Progettazione di un Hydrogel doppo strato di controllo differenziazione ASC

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare una matrice composita realizzata con biomateriali naturali che può essere utilizzata per fornire e differenziare le cellule staminali per favorire la guarigione delle ferite. Ciò si ottiene isolando prima le cellule staminali di derivazione adiposa o una SC da un animale da laboratorio. Successivamente, gli A SC vengono caricati su microsfere di chitosano prefabbricate.

Quindi viene colato il gel di collagene fibrillato e le perle A-S-C-C-S-M vengono sovrapposte al gel di collagene. Infine, il gel di fibrina PEG viene colato sopra il gel di collagene A-S-C-C-S-M e viene aggiunto il mezzo. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la migrazione simultanea bidirezionale di A SC dalla perlina CSM in entrambe le matrici di collagene e fibrina PEG.

Attraverso questa procedura, una singola fonte di cellule staminali può prendere segnali differenziali dai microambienti di collagene e fibrina PEG e essere stimolata in modo differenziale per produrre fattori pleiotropici e formare una rete di strutture prevascolari. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i compositi monomateriale o i sostituti cutanei decellularizzati, è che questi altri prodotti non affrontano attivamente la rivascolarizzazione del prodotto da parte dell'ospite. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che il RAD A SE isolato ha la propensione a differenziarsi verso un fenotipo vascolare quando viene coltivato in una matrice di fibrina di maiale.

Questa osservazione ha scatenato l'idea che una singola fonte di cellule staminali potesse essere utilizzata contemporaneamente in un sistema costituito da diversi biomateriali. Dopo aver isolato e coltivato cellule staminali derivate dal tessuto adiposo o ASC, preparato microsfere di chitosano o CSM e caricato le ASC nei CSM, preparare il polietilenglicole, l'idrogel di fibrina sciogliendo il peg modificato con derate in eccesso di succinile in quattro millilitri di soluzione salina tamponata con tris. Poco prima dell'esperimento, utilizzare un filtro da 0,22 micron per sterilizzare la soluzione.

In un pozzetto di coltura composto da una piastra a sei pozzetti, 500 microlitri di brodo di fibrinogeno e 250 microlitri di brodo PEG incubano per 20 minuti in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Successivamente, miscelare 250 microlitri di A-S-C-C-S-M precedentemente preparato con la soluzione di fibrinogeno pegilato, aggiungere immediatamente un millilitro di soluzione madre di trombina e utilizzando una pipetta rapidamente tri velocità una o due volte, posizionare immediatamente la miscela di gel cellulare in una piastra a 12 pozzetti e incubare in una camera umidificata con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, lavare due volte la fibrina peg risultante con HBSS e incubare con terreno essenziale minimo alfa integrato con il 10% di FBS in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius utilizzando tecniche standard di microscopia ottica per un periodo di 11 giorni.

Osservare la migrazione delle cellule dal CSM nella miscela di gel, A-S-C-C-S-M con collagene di tipo uno estratto dai tendini della coda di ratto utilizzando due idrossido di sodio normale. Regolare il pH a 6,8 e fibrillare. Aggiungere la miscela di collagene fibrillato, A-S-C-C-S-M a una piastra a 12 pozzetti e incubare in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo aver verificato che la fibrillazione sia completa, incubare i gel di collagene A-S-C-C-S-M per un massimo di 11 giorni in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Osservare la migrazione delle cellule dal CSM al gel per un periodo di 11 giorni utilizzando tecniche di microscopia standard per sviluppare il costrutto a doppio strato per studiare le proprietà migratorie e di coinduzione di una singola fonte di cellule staminali. Utilizzando due scaffold bio.

Preparare sia il gel di collagene che quello di fibrina PEG con le seguenti lievi modifiche, preparare un millilitro di 7,5 milligrammi per millilitro di collagene. Quindi trasferire la miscela in un inserto di coltura tissutale a sei pozzetti e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la completa fibrillazione, stendere sulla superficie del collagene, 200 microlitri da cinque milligrammi di A-S-C-C-S-M in terreno di coltura.

Dopo che le microsfere si sono depositate sul gel, preparare il gel di fibrina PEG utilizzando 250 microlitri di terreno di coltura cellulare. Quindi sovrapporre la soluzione di trombina di fibrinogeno pegilato sugli strati di collagene A-S-C-C-S-M. Una volta completato, incubare i costrutti per 30 minuti in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per ottenere il completamento dell'azione.

Infine, posizionare un millilitro di terreno nella camera superiore sopra il costrutto e tre millilitri di terreno nella camera inferiore. La caratterizzazione di un SC incorporato all'interno di questo scaffold ha rivelato che un CSM caricato con SC può essere inserito tra uno strato di collagene e fibrina peg contemporaneamente e prendere spunto in modo differenziale da entrambi gli ambienti extracellulari per prosperare nelle loro nuove condizioni. Come mostrato qui, il collagene ha supportato la capacità delle ASC di rimanere cellule staminali, come è stato dimostrato dalla loro espressione di stro one in verde, così come dalla loro morfologia simile a quella dei fibroblasti.

Al contrario, la fibrina PEG ha indotto le ASC a differenziarsi verso il fenotipo avascolare, come dimostrato dalla loro morfologia tubolare mostrata qui, completa di lume e dalla loro espressione specifica per le cellule endoteliali del marchio di von Willow e del fattore mostrato qui in rosso. Inoltre, come dimostrato qui, questi fenotipi osservati sembravano verificarsi precocemente nella coltura e sono stati mantenuti per 11 giorni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo di ratto, caricarle su chito e microsfere e incorporarle in un idrogel a doppio strato utilizzando biomateriali approvati dalla FDA.

Non dimenticare che i biomateriali e le cellule utilizzati in questo protocollo derivano da animali e dall'uomo e possono essere estremamente pericolosi se contaminati da agenti patogeni del loro ospite. E precauzioni come dispositivi di protezione individuale e tecniche di coltura cellulare asettiche dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di queste procedure.