Name: Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Impara a generare innesti vascolari ingegnerizzati con cellule staminali PiPSC in un modello murino. Questo metodo utilizza bioreattori per la doppia semina su scaffold decellularizzati, dimostrando la fattibilità per applicazioni in medicina rigenerativa.

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Questo lavoro è stato supportato da The British Heart Foundation e The Oak Foundation.

Eseguire tutti gli esperimenti su animali secondo protocolli approvati dal Comitato istituzionale per l&#39;uso e la cura di animali da laboratorio. 1. Preparazione della cultura media <ol><li> Fai terreni di coltura per la linea cellulare di fibroblasti umani CCL-153: F-12K Medium, siero fetale bovino 10% (FBS) e 100 U / ml di penicillina e la streptomicina. </li><li> Fai riprogrammazione supporti per la generazione PiPSC: mezzo di Eagle modificato di Knockout Dulbecco (DMEM) contenente il 20% Knockout siero sostituzione, 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 0.1 Minimum mM Essential Medium (MEM) non-aminoacidi essenziali, 10 ng / ml di base del fattore di crescita dei fibroblasti 2 (bFGF-2) e 100 U / ml di penicillina e streptomicina. Aggiungi bFGF-2 al momento ogni volta prima di usare i media. </li><li> Rendere Differenziazione media (DM) per indurre cellule muscolari lisce (SMC) differenziazione: α-MEM supporti contenente 10% FBS, 0,1 mM β-mercaptoetanolo, 100 U / ml penicillina e streptomicina e 25 ng / ml Platelet Derived Growth Factor(PDGF-ββ). </li><li> Fai endoteliale Differenziazione media (CE-DM) per indurre cellule endoteliali (EC) differenziazione: crescita endoteliale media-2 (EGM-2) supporto contenente 50 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) e 100 U / ml di penicillina e la streptomicina. </li></ol> 2. fibroblasti umani Riprogrammare in Parzialmente-cellule staminali pluripotenti indotte (PiPSC) <ol><li> Culture linea cellulare di fibroblasti umani CCL-153 0,04% su fiasche rivestite soluzione di gelatina in mezzo di coltura. </li><li> Cellule Passage ogni 3 giorni con un rapporto di 1: 6. Utilizzare le cellule prima del passaggio 9 per l&#39;efficienza ottimale di generazione PiPSC. Le cellule sono pronte per la trasfezione upon raggiunge l&#39;80 - 90% di confluenza. </li><li> Linearizza pCAG2LMKOSimO plasmide policistronica contenente 4 fattori di riprogrammazione ottamero vincolante fattore di trascrizione 4 (OCT4), SOX2, fattore Kruppel-like 4 (Klf4) e C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 mg di plasmide con 5 unità di enzima di restrizione Pvul per 3 ore a 37 ° C. Purificareil plasmide con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. </li><li> Trasfettare 2 x 10 6 fibroblasti umani con 4 mg di linearizzato pCAG-OSKM plasmide di elettroporazione con kit di fibroblasti del derma umano (NHDF) nucleofection secondo il protocollo del produttore. Sementi delicatamente cellule trasfettate sul pre 0,04% di gelatina rivestito pallone T25 contenente 5 ml di pre-riscaldato Riprogrammazione media. </li><li> Dopo 24 ore, cambiare mezzo con supplementi di 25 mg / ml neomicina per selezionare una popolazione pura di cellule trasfettate. </li><li> Cambiare medio a giorni fino al giorno 4. Nota: fibroblasti umani diventano PiPSC dopo 4 giorni di riprogrammazione. </li></ol> 3. Differenziazione dei PiPSC in endoteliali e cellule muscolari lisce <ol><li> PiPSC Seed su piatti collagene IV pre-rivestite contenenti DM per 4 giorni di indurre la differenziazione in SMC. Cambiare medio a giorni fino al giorno 4. </li><li> PiPSC Seed sul collagene IV pre-rivestite piatti containing endoteliale-DM per 6 giorni per indurre il differenziamento in cellule endoteliali. Cambiare medio a giorni fino al giorno 6. </li></ol> 4. decellularized Aorta Graft Preparazione Nota: Tutte le soluzioni e le attrezzature devono essere sterili. <ol><li> Sacrifica il mouse per dislocazione cervicale e fissare il mouse in posizione supina al microscopio di dissezione. </li><li> Tagliare lo sterno e intorno alla gabbia toracica per aprire la cavità toracica. Rimuovere il cuore, i polmoni e dell&#39;esofago per esporre l&#39;aorta. Rimuovere delicatamente il grasso peri-aorta con una pinza. </li><li> Tagliare l&#39;aorta dalla estremità anteriore con le forbici e tenere delicatamente l&#39;estremità con una pinza smussato. Staccare l&#39;aorta dalla colonna spina dorsale dietro per via smussa. Chiudere accuratamente tutte le arterie si diramano dall&#39;aorta da legatura con elettrocoagulatore bipolare e il taglio dal fondo della legatura con le forbici. </li><li> Utilizzare una siringa da 5 ml per irrigare il lume aorta con 3 ml di soluzione salina contenente 100 U di eparina per prevenire la formazione di coaguli di sangue. </li><li> Tagliare l&#39;estremità posteriore della aorta prima si dirama nel renale. Mantenendo l&#39;integrità della aorta è molto importante durante l&#39;intera procedura. </li><li> Lavare lume aorta con 5 ml di soluzione 0,075% sodio dodecil solfato (SDS) diluita in tampone fosfato (PBS). </li><li> Mettere a bagno l&#39;aorta toracica