Name: Progettazione di un Hydrogel doppo strato di controllo differenziazione ASC (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Scopri come creare un idrogel bilaminato con collageno, fibrina e chitosan per indirizzare la differenziazione delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC) verso fenotipi distinti. Questo metodo supporta la rigenerazione tissutale e la rivascolarizzazione nella guarigione delle ferite cutanee.

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SN è stato sostenuto da una borsa post-dottorato dal Initiative Tissue Engineering Pittsburgh. DOZ è supportata da una sovvenzione concessa dalla Fondazione di Ginevra.

<ol><li>Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bilayer+construct+controls+adipose-derived+stem+cell+differentiation+into+endothelial+cells+and+pericytes+without+growth+factor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).</li>
<li>Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+hydrogel+niches+that+promote+hMSC+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability.</a> Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).</li>
<li>Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+production+prevents+anoikis+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).</li>
<li>Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+stem+cells+and+biomaterial+scaffolds+for+constructing+tissues+and+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery.</a> , (2008).</li>
<li>Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell+delivery+into+collagen+gels+using+chitosan+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).</li>
<li>Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+epsilon-amino+groups+in+soluble+and+poorly+soluble+proteinaceous+materials+by+a+spectrophotometric+method+using+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).</li>
<li>Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PEGylated+fibrin+patch+for+mesenchymal+stem+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery.</a> Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).</li>
<li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Lab Invest. 7, 134-137 (1958).</li>
<li>Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+differentiation+of+bone+marrow+stem+cells+is+directed+by+a+tunable+three-dimensional+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix.</a> Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).</li>
<li>Rochon, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+epithelial+cells+regulate+the+size+and+morphology+of+tissue-engineered+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).</li>
<li>Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+for+expansion+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi finanziari esistono. Disclaimers I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali degli autori e non devono essere interpretate come ufficiale o che riflette le opinioni del Dipartimento della Difesa o il Governo degli Stati Uniti. Gli autori sono dipendenti del governo degli Stati Uniti, e questo lavoro è stato preparato come parte delle loro funzioni ufficiali. Tutto il lavoro è stato sostenuto dalla US Army Medical Research e Materiel Command. Questo studio è stato condotto nell&#39;ambito di un protocollo esaminato e approvato dalla US Army Medical Research e Materiel Command Institutional Review Board e in conformità con il protocollo approvato.

ASC sono ben noti per la loro facilità di isolamento e la capacità di differenziare verso vari tipi di cellule. Con le tecniche descritte in questa manoscritto, siamo in grado di sfruttare la plasticità del ASCs esponendo le cellule a biomatrices contemporaneamente. Come le cellule migrano lontano dalla loro base CSM e inserire il proprio ambiente circostante extracellulare, le cellule prendono spunto dal patibolo e può mantenere &quot;staminalità&quot; (collagene) o essere indotte a differenziarsi verso tipi di cellule...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14175 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Collagenasi di tipo II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6685 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> 70-micron Nylon Mesh Filter </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> 100-um Nylon Mesh Filter </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> MesenPRO crescita media del sistema </td><td> Invitrogen </td><td> 12746-012 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td&gt; <td> Gibco </td><td> 25030 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C8106 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> T75 Tissue Culture Flask </td><td> BD Biosciences </td><td> 137787 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Chitosan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448869 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Acido acetico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320099 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> N-ottanolo </td><td> Acros Organics </td><td> 150630025 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Sorbitan-mono-oleato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6760 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Idrossido di potassio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1767 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Acetone </td><td> Fisher Scientific </td><td> L-4859 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270741 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Trinitro benzensolfonico Acid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2297 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Acido cloridrico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320331 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Etere etilico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 472-484 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> 8-micron di tessuto coltura in piastra Inserti </td><td> BD Biosciences </td><td> 353097 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Microcentrifuga da 1,5 ml Tubes </td><td> Pescatore </td><td> 05-408-129 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> MTT reagente </td><td> Invitrogen </td><td> M6494 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8779 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Qtracker cellulare Labeling Kit (QTracker 655) </td><td> Sonde molecolari </td><td> Q2502PMP </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Collagene di tipo 1 </td><td> Travigen </td><td> 3447-020-01 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Di sodio idrossido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8045 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> 12-Well piastre di coltura dei tessuti </td><td> BD Biosciences </td><td> 353043 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Fibrinogeno </td><td> Sigma </td><td> F3879 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Trombina </td><td> Sigma </td><td> T6884 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Derivata Benztriazole di polietilene </td><td> Sunbio </td><td> DE-034GS </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Tris Buffer Tablet (pH 7,6) </td><td> Sigma </td><td> T5030 </td><td> Consumabili </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Equipment </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> New Brunswick Scienctific </td><td> C24 </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Incubatore umidificato con Air-5% CO 2 </td><td> Thermo Scientific </td><td> Modello 370 </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Agitatore </td><td> IKA </td><td> Visc6000 </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Agitatore magnetico </td><td> Corning </td><td> PC-210 </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Vacuum Essiccatore </td><td> - </td><td> - </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Particle Size Analyzer </td><td> Malvern </td><td> STP2000 Spraytec </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Water Bath </td><td> Fisher Scientific </td><td> Isotemp210 </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Spettrofotometro </td><td> Beckman </td><td> Beckman Coulter Spettrofotometro DU 800UV/Visible </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Vortice </td><td> Diagger </td><td> 3030a </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Microplate Reader </td><td> Molecular Devices </td><td> Spectramax M2 </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Luce / microscopio a fluorescenza </td><td> Olimpo </td><td> IX71 </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Olimpo </td><td> FV-500 microscopio confocale a scansione laser </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Microscopio Elettronico a Scansione </td><td> Carl Zeiss MicroImaging </td><td> Leo 435 VP </td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Microscopio elettronico a trasmissione </td><td> JEOL </td><td> JEOL 1230 </td><td> Attrezzatura </td></tr></tbody></table>

