Progettazione di un Hydrogel doppo strato di controllo differenziazione ASC

L'obiettivo generale di questa procedura è creare una matrice composita realizzata con biomateriali naturali che possa essere utilizzata per veicolare e differenziare cellule staminali al fine di favorire la guarigione delle ferite. Ciò viene ottenuto isolando innanzitutto cellule staminali derivate dal tessuto adiposo, o ASC, da un animale sottoposto a test. Successivamente, le ASC vengono caricate su microsfere di chitosano preformate.

Successivamente, viene formato un gel di collagene FIBRILLATO e le microsfere A-S-C-C-S-M vengono stratificate sopra il gel di collagene. Infine, viene formato un gel di fibrina PEG sopra il gel di collagene A-S-C-C-S-M e viene aggiunto il mezzo. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la migrazione simultanea bidirezionale degli A SC dalla microsfera CSM all'interno sia della matrice di collagene che di quella di fibrina PEG.

Attraverso questa procedura, una singola fonte di cellule staminali può ricevere segnali differenziali dagli ambienti microscopici di collagene e fibrina PEG, e può essere stimolata in modo differenziale a produrre fattori pleiotropici e formare una rete di strutture prevascolari. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i compositi a materiale singolo o i sostituti cutanei descellularizzati, è che questi altri prodotti non affrontano attivamente la rivascolarizzazione del prodotto da parte dell'ospite. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato che il RAD A SE isolato ha la tendenza a differenziarsi verso un fenotipo vascolare quando coltivato in una matrice di fibrina suina.

Questa osservazione ha suscitato l'idea che una singola fonte di cellule staminali potesse essere utilizzata contemporaneamente in un sistema costituito da diversi biomateriali. Dopo aver isolato e coltivato cellule staminali derivate dal tessuto adiposo o ASCs, preparato microsfere di chitosano o CSMs e caricato le ASCs nelle CSMs, preparare un idrogel di polietilene glicole e fibrina sciogliendo il peg modificato con succinil glutammato in quattro millilitri di soluzione salina tamponata al tris. Poco prima dell'esperimento, sterilizzare la soluzione mediante un filtro da 0,22 micron.

In un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, mescolare 500 microlitri di soluzione madre di fibrinogeno e 250 microlitri di soluzione madre di PEG e incubare per 20 minuti in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Successivamente, mescolare 250 microlitri di A-S-C-C-S-M precedentemente preparato con la soluzione di fibrinogeno pegilato, aggiungere immediatamente un millilitro di soluzione madre di trombina e, utilizzando una pipetta, agitare rapidamente una o due volte; quindi posizionare immediatamente la miscela cellulare con gel in una piastra a 12 pozzetti e incubare in una camera umidificata con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, lavare due volte il fibrinogel ottenuto con HBSS e incubare con mezzo essenziale minimo alfa integrato con FBS al 10% in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius, utilizzando tecniche standard di microscopia in luce per un periodo di 11 giorni.

Osservare la migrazione delle cellule dal CSM nella miscela di gel, A-S-C-C-S-M, con collagene di tipo uno estratto dai tendini della coda del ratto utilizzando due idrossidi di sodio normali. Regolare il pH a 6,8 e far fibrillare. Aggiungere il collagene fibrillato, miscela A-S-C-C-S-M, in una piastra a 12 pozzetti e incubare in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo aver verificato che la fibrillazione sia completa, incubare i gel di collagene A-S-C-C-S-M fino a 11 giorni in un'incubatrice umidificata con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Osservare la migrazione delle cellule dal CSM all'interno del gel per un periodo di 11 giorni mediante tecniche standard di microscopia, al fine di sviluppare la costruzione bilaminare per lo studio delle proprietà migratorie e di co-induzione di una singola fonte di cellule staminali. Utilizzando due biomatrici.

Preparare sia i gel di collagene che quelli di fibrina PEG con le seguenti lievi modifiche: preparare un millilitro di collagene alla concentrazione di 7,5 milligrammi per millilitro. Trasferire quindi la miscela in un inserto per coltura tissutale a sei pozzetti e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la completa fibrillazione, sovrapporre alla superficie del collagene 200 microlitri di cinque milligrammi di A-S-C-C-S-M nel mezzo di coltura.

Dopo che i microsfere si sono depositati sul gel, preparare il gel di fibrina PEG utilizzando 250 microlitri di mezzo di coltura cellulare. Quindi stratificare la soluzione di fibrinogeno pegilato e trombina sugli strati di collagene A-S-C-C-S-M. Al termine, incubare le costruzioni per 30 minuti in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% per ottenere una completa polimerizzazione.

Infine, aggiungere un millilitro di mezzo nella camera superiore sopra il costrutto e tre millilitri di mezzo nella camera inferiore. La caratterizzazione di una SC inglobata in questo scaffold ha rivelato che delle CSM caricate con SC possono essere inserite a sandwich tra uno strato di collagene e uno di fibrina peg, ricevendo contemporaneamente segnali differenziali da entrambi gli ambienti extracellulari e sviluppandosi favorevolmente nelle nuove condizioni. Come mostrato qui, il collagene ha sostenuto la capacità delle ASC di mantenere le caratteristiche di cellule staminali, come dimostrato dalla loro espressione di stro-1 in verde, nonché dalla loro morfologia simile a quella dei fibroblasti.

Al contrario, la fibrina PEG ha indotto le ASC a differenziarsi verso un fenotipo avascolare, come dimostrato dalla loro morfologia simile a tubuli, completa di lume, e dall'espressione specifica delle cellule endoteliali del fattore di von Willebrand, mostrato qui in rosso. Inoltre, come dimostrato qui, questi fenotipi osservati sembravano manifestarsi precocemente in coltura e venivano mantenuti per 11 giorni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare cellule staminali derivate dal tessuto adiposo di ratto, carificarle su microsfere di chitosano e incorporarle in un idrogel bilayer utilizzando biomateriali approvati dalla FDA.

Non dimenticare che i biomateriali e le cellule utilizzati in questo protocollo derivano da animali e esseri umani e possono essere estremamente pericolosi se contaminati da patogeni provenienti dall'ospite. Precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale e tecniche asettiche di coltura cellulare devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di queste procedure.