in 0,075% soluzione SDS in una capsula di Petri 10 cm. Porre la capsula Petri in un agitatore orbitale per 2 ore a 150 rpm a RT. </li><li> Lavare lume aorta con 5 ml di PBS. </li><li> Immergere l&#39;aorta in PBS in una capsula di Petri 10 cm. Porre la capsula Petri sul agitatore orbitale per 2 ore a 150 giri al minuto a temperatura ambiente. Aggiorna PBS ogni 20 min. </li><li> Lavare lume aorta con 5 ml di PBS. </li><li> Tenere decellularized trapianto dell&#39;aorta in PBS a 4 ° C per un massimo di una settimana. </li></ol> 5. Doppio Semina di PiPSC e bioreattore condizionata Nota: Tutti soluziones ed apparecchiature devono essere sterili. Eseguire tutte le operazioni in una cappa di coltura di tessuti. <ol><li> Assemblare il circuito di flusso bioreattore come illustrato in figura 1. Collegare camera di incubazione, serbatoio media, pompa peristaltica e la camera rispetto tubazione. Il volume minimo di supporto necessari per la circolazione è di 40 ml. </li><li> Pre-condizione di nave decellularized con terreno di coltura immergendo l&#39;aorta in mezzo DM in una capsula di Petri 10 cm. Porre la capsula Petri l&#39;agitatore orbitale per 1 ora a 50 rpm a RT. </li><li> Inserire uno centimetri tubi lunghezza Nylon (OD 0,9 millimetri, ID 0,75 millimetri) in entrambe le estremità della nave decellularized al microscopio. Legare la nave e le provette con 8-0 punti di sutura in seta. </li><li> Montare l&#39;innesto aorta decellularized nella camera di incubazione collegando i tubi di nylon con le porte di ingresso e di uscita (1/32 &quot;tubi) dalla parete della camera. Mantenere camera di incubazione con 5mls di media ogni volta. </li><li> Trypsinize PiPSC aggiungendo pre-riscaldatotripsina per coprire il piatto cultura e oscillare delicatamente il piatto 10 volte. Eliminare la tripsina e lasciare il piatto in incubatrice per 2 - 3 min. Aggiungere mezzo di coltura pre-riscaldato nel piatto e miscelare il mezzo con le cellule. </li><li> Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare due aliquote di sospensioni cellulari contenenti 5 x 10 5 cellule ciascuno per 5 min a 300 x g. Aspirare completamente il surnatante. </li><li> Dopo aspirando completamente il surnatante, risospendere 1 pellet delle PIP pellet cellulari in 50 ml di DM. Iniettare la sospensione cellulare nel lume del vaso decellularized. </li><li> Poi, risospendere il pellet altro Pips cellulare in 100 ml di Matrigel. Pipetta con cura il composto sulla aorta trapianto decellularized. </li><li> Attendere 10 - 15 minuti fino a quando la miscela si trasforma in uno stato simile a gel e uniformemente avvolge intorno alla superficie esterna del serbatoio. Riempire la camera di incubazione con DM. </li><li> Mettere il tutto in una impostazione di CO 2 incubatore 5% bioreattore a 37 ° C. Ruotare manualmente l&#39;innesto decellularized 90 ° intorno all&#39;asse longitudinale ogni mezz&#39;ora nel primo 2 hr. </li><li> Tenere cultura statica per 12 ore per permettere l&#39;adesione cellulare. </li><li> Invia DM attraverso il lume dalla pompa peristaltica di indurre il differenziamento delle cellule muscolari lisce. Inizia portata iniziale a 5 ml / min e aumento graduale a 20 ml / min oltre 24 ore. </li><li> Mantenere il flusso medio circolante a 20 ml / min per 24 ore. </li><li> Arrestare il flusso medio e spostare la definisce dell&#39;incubatore bioreattore. </li><li> Re-seme lume dell&#39;innesto con PiPSC. Trypsinize, contare e centrifugare 1 x 10 6 PiPSC come in passaggi 5,5-5,6. Risospendere le cellule in 50 ml di EGM-2 di media contenenti 50 ng / ml VEGF. Iniettare la miscela di cellule nel lume del trapianto. </li><li> Cambiare la media nella camera di incubazione e tutta la circolazione a EGM-2 terreno contenente 50 ng VEGF / ml di indurre il differenziamento endoteliale. </li><li> Spostare l&#39;impostazione torna th bioreattoree incubatore. Ruotare manualmente l&#39;innesto di 90 ° ogni 30 min nelle prime 2 ore e poi mantenere una cultura statica per 12 ore. </li><li> Inizia circolante flusso da 5 ml / min e aumento graduale a 35 ml / min. Mantenere la portata a 35 ml / min per 5 giorni. Cambia circolante e media camera ogni altro giorno. </li><li> Raccolto l&#39;innesto progettato per un&#39;ulteriore innesto di mouse. </li></ol> 6. Accrescimento di doppia testa di serie PiPSC Graft in Mice <ol><li> Utilizzare NOD.CB17-Prkdc SCID / NcrCrl topi maschi come destinatari nave innesto. Assicurarsi sempre che i topi sono circa 10 settimane di vita, pesano circa 25 - 35 g, e sono in buone condizioni di salute. </li><li> Anestetizzare topo ricevente somministrando una combinazione di Hypnorm (25 mg / kg) e Hypnovel (25 mg / kg) per via intraperitoneale. Applicare vaselina pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Confermare anestesia efficiente assicurando che i topi hanno muscoli rilassati e respirano costantemente. <ol><li> Fissare il mouse in posizione supina con il collo rasato ed esteso. Somministrare atropina solfato (1,7 mg / kg) in combinazione con gli anestetici per assicurare che il tratto respiratorio mouse rimane chiaro. </li></ol></li><li> Preparare