progettazione di un hydrogel doppo strato di controllo differenziazione asc

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Polimeri naturali nel corso degli anni hanno acquisito maggiore importanza a causa della loro biocompatibilità di accoglienza e la capacità di interagire con le cellule in vitro e in vivo. Un&#39;area di ricerca che promette nel campo della medicina rigenerativa è l&#39;uso combinatorio di biomateriali innovativi e cellule staminali. Una strategia fondamentale nel campo dell&#39;ingegneria dei tessuti è l&#39;uso di tridimensionale ponteggio (ad esempio, decellularizzato matrice extracellulare, idrogel, micro / nano particelle) per dirigere la funzione delle cellule. Questa tecnologia si è evoluta dalla scoperta che le cellule hanno bisogno di un substrato su cui si può aderire, proliferare, ed esprimono il loro fenotipo differenziato cellulare e la funzione 2-3. Più recentemente, è stato anche determinato che le cellule non solo utilizzare questi substrati per adesione, ma anche interagire e prende spunto dal substrato di matrice (ad esempio, matrice extracellulare, ECM) 4. Pertanto, le cellule e ponteggi una connessione reciproca cheserve a controllare lo sviluppo dei tessuti, l&#39;organizzazione e la funzione finale. Derivate da tessuto adiposo cellule staminali (CSA) sono mesenchimale, non-ematopoietiche cellule staminali presenti nel tessuto adiposo, che può esibire multi-lineage differenziazione e servire come fonte immediatamente disponibile di cellule (cioè pre-endoteli vascolari e periciti). La nostra ipotesi è che derivate da tessuto adiposo cellule staminali possono essere dirette verso differenti fenotipi contemporaneamente semplicemente co-coltura in matrici doppo strato 1. Il nostro laboratorio è focalizzata sulla guarigione della ferita cutanea. A questo scopo, abbiamo creato un&#39;unica matrice composita dai biomateriali naturali, fibrina, collagene, e chitosano che possono mimare le caratteristiche e le funzioni di un dermo-specifico ambiente guarigione della ferita ECM.

Questo protocollo si concentra sulla utilizzando la capacità intrinseca delle cellule staminali a prendere spunto dalla loro matrice extracellulare che circonda ed essere indotte a differenziarsi in fenotipi multipli. Questo manoscritto metodi estende la nostra descrizione e caratterizzazione di un modello utilizzando un idrogel doppo strato, costituito da PEG-fibrina e collagene, contemporaneamente alla co-differenziare derivate da tessuto adiposo cellule staminali<sup&gt; 1</sup&gt;.

