto, costruire la camera di incubazione con dm. Posizionare l'intero ambiente del bioreattore in un incubatore ad anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Quindi posizionare il tubo collegato tra il serbatoio del fluido e la camera di conformità sulla pompa peristaltica.

Nell'incubatrice. Ruotare manualmente l'innesto decellularizzato di 90 gradi attorno all'asse longitudinale ogni mezz'ora nelle prime due ore dopo aver mantenuto la coltura statica per 12 ore per consentire alle cellule di erogare DM attraverso il lume dalla pompa peristaltica per indurre la differenziazione delle cellule muscolari lisce. Avviare la portata iniziale a cinque millilitri al minuto.

Quindi applicare un aumento graduale di 20 millilitri al minuto nell'arco di 24 ore dopo aver mantenuto la portata del mezzo circolante a 20 millilitri al minuto per 24 ore, arrestare il flusso del fluido e spostare l'impostazione del bioreattore fuori dall'incubatore. Successivamente, rifilare il lume dell'innesto con le cellule PIPS contando la tripsina e centrif utilizzando 1 milione di cellule PIPS. Come prima, risospendere le cellule in 50 microlitri di terreno di crescita endoteliale.

Due contenenti 50 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dell'endotelio vascolare. Quindi iniettare la miscela cellulare nel lume dell'innesto. Cambiare il terreno nella camera di incubazione e l'intera circolazione in VEGF contenente VEGF per indurre la differenziazione endoteliale.

Dopo aver spostato l'impostazione del bioreattore nell'incubatrice, ruotare manualmente l'innesto di 90 gradi ogni mezz'ora nelle prime due ore, quindi mantenere una coltura statica per 12 ore. Dopo 12 ore, iniziare a far circolare il flusso da cinque millilitri al minuto con un aumento graduale a 35 millilitri al minuto, quindi mantenere la portata a 35 millilitri al minuto per cinque giorni. Poi ovviamente ingegnerizzato innesto tagliando le estremità dei tubi di nylon.

Basare l'innesto su una piastra di Petri contenente due terreni freschi e GM in preparazione per l'innesto sul topo dopo l'anestesia del topo ricevente. Fissa il mouse in posizione supina con il collo rasato ed esteso. Preparare un'incisione sulla linea mediana dalla mandibola allo sterno del topo sotto un microscopio da dissezione con amplificazione da cinque a 10 volte.

Sollevare lateralmente le ghiandole saliche destre e rimuovere il muscolo mastoideo dell'aliante destro Per esporre l'arteria carotide comune destra, rimuovere delicatamente i tessuti attaccati per mobilizzare l'arteria carotide comune destra dall'estremità distale verso l'estremità prossimale. Legare due volte la porzione centrale dell'arteria carotide comune con una sutura di seta a otto zero e sezionare tra i due pneumatici. Passare attraverso un bracciale in tubo di nylon autoclavabile in ogni vaso.

Terminare e fissare ciascuna estremità con micro morsetti emostatici. Quindi rimuovere i lacci di sutura su un'estremità e applicare una goccia di eparina subito dopo. Capovolgere l'estremità distale dell'arteria per coprire l'intero corpo della cuffia e fissare il vaso invertito con una sutura di seta a otto zero alla cuffia.

Dopo aver ripetuto la stessa procedura sull'altra parte dell'arteria, lucidare l'arteria con una soluzione salina per rimuovere i coaguli di sangue. Successivamente, impiantare un innesto di vaso decellularizzato tra due estremità dell'arteria carotide facendo scorrere le estremità del vaso decellularizzato sulla cuffia dell'arteria e fissandolo con otto punti di sutura di seta zero. Rimuovere i morsetti vascolari da entrambe le estremità prima di valutare la pulsazione dell'innesto, quindi allacciare la ghiandola siv destra nella sua posizione originale.

Chiudere la pelle sulla posizione chirurgica con una sutura interrotta utilizzando una sutura a sei zero prolattina. Continuare con le cure post-chirurgiche come descritto nel testo del protocollo rappresentativo. Qui viene mostrata la morfologia dei fibroblasti umani dopo quattro giorni di riprogrammazione in cellule PIPS.

Le cellule PIPS hanno mostrato un fenotipo marcatamente distinto rispetto ai fibroblasti. Come previsto, tutta la decellularizzazione dell'aorta è stata ottenuta mediante trattamento con SDS per due ore. Di conseguenza, l'aorta decellularizzata appariva come un'impalcatura acellulare traslucida rispetto a un'aorta appena raccolta.

Dopo la doppia semina di cellule PIPS all'interno dell'aorta decellularizzata, gli innesti vascolari ingegnerizzati mostrano proprietà endoteliali e di cellule muscolari lisce a differenza degli innesti di vasi decellularizzati. Questo è visualizzato qui attraverso la colorazione verde per le cellule endoteliali e la colorazione rossa per le cellule muscolari lisce. I topi innestati con innesti di vasi cellulari PIPS hanno mostrato un tasso di sopravvivenza del 60% tre settimane dopo il trapianto, come previsto.

I topi innestati con vasi decellularizzati presentavano tassi di mortalità marcatamente più elevati già dal primo giorno dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della cardiologia per esplorare l'uso di cellule PIPS e innesti di vasi decellularizzati nella generazione di condotti vascolari funzionali ingegnerizzati per i tessuti. Dopo aver visto questo video, spero che tu possa avere una buona comprensione su come preparare l'innesto di vasi decellularizzati, come assemblare il bioreattore e come impiantare nuovamente l'innesto ritirato nei topi.