una incisione mediana della mandibola sterno del mouse. Sotto un microscopio da dissezione con 5- a 10 volte di amplificazione, sollevare le ghiandole salivari giuste lateralmente e rimuovere il muscolo cleidomastoid diritto di esporre la carotide comune destra. </li><li> Rimuovere delicatamente tessuti allegate mobilitare destra carotide comune dall&#39;estremità distale verso l&#39;estremità prossimale. Legare la porzione centrale della carotide comune due volte con una sutura di seta 8-0 e sezionare tra i due legami. </li><li> Passare attraverso un bracciale in tubo di nylon autoclavabile in ogni estremità nave e fissare ogni estremità con fascette microhemostat. </li><li> Rimuovere sutura cravatta su un&#39;estremità e applicare una goccia di eparina (100 U / ml). Subito dopo, invertire l&#39;estremità distale della the dell&#39;arteria per coprire l&#39;intero corpo bracciale e fissare il vaso invertita con una sutura di seta 8-0 al bracciale. <ol><li> Ripetere la stessa procedura per l&#39;altra porzione dell&#39;arteria. Arteria Lavare con soluzione fisiologica per rimuovere coaguli di sangue. </li></ol></li><li> Impiantare un innesto nave decellularized tra due estremità della carotide facendo scorrere le estremità dei vasi decellularized degli oltre polsini arteria e fissandolo con suture di seta 8-0. Rimuovere pinze vascolari da entrambi termina prima di valutare la pulsazione dell&#39;innesto. </li><li> Posizionare la ghiandola salivare destra nella sua posizione originaria. Chiudere la pelle sul luogo chirurgica con sutura interrotta con una sutura 6-0 polyglactin. </li><li> Coerentemente osservare i segni vitali del mouse dopo la procedura è completata, fino a quando non riprende coscienza. Sacrificio topi riceventi da cervicali dislocazione e dei vasi di raccolta innesti o 24 ore o 3 settimane più tardi per ulteriori analisi. </li></ol>

<ol><li>Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+for+Cardiac+Surgery%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).</li>
<li>Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+of+patients+with+synthetic+right+heart+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits.</a> Circulation. 72, II77-II83 (1985).</li>
<li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+insight%3A+the+evolution+of+tissue-engineered+vascular+grafts-from+research+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).</li>
<li>Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of blood vessel.</a> J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+biomechanical+environment+of+the+endothelium+on+a+flexible+tubular+silicone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate.</a> Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).</li>
<li>Gong, Z., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28hMSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs).</a> FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+HSP47+augments+mouse+embryonic+stem+cell+smooth+muscle+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis.</a> PLoS One. 9 (1), e86118(2014).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+CD34%2B+progenitor+cells+by+combined+modulation+of+the+MEK%2FERK+and+BMP4+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways.</a> Blood. 116, 5762-5772 (2010).</li>
<li>Samuel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functionally+competent+and+durable+engineered+blood+vessels+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).</li>
<li>Margariti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+fibroblasts+into+endothelial+cells+capacble+of+angiogenesis+and+reendothelialization+in+tissue-engineered+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).</li>
<li>Karamariti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cells+differentiated+from+reprogrammed+embryonic+lung+fibroblasts+through+DKK3+signaling+are+potent+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts.</a> Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).</li>
<li>Udelsman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+operator-independent+method+for+seeding+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-based+vascular+tissue+engineering+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs.</a> Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+control+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+plasticity+through+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+nuclear+factor-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirolimus+stimulates+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+migration+and+differentiation+into+smooth+muscle+cells+via+epidermal+growth+factor+receptor%2Fextracellular+signal-regulated+kinase%2F%CE%B2-catenin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Hung, H. S., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Advances+of+stem+cell-based+approaches+to+tissue-engineering+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22OA+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts.</a> OA Tissue Engineering. 1 (1), 2(2013).</li>