Progettazione di un Hydrogel doppo strato di controllo differenziazione ASC

Nel corso degli anni, i polimeri naturali hanno acquisito maggiore importanza grazie alla loro biocompatibilità con l'ospite e alla capacità di interagire con le cellule in vitro e in...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare una matrice composita realizzata con biomateriali naturali che possa essere utilizzata per veicolare e differenziare cellule staminali al fine di favorire la guarigione delle ferite. Ciò viene ottenuto isolando innanzitutto cellule staminali derivate dal tessuto adiposo, o ASC, da un animale sottoposto a test. Successivamente, le ASC vengono caricate su microsfere di chitosano preformate.Successivamente, viene formato un gel di collagene FIBRILLATO e le microsfere A-S-C-C-S-M vengono stratificate sopra il gel di collagene. Infine, viene formato un gel di fibrina PEG sopra il gel di collagene A-S-C-C-S-M e viene aggiunto il mezzo. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la migrazione simultanea bidirezionale degli A SC dalla microsfera CSM all'interno sia della matrice di collagene che di quella di fibrina PEG.Attraverso questa procedura, una singola fonte di cellule staminali può ricevere segnali differenziali dagli ambienti microscopici di collagene e fibrina PEG, e può essere stimolata in modo differenziale a produrre fattori pleiotropici e formare una rete di strutture prevascolari. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i compositi a materiale singolo o i sostituti cutanei descellularizzati, è che questi altri prodotti non affrontano attivamente la rivascolarizzazione del prodotto da parte dell'ospite. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato che il RAD A SE isolato ha la tendenza a differenziarsi verso un fenotipo vascolare quando coltivato in una matrice di fibrina suina.Questa osservazione ha suscitato l'idea che una singola fonte di cellule staminali potesse essere utilizzata contemporaneamente in un sistema costituito da diversi biomateriali. Dopo aver isolato e coltivato cellule staminali derivate dal tessuto adiposo o ASCs, preparato microsfere di chitosano o CSMs e caricato le ASCs nelle CSMs, preparare un idrogel di polietilene glicole e fibrina sciogliendo il peg modificato con succinil glutammato in quattro millilitri di soluzione salina tamponata al tris. Poco prima dell'esperimento, sterilizzare la soluzione mediante un filtro da 0,22 micron.In un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, mescolare 500 microlitri di soluzione madre di fibrinogeno e 250 microlitri di soluzione madre di PEG e incubare per 20 minuti in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Successivamente, mescolare 250 microlitri di A-S-C-C-S-M precedentemente preparato con la soluzione di fibrinogeno pegilato, aggiungere immediatamente un millilitro di soluzione madre di trombina e, utilizzando una pipetta, agitare rapidamente una o due volte; quindi posizionare immediatamente la miscela cellulare con gel in una piastra a 12 pozzetti e incubare in una camera umidificata con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, lavare due volte il fibrinogel ottenuto con HBSS e incubare con mezzo essenziale minimo alfa integrato con FBS al 10% in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius, utilizzando tecniche standard di microscopia in luce per un periodo di 11 giorni.Osservare la migrazione delle cellule dal CSM nella miscela di gel, A-S-C-C-S-M, con collagene di tipo uno estratto dai tendini della coda del ratto utilizzando due idrossidi di sodio normali. Regolare il pH a 6,8 e far fibrillare. Aggiungere il collagene fibrillato, miscela A-S-C-C-S-M, in una piastra a 12 pozzetti e incubare in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Dopo aver verificato che la fibrillazione sia completa, incubare i gel di collagene A-S-C-C-S-M fino a 11 giorni in un'incubatrice umidificata con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Osservare la migrazione delle cellule dal CSM all'interno del gel per un periodo di 11 giorni mediante tecniche standard di microscopia, al fine di sviluppare la costruzione bilaminare per lo studio delle proprietà migratorie e di co-induzione di una singola fonte di cellule staminali. Utilizzando due biomatrici.Preparare sia i gel di collagene che quelli di fibrina PEG con le seguenti lievi modifiche: preparare un millilitro di collagene alla concentrazione di 7,5 milligrammi per millilitro. Trasferire quindi la miscela in un inserto per coltura tissutale a sei pozzetti e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la completa fibrillazione, sovrapporre alla superficie del collagene 200 microlitri di cinque milligrammi di A-S-C-C-S-M nel mezzo di coltura.Dopo che i microsfere si sono depositati sul gel, preparare il gel di fibrina PEG utilizzando 250 microlitri di mezzo di coltura cellulare. Quindi stratificare la soluzione di fibrinogeno pegilato e trombina sugli strati di collagene A-S-C-C-S-M. Al termine, incubare le costruzioni per 30 minuti in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% per ottenere una completa polimerizzazione.Infine, aggiungere un millilitro di mezzo nella camera superiore sopra il costrutto e tre millilitri di mezzo nella camera inferiore. La caratterizzazione di una SC inglobata in questo scaffold ha rivelato che delle CSM caricate con SC possono essere inserite a sandwich tra uno strato di collagene e uno di fibrina peg, ricevendo contemporaneamente segnali differenziali da entrambi gli ambienti extracellulari e sviluppandosi favorevolmente nelle nuove condizioni. Come mostrato qui, il collagene ha sostenuto la capacità delle ASC di mantenere le caratteristiche di cellule staminali, come dimostrato dalla loro espressione di stro-1 in verde, nonché dalla loro morfologia simile a quella dei fibroblasti.Al contrario, la fibrina PEG ha indotto le ASC a differenziarsi verso un fenotipo avascolare, come dimostrato dalla loro morfologia simile a tubuli, completa di lume, e dall'espressione specifica delle cellule endoteliali del fattore di von Willebrand, mostrato qui in rosso. Inoltre, come dimostrato qui, questi fenotipi osservati sembravano manifestarsi precocemente in coltura e venivano mantenuti per 11 giorni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare cellule staminali derivate dal tessuto adiposo di ratto, carificarle su microsfere di chitosano e incorporarle in un idrogel bilayer utilizzando biomateriali approvati dalla FDA.Non dimenticare che i biomateriali e le cellule utilizzati in questo protocollo derivano da animali e esseri umani e possono essere estremamente pericolosi se contaminati da patogeni provenienti dall'ospite. Precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale e tecniche asettiche di coltura cellulare devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di queste procedure.

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Progettazione di un Hydrogel doppo strato di controllo differenziazione ASC

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