HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell'uomo e CTL

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare cellule presentanti l'antigene artificiale o un PC A per l'espansione ex vivo di CTL antigene specifico umano per un potenziale utilizzo nell'immunoterapia adottiva. Ciò si ottiene coniugando prima HLA A due IG e anticorpo monoclonale CD 28 anti-umano a perle di dinamo magnetica per ottenere un PC. Il secondo passo della procedura consiste nell'eseguire il controllo di qualità e il caricamento dei peptidi del PC A. Il terzo passo della procedura consiste nell'isolare otto cellule T positive CD del sangue periferico umano. La fase finale della procedura consiste nell'incubare otto cellule T positive con un PC A per una settimana.

I CTL vengono quindi raccolti e caratterizzati prima di essere utilizzati o restimolati per un'altra settimana per raggiungere il livello desiderato della loro specificità ed espansione. In definitiva, si possono ottenere risultati di teum o di colorazione che mostrano che i CTL che vengono espansi in presenza di A A PC hanno una maggiore specificità dell'antigene. Oggi vi mostrerò un sistema A A PC basato su HI IG e come utilizzare questo sistema per espandere in modo efficiente il CTL umano specifico per CMV exvivo rispetto ad altri metodi esistenti.

La nostra tecnologia A A PC offre diversi vantaggi importanti. È disponibile in pronta consegna, è in quantità illimitata e, supponiamo che un PC possa essere utilizzato per tutti i due donatori positivi HRAA. Ok, iniziamo Trasferisci un millilitro di perle epossidiche M quattro 50 da uno stock di circa 400 milioni di perline in una lima di vetro sterile a vite.

Lavare le perle una volta aggiungendo un millilitro di tampone boid e poi posizionando la fiala di vetro contro una NBC a tutti i colori mentre le perle sono aderenti al lato della fiala. Rimuovere il laccio con l'aspirazione Resus. Sospendi le perle in una miscela di tampone boideo HLA A due dimeri IG e anticorpo monoclonale anti-umano CD 28.

Quindi, per facilitare la coniugazione tra proteine e perline, ruotare la fiala di vetro su un rotatore a quattro gradi Celsius per 24 ore. Quindi, posizionare il tubo in un magnete MPC one e rimuovere tutto il tampone borato. Dopo che il tampone è stato rimosso, lavare le perle due volte con un millilitro di tampone per il lavaggio delle perline.

Ora incubare le perle in un millilitro di tampone per il lavaggio delle perle e ruotare la fiala a quattro gradi Celsius per altre 24 ore per bloccare i siti di legame delle proteine residue sulle perline. Quindi rimuovere il tampone dalla fiala di vetro e sostituirlo con un millilitro di tampone fresco per il lavaggio delle perle. Trasferire 100 microlitri di tampone per il lavaggio del fax nei tubi del fax, quindi aggiungere cinque volte 10 alla quinta perlina.

Colorare le perle con un microlitro di IgG anti musa, un PE e un microlitro di IgG anti musa due volte dopo aver colorato per 20 minuti a quattro gradi Celsius. A tre millilitri di tampone di lavaggio fax per ciascuno dei campioni di colorazione. Quindi pellettare l'A A PC spendendo a 300 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Reus sospende l'A PC in un tampone fax fresco e legge immediatamente il risultato della colorazione con il citometro a flusso. Lavare le perline due volte con PBS sterile come prima. Quindi, caricare le perle con 10 microlitri di peptide CMV.

Contare le perle con l'emocitometro e poi etichettarle con la data e la concentrazione delle perline. Come perline per millilitro. Incubare l'A PC A con il peptide per almeno tre giorni a quattro gradi Celsius, centrifugare circa 100 millilitri di sangue periferico fresco da un donatore HLA A due positivo in 10 provette vacutainer con eparina sodica a 300 Gs per 10 minuti.

A temperatura ambiente, rimuovere con cura lo strato superiore di plasma mediante aspirazione. Sostituire il plasma raccolto con PBS sterile e trasferire il sangue in un pallone di coltura sterile T 75. Mescolare bene il sangue e il PBS pipettando una volta raccolto tutto il sangue a 15 millilitri di confezione fial più quattro provette coniche da 50 millilitri.

Sovrapporre lentamente da 30 a 35 millilitri di cellule del sangue sopra il fial in ogni tubo. Mantenendo l'interfaccia distinta tra le cellule fiali e quelle del sangue, centrifugare il gradiente sanguigno e fiale a 500 GS per 20 minuti a temperatura ambiente con la rottura e l'accelerazione il più bassa possibile per mantenere un'interfaccia chiara tra gli strati dopo la centrifuga, aspirare lo strato superiore di plasma e quindi utilizzare una pipetta sierologica per aspirare con cura lo strato di PBMC. Trasferire la PBMC in una provetta conica fresca da 50 millilitri quando tutte le PBMC sono state raccolte a 30 millilitri di PBS nelle cellule e centrifugarle.

Quindi, scartare il supernat e lavare il pellet. Ancora una volta con 30 millilitri di PBS per rimuovere il richiamo di fi residuo e quindi arricchire per la popolazione di otto cellule T positive per CD utilizzando un kit di isolamento di otto cellule T positive per CD Milton Human. Secondo il protocollo del produttore, contare le otto cellule T positive del CD e confermare la purezza tramite analisi via fax.

Sospendere 1 milione di CTL in otto millilitri di fattore di crescita delle cellule T, due x terreno di coltura più otto millilitri di terreno RPMI completo e aggiungere una volta per 10 delle sei miscele di A A PC. Utilizzare quindi una pipetta multicanale per piastrare 160 microlitri di cellule per pozzetto su una piastra di coltura tissutale con fondo a 96 pozzetti U. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per sette giorni.

Nutrire le cellule il quarto giorno con 80 microlitri per pozzetto di crescita delle cellule T. Fattore due x terreno di coltura. Raccogli le cellule il settimo giorno e poi posiziona le cellule contro il magnete per rimuovere il vecchio A A PC quando tutte le perle aderiscono alla parete della fiala.

Raccogliere e trasferire le cellule in un'altra provetta conica da 50 millilitri e contare il numero di cellule. Determinare la specificità dell'antigene dell'A A PC mediante colorazione con tetramero secondo il protocollo del produttore. Riproduci le cellule raccolte con il nuovo A A PC nelle stesse condizioni per generare un aumento del numero di cellule nella specificità dell'antigene.

Ecco un risultato rappresentativo della colorazione con tetramero del CTL specifico per CMV generato da A A PC dopo una settimana di coltura. Di seguito è mostrato un risultato rappresentativo della colorazione delle citochine intracellulari del CTL specifico per CMV generato da A-A-P-C-C-M-V la specificità era del 61% dalla colorazione con tetramero. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo delle cellule T, ad esempio come possiamo identificare le condizioni colturali ottimali e i requisiti per la modulazione funzionale delle cellule T.

Il metodo Lowly ha fornito informazioni sul trattamento delle malattie virali. Può essere applicato anche in altri campi come il cancro.