<li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+antiplatelet+adhesion+layer+on+an+electrospun+scaffold+using+porcine+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells.</a> J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+use+of+an+induced+puripotent+stem+cell+sheet+for+the+construction+of+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+engineer+small-diameter+vascular+grafts+from+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).</li>
<li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+stem+cells+to+neointimal+formation+of+decellularized+vessel+grafts+in+a+novel+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model.</a> Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).</li>
<li>Kasimir, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+decellularization+procedures+of+porcine+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves.</a> Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).</li>
<li>Stephenson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+from+frozen+embryos+in+an+animal+product-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment.</a> Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li>
<li>McCall, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+and+intramyocardial+injection+models+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine.</a> Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).</li>
<li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells%3A+a+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari in conflitto.

Il protocollo attuale indica un suono, veloce strategia, semplice, efficiente e riproducibile in cui i vasi ingegneria tessutale funzionali possono essere generati utilizzando PiPSC da fibroblasti umani. Questa tecnica rappresenta uno strumento prezioso per la medicina rigenerativa, l&#39;ingegneria dei tessuti e terapia cellulare potenzialmente paziente-specifica in un prossimo futuro. Passaggi critici per assicurare l&#39;efficacia del protocollo comprendono la preparazione di PiPSC, preparazione di innesti aortica st...

La costruzione di condotti vascolari è una strategia fondamentale per la riparazione chirurgica di vasi danneggiati e feriti derivanti da malattie cardiovascolari. Ad oggi, materiali protesici utilizzati in chirurgia includono polimeri sintetici biocompatibili (politetrafluoroetilene [Teflon], politetrafluoroetilene espanso [ePTFE, Gore-Tex] o polietilene tereftalato [Dacron]), trapianti, tessuto autologo (pericardio o vena safena) e xenotrapianti 1. Mentre innesti artificiali (ad esempio, Gore-Tex e Dacron) sono più comunemente utilizzati, questi materiali possono causare numerose complicazioni a breve e lungo termine, che includono la stenosi, deposizione di calcio, trombo-embolizzazione e infezioni. Anche se i pazienti con innesti biologici presentano diminuite eventi tromboembolici, che ancora incontrano limitazioni come ad esempio il fallimento del trapianto secondario e durata accorciata a causa di calcificazione degrado 2. Pertanto, nonostante i significativi miglioramenti in t chirurgicaechniques corso degli anni, ricercatori e clinici sono ancora gravati con la necessità di individuare il condotto ideale per le malattie vascolari. Più recentemente, il campo di ricerca di ingegneria del tessuto vascolare ha generato un concetto in cui le cellule sono incorporati in scaffold biodegradabili, con lo scopo di creare un ambiente biomimetico che esemplifica una nave funzionale per successo innesto 1. Fondamentalmente, il successo dei costrutti vascolari dipendono tre componenti essenziali; cellule che compongono il ponteggio, cioè, uno strato interno di cellule endoteliali e di uno strato di cellule muscolari lisce, un&#39;impalcatura contenente la matrice extracellulare appropriata per fornire proprietà meccaniche paragonabili alla vascolarizzazione nativa, e la segnalazione molecolare / cellulare che è richiesto per avviare / regolazione riparazione. Lungo pervietà dell&#39;innesto termine e lo sviluppo sostenibile dei neo-tessuti sono altamente dipendenti semina cellulare efficace di ponteggi, thereby rendendo la decisione di tipo di cellula di importanza critica. Diverse relazioni dimostrano l&#39;uso di cellule endoteliali mature e cellule muscolari lisce da varie fonti di sviluppare condotte di piccolo diametro 3-6. Sebbene promettenti, la mancanza di vasi autologhi sufficienti per ottenere endoteliali mature e cellule muscolari lisce rimangono un onere considerevole. Più di recente, le cellule staminali provenienti da diverse fonti sono state sfruttate per applicazioni di ingegneria dei tessuti vascolari. Cellule mononucleate Infatti, una varietà di tipi di cellule staminali comprese le cellule staminali embrionali 7, indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, derivate dal midollo osseo 12, cellule staminali mesenchimali 13, cellule progenitrici endoteliali della parete vasale e adulti -derived cellule staminali antigene-1 (Sca-1) + cellule staminali / progenitrici 14,15 sono stati tutti dimostrato di essere in grado di differenziarsi in cellule endoteliali sia funzionale o muscolari lisce in risposta ai media definiti econdizioni di coltura. Inoltre, la capacità di auto rinnovamento illimitata delle cellule staminali le rendono migliori candidati a differenza endoteliali mature e cellule della muscolatura liscia che può dividere solo per un numero finito di volte prima di subire l&#39;arresto della crescita e senescenza. La selezione del materiale per generare scaffold tessuto successo nave progettata per l&#39;innesto dipende da diversi fattori quali la biocompatibilità, le proprietà biomeccaniche, e il tasso di biodegradazione. Fondamentalmente, i materiali usati per creare scaffold per gli innesti devono essere biodegradabili e non verranno montati destinatario inutili risposte immunitarie. Inoltre, esso deve comprendere una porosità e microstruttura adatto per il fissaggio e la sopravvivenza cellulare successiva. Ad oggi, i materiali più comuni utilizzati per ponteggi in ingegneria dei tessuti vascolari comprendono polimeri dell&#39;acido poliglicolico, acido polilattico, e poli ε-caprolattone 16. Più recentemente, materiali biologici decellularized hannoanche state applicate con successo. Diversi laboratori hanno dimostrato che la semina umana decellularized, cane o vasi suina con cellule autologhe fornito un innesto biologico che ha resistito coagulazione e iperplasia intimale 17-19. Altre strategie di ingegneria del tessuto vascolare includono innesti vascolari extracellulari a base di proteine ​​della matrice ad esempio, cellule semina in fibrina gel 13 e generando fogli cellulari senza supporto impalcatura 20, 21. L&#39;attuale protocollo dimostra la differenziazione di PiPSC umana in endoteliale funzionale e cellule muscolari lisce, la generazione di un bioreattore costituito da un ponteggio nave decellularized per porto cellule vascolari PiPSC-derivati ​​funzionali, e l&#39;innesto dei vasi ingegneria tessutale in grave immunodeficienza combinata (SCID ) topi. PiPSC sono un tipo di cellule ottimale da utilizzare per l&#39;ingegneria dei tessuti di innesti per vasi, perché queste cellule non formano tumori in topi o sollevano eticorisposte allo-immunitarie. Inoltre, abbiamo dimostrato che la strategia per la generazione di cellule muscolari Pip-cellule endoteliali e semi-liscio è efficiente e riproducibile 10,11. Successivamente, abbiamo progettato una nave decellularized per la semina delle cellule vascolari PiPSC derivate per imitare da vicino le proteine ​​della matrice che esiste all&#39;interno di un vaso nativo, aumentando così l&#39;innesto e la sopravvivenza di efficacia. Inoltre, la decellularization dei vasi prima PiPSC semina impedisce il verificarsi di risposte infiammatorie montati da tipi di cellule immunitarie quali macrofagi. Ancora più importante, questo protocollo non rappresenta solo un metodo per generare promettenti condotti vascolari per la traduzione in esseri umani, ma fornisce anche strumenti preziosi di studio e la comprensione dei meccanismi molecolari che regolano la rigenerazione del tessuto vascolare attraverso modelli di mouse.

<table><tbody><tr><td>Fibroblasti umani CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Fibroblasti embrionali umani prenatali</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Medium (modifica di Kaighn del terreno F-12 di Ham)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino ATCC</td><td></td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM medium ottimizzato per cellule staminali embrionali</td><td>Tecnologie per la vita (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologie per la vita sostitutiva del siero knockout</td><td>(Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2&nbsp di base umano&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alfa-MEM medium</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF</td><td>R& D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di gelatina 2%</td> <td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Enzima di restrizione PvuI</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sterilizzazione (kit NHDF)</td> <td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, illuminazione per stereomicroscopia</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Illuminazione a luce fredda per stereomicroscopia</td></tr><tr><td>Nikon Zoom Steromicroscopio SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sale sodico</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS Soluzione madre Reagente di biologia molecolare</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di Dulbecco Soluzione salina tamponata</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10mg/ml)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore IKA Vibrax con piattaforma di agitazione VX 7&nbsp;</td><td>Jepson Bolton's, Janke & Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Azionamento digitale</td><td>della pompa Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6 canali, testa della pompa a cartuccia a 6 rulli</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S cartucce grandi per testa della pompa</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Tubo della pompa in silicone polimerizzato al platino Masterflex, L/S 14, 25 piedi</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>Il tubo passa attraverso la pompa peristaltica</td></tr><tr><td>0,5 mm di diametro interno, 0,8 mm di diametro esterno Tubo in silicone</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>I tubi collegano la camera di incubazione, il serbatoio del terreno e la camera di conformità&nbsp;</td></tr><tr><td>Raccordo Riduttore da 0,5 a 1,6, naturale Polipropilene</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adattatore collegare sopra due tipi di tubi</td></tr><tr><td>Tubo da 1/32", ID 0,01" (250&micro; m) Materiale: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Tubo attraverso la parete della camera di incubazione che collega l'innesto con il tubo esterno</td></tr><tr><td>Raccordi monopezzo&nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Fissare i tubi di cui sopra attraverso la parete della camera di incubazione</td></tr><tr><td>Tubi in nylon (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm)&nbsp;</td>I tubi <td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>si inseriscono in due estremità del NOD dell'innesto dell'aorta</td></tr><tr><td>. CB17-Prkdcscid/NcrCrl topo</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture chirurgiche, seta 8-0&nbsp;</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgesico per l'uso nei topi</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Induzione di anestesia</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in nylon</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0,65 mm di diametro e 1 mm di lunghezza; per fare la cuffia delle arterie</td></tr><tr><td>Elettrocoagulatore</td><td>Martin&nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Legatura dei rami delle arterie sull'aorta</td></tr><tr><td>Micro pinza emostatica bipolare</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Fissazione delle estremità dei vasi</td></tr><tr><td>Dilatatore dei vasi</td><td>S& T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Dilatatore del vaso</td><td>S & T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>dilatatore del vaso</td><td>S & T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini applicatore&nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Clip per micro emostati</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Suture chirurgiche, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

La costruzione di condotti vascolari è una strategia fondamentale per la riparazione chirurgica di vasi danneggiati e feriti derivanti da malattie cardiovascolari. L'attuale protocollo presenta una strategia efficiente e riproducibile in cui è possibile generare innesti di vasi funzionali di ingegneria tissutale utilizzando cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte (PiPSC) da fibroblasti umani. Abbiamo progettato un bioreattore decellularizzato per scaffold navali, che imita da vicino la struttura proteica della matrice e il flusso sanguigno che esiste all'interno di un vaso nativo, per la semina di cellule endoteliali PiPSC o cellule muscolari lisce prima dell'innesto nei topi. Questo approccio si è dimostrato vantaggioso perché i topi immunodeficienti innestati con gli innesti derivati da PiPSC presentavano un tasso di sopravvivenza marcatamente aumentato 3 settimane dopo l'intervento chirurgico. Questo protocollo rappresenta uno strumento prezioso per la medicina rigenerativa, l'ingegneria tissutale e la terapia cellulare potenzialmente paziente-specifica nel prossimo futuro.

La generazione di successo di PiPSC stata confermata 4 giorni dopo nucleofecting fibroblasti umani con un plasmide pCAG2LMKOSimO linearizzato portando 4 fattori di trascrizione, Oct4, Sox2 Klf4 e c-Myc (OSKM). PiPSC visualizzato un fenotipo nettamente distinti rispetto ai fibroblasti (Figura 2A) ed espressa 4 fattori di riprogrammazione a mRNA (Figura 2B) e di proteine ​​(Figura 2C) 10 livelli. L&#39;efficacia di un innesto vascolare basato PiPSC è fortemente...

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare ingegneria dei tessuti dei vasi innesti che sono funzionali per l&#39;innesto in topi con un doppio semina cellule staminali pluripotenti indotte in parte (PiPSC) - derivato cellule muscolari lisce e PiPSC - cellule endoteliali derivate su una nave decellularized ponteggio bioreattore.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare innesti vascolari ingegnerizzati a livello tissutale che siano funzionali per il trapianto in topi. Questo viene ottenuto innanzitutto riprogrammando fibroblasti umani in cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte in vitro, le quali sono in grado di differenziarsi in cellule endoteliali e cellule muscolari lisce. Successivamente, viene rimossa un'aorta da un topo sacrificato e decellularizzata con soluzione di sodio dodecil solfato o soluzione SDS per preparare gli innesti aortici decellularizzati.Successivamente, il circuito di flusso del bioreattore viene predisposto per il seeding doppio di cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte. L'ultimo passaggio consiste nell'impianto del graft di cellule staminali pluripotenti parzialmente indotte, precedentemente sottoposte a seeding doppio, nei topi. Infine, l'analisi dei tassi di mortalità nei topi a tre settimane dall'impianto viene utilizzata per dimostrare la funzionalità dei grafts vascolari ingegnerizzati.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie cardiovascolari poiché è stato dimostrato che genera con successo vasi sanguigni funzionali utilizzando cellule PIPS in un breve lasso di tempo. In generale, è molto importante mantenere l'innesto vascolare integro e sterile durante tutta la procedura, specialmente per le persone nuove a questo metodo. Iniziare questa procedura riprogrammando i fibroblasti umani in cellule staminali parzialmente indotte o cellule PIPS, trasfettando le cellule con quattro microgrammi di plasmide OSKM linearizzato mediante un kit per l'ingegneria nucleare dei fibroblasti dermici umani.I fibroblasti umani diventano cellule PIPS dopo quattro giorni di riprogrammazione. Dopo l'eutanasia del topo mediante dislocazione cervicale, posizionare il topo in posizione supina sotto un microscopio stereoscopico.Quindi effettuare un'incisione attraverso lo sterno e attorno alla gabbia toracica per aprire la cavità toracica. Rimuovere il cuore, i polmoni e l'esofago per esporre l'aorta, quindi rimuovere delicatamente il grasso peri-aortico con pinzette. Recidere l'aorta dall'estremità anteriore con forbici e trattenere delicatamente l'estremità con pinzette smussate.Quindi staccare l'aorta dalla colonna vertebrale retrostante mediante dissezione ottusa. Chiudere con cura tutte le arterie collaterali dell'aorta mediante legatura con un coagulatore elettrochirurgico bipolare e recidere al termine della legatura con forbici. Utilizzare una siringa da cinque millilitri per lavare il lume dell'aorta con tre millilitri di soluzione salina contenente 100 unità di eparina.Per evitare la formazione di coaguli sanguigni, tagliare l'estremit&agrave; posteriore dell'aorta prima che si dirami verso i reni. Mantenere l'integrit&agrave; dell'aorta &egrave; molto importante durante tutta la procedura. Successivamente, lavare il lume dell'aorta con cinque millilitri di 0,075.Soluzione di dodecilsolfato di sodio o SDS diluita in soluzione salina tampone al fosfato o PBS per immergere l'aorta toracica in una soluzione di SDS allo 0,075% in una piastra di Petri da 10 centimetri su un agitatore orbitale per due ore a 150 giri al minuto a temperatura ambiente. Successivamente, lavare il lume dell'aorta con cinque millilitri di PBS. Quindi, immergere l'aorta in PBS in una piastra di Petri da 10 centimetri e posizionare la piastra sull'agitatore orbitale a 150 giri al minuto per due ore a temperatura ambiente.Aggiornare il PBS ogni 20 minuti dopo due ore. Lavare il lume dell'aorta con cinque millilitri di PBS. Per iniziare, assemblare il circuito di flusso del bioreattore come descritto nel protocollo testuale.Successivamente, ricondizionare il vaso decellularizzato con mezzo di coltura immergendo l'aorta in mezzo di differenziazione in una piastra di Petri da 10 centimetri su un agitatore orbitale per un'ora a 50 giri al minuto a temperatura ambiente. Inserire tubi in nylon lunghi un centimetro in entrambe le estremità del vaso decellularizzato sotto il microscopio. Quindi fissare il vaso e i tubi con suture di seta otto zero.Assemblare l'innesto di aorta descelularizzata nella camera di incubazione collegando i tubi di nylon con i porti di ingresso e di uscita presenti sulla parete della camera. Mantenere nella camera di incubazione cinque millilitri di mezzo ogni volta. Successivamente, la tripsina agisce sulle cellule PIPS aggiungendo tripsina preriscaldata.Coprire la piastra e agitare delicatamente la piastra 10 volte. Rimuovere il liquido e lasciare la piastra nell'incubatrice per due o tre minuti. Quindi aggiungere il mezzo di coltura preriscaldato nella piastra e mescolare il mezzo con le cellule.Successivamente, conta il numero di cellule utilizzando una centrifuga con emocitometro. Due aliquote di sospensione cellulare contenenti mezzo milione di cellule ciascuna per cinque minuti a 300 volte G. Dopo la centrifugazione, risospendi completamente un pellet dei pellet cellulari PIPS in 50 microlitri di dm e inietta la sospensione cellulare nella lume del vaso descelularizzato.Quindi, risospendere l'altro pellet di cellule PIPS in 100 microlitri di matrigel. Pipettare con attenzione la miscela sul graft dell'aorta descellularizzata. Attendere da 10 a 15 minuti finché la miscela non assuma uno stato simile a un gel e si distribuisca uniformemente attorno alla superficie esterna del vaso.A quel punto, assemblare la camera di incubazione con dm. Posizionare l'intero sistema del biorreattore in un incubatore con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Successivamente, posizionare il tubo collegato tra il serbatoio del mezzo e la camera di compliance sulla pompa peristaltica.Nell'incubatrice. Ruotare manualmente l'innesto decellularizzato di 90 gradi attorno all'asse longitudinale ogni mezz'ora nelle prime due ore, dopo aver mantenuto la coltura statica per 12 ore, per consentire alle cellule aian di consegnare il DM attraverso il lume mediante una pompa peristaltica per indurre la differenziazione delle cellule muscolari lisce. Avviare il flusso iniziale alla velocità di cinque millilitri al minuto.Quindi applicare un incremento graduale di 20 millilitri al minuto nell'arco di 24 ore dopo aver mantenuto la portata del mezzo circolante a 20 millilitri al minuto per 24 ore, interrompere il flusso del mezzo e rimuovere il bioreattore dall'incubatore. Successivamente, riseminare il lume del graft con cellule PIPS mediante conta con tripsina e centrifugazione, utilizzando 1 milione di cellule PIPS. Come in precedenza, risospendere le cellule in 50 microlitri di mezzo di crescita endoteliale.Due contenenti 50 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita endoteliale vascolare. Quindi iniettare la miscela cellulare nella luce dell'innesto. Cambiare il mezzo nella camera di incubazione e nell'intera circolazione con e GM due contenente VEGF per indurre la differenziazione endoteliale.Dopo aver riposizionato il bioreattore nell'incubatore, ruotare manualmente l'innesto di 90 gradi ogni mezz'ora nelle prime due ore, quindi mantenere una coltura statica per 12 ore. Dopo 12 ore, iniziare il flusso circolante partendo da cinque millilitri al minuto, aumentando gradualmente fino a 35 millilitri al minuto, quindi mantenere il flusso costante a 35 millilitri al minuto per cinque giorni. Successivamente, recuperare ovviamente l'innesto ingegnerizzato tagliando le estremità dei tubi in nylon.Posizionare l'innesto su una piastra di Petri contenente mezzo e GM fresco in previsione dell'innesto nel topo dopo aver anestetizzato il topo ricevente. Fissare il topo in posizione supina con il collo rasato ed esteso. Preparare un'incisione mediana dalla mandibola allo sterno del topo al microscopio stereoscopico con un ingrandimento da cinque a dieci volte.Sollevare lateralmente le ghiandole salivari destre ed asportare il muscolo mastoideo glenoideo destro. Per esporre l'arteria carotide comune destra, rimuovere delicatamente i tessuti adiacenti per mobilizzare l'arteria carotide comune destra dall'estremità distale verso quella prossimale. Legare due volte la porzione media dell'arteria carotide comune con un filo di seta 8-0 ed effettuare la dissezione tra i due punti di legatura. Infilare un manicotto in tubo di nylon autoclavabile in ciascun vaso.Chiudere ogni estremità e fissarla con pinze emostatiche micro. Rimuovere quindi i legacci di sutura da un'estremità e applicare immediatamente una goccia di eparina. Rivoltare l'estremità distale dell'arteria in modo da ricoprire l'intero corpo del manicotto e fissare il vaso rivoltato con una sutura di seta 8-0 al manicotto.Dopo aver ripetuto la stessa procedura sull'altra porzione dell'arteria, lavare l'arteria con soluzione salina per rimuovere i coaguli di sangue. Successivamente, impiantare una graft vascolare descellularizzata tra le due estremità dell'arteria carotidea facendo scivolare le estremità della graft descellularizzata sopra il manicotto arterioso e fissandola con otto suture di seta 0. Rimuovere le pinze vascolari da entrambe le estremità prima di valutare la pulsazione della graft, quindi riposizionare la ghiandola siv destra nella sua posizione originale.Chiudere la cute nel sito chirurgico con una sutura interrotta utilizzando un filo di prolattina sei zero. Proseguire con le cure post-chirurgiche come descritto nel protocollo testuale rappresentativo. Qui viene mostrata la morfologia dei fibroblasti umani dopo quattro giorni di riprogrammazione in cellule PIPS.Le cellule PIPS mostravano un fenotipo notevolmente diverso rispetto ai fibroblasti. Come previsto, la completa descellularizzazione dell'aorta è stata ottenuta mediante trattamento con SDS per due ore. Di conseguenza, l'aorta descellularizzata appariva come uno scaffold acellulare traslucido rispetto a un'aorta appena raccolta.Dopo il doppio innesto di cellule PIPS all'interno dell'aorta descellettularizzata, gli innesti vascolari ingegnerizzati mostrano proprietà di cellule endoteliali e muscolari lisce, a differenza degli innesti vascolari descellettularizzati. Questo viene visualizzato qui attraverso la colorazione verde per le cellule endoteliali e la colorazione rossa per le cellule muscolari lisce. I topi sottoposti a innesto vascolare con cellule PIPS hanno mostrato una sopravvivenza del 60% a tre settimane dal trapianto, come previsto.I topi trapiantati con vasi descelularizzati hanno mostrato tassi di mortalità notevolmente più elevati già dal primo giorno dopo il trapianto. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della cardiologia per esplorare l'uso delle cellule PIPS e dei trapianti vascolari descelularizzati nella generazione di condotti vascolari ingegnerizzati funzionali. Dopo aver visto questo video, spero che siate in grado di comprendere bene come preparare il trapianto vascolare descelularizzato, come assemblare il bioreattore e come reimpiantare il trapianto rigenerato nei topi.

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