Name: HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti delluomo e CTL (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Scopri l'espansione ex vivo di linfociti T citotossici specifici per l'antigene utilizzando cellule artificiali presentanti l'antigene basate su HLA A2-Ig. Questo metodo migliora l'efficienza dell'immunoterapia adottiva.

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Vorremmo ringraziare Aaron Selya di discussione utile. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere AI29575, CA108835, AI077097 a JS, una borsa di studio pilota della Johns Hopkins Malaria Research Institute e il Dipartimento della Difesa concedere PC di MO 040972

1. Fare, HLA-A2-Ig base aAPC <ol><li> Preparare un tampone sterile borato <ol><li> Sciogliere l'acido borico in acqua per fare 0.1M. Regolare il pH a 7,0. </li><li> Filtrare attraverso un filtro 0.22μm sterile e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare tampone sterile Bead Lavare <ol><li> Prendere 956ml PBS w / o magnesio o di calcio. </li><li> Aggiungere 30 ml di siero umano AB. </li><li> Aggiungi EDTA concentrazione finale 2mm. </li><li> Aggiungi 0.1gsodium azide. </li><li> Filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron sterile e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Prendere 1 ml di Invitrogen M-450 perle di resina epossidica a magazzino, circa 400 milioni di perline (sfere possono essere contati da emocitometro), e messo in una sterile, flaconcino di vetro tappo a vite. </li><li> Mettete la fiala contro una calamita Dynal MPC-1, mentre le perline aderire al lato del flaconcino, togliere il surnatante tramite aspirazione. Lavare una volta con perle di 1 ml di tampone borato. </li><li> Perline risospendere in una miscela di tampone borato da 1 ml e 20 mg di HLA-A2-Ig dimero e 20 mg di mAb anti-CD28 umano (clone 9,3). </li><li> Proteine ​​per coniugazione tallone: ​​mettere il flacone di vetro sul rotore e ruotare a 4 ° C per 24 ore. </li><li> Porre il tubo in MPC-1 magnete e rimuovere tutti tampone borato. </li><li> Lavare le perle due volte con 1 ml di tampone di lavaggio Bead. </li><li> Incubare le perline in 1 ml tampone di lavaggio perlina, ruotare a 4 ° C per 24 ore. Perché tampone di lavaggio contiene microsfere di siero umano AB, bloccherà tutto il sito residuo legame con le proteine ​​sulla perline. </li><li> Rimuovere il surnatante dal flacone di vetro, sostituire con 1 ml di tampone fresco Lavare Bead. </li></ol> 2. Controllo della qualità dei aAPC e peptide carico, stoccaggio <ol><li> Aggiungere ~ 5 × 10 5 perline di FACS 100μl tampone di lavaggio in tubi di FACS, e la macchia con 1ml di anti-mouse IgG1-PE (riconoscere la parte Fc di HLA-A2-Ig) e 1ml di anti-topo IgG2a-FITC (riconoscere la parte Fc di mAb anti-CD28). Dopo la colorazione per 20 minuti in FACS lavaggio tampone, lavare di nuovo e leggere il risultato colorazione immediatamente citofluorimetro (Figura 4). </li><li> Peptide carico sul perle: lavare le perle due volte in flaconcino di vetro con 1 ml di PBS sterile. Risospendere con 1 ml di PBS sterile quindi aggiungere 10μl di CMV peptide (1mg/ml) </li><li> Contare le perline da emocitometro, e l'etichetta del flaconcino con data e concentrazione. </li><li> aAPC sono pronti per l'uso dopo almeno 3 giorni di incubazione peptide a 4 ° C, per consentire un tempo sufficiente di legame peptidico sul HLA-A2-Ig dimero. Le sfere possono essere conservato a 4 ° C e rimangono funzionali per almeno 6 mesi. </li></ol> 3. CTL isolamento umano <ol><li> Raccogliere ~ 100 ml di sangue fresco periferico di sano HLA-A2 donatore positivo in 10 tubi di eparina sodica Vacutainer BD. Utilizzare una 21-gauge o più grande per evitare l'emolisi. </li><li> Centrifugare a 300xg per 10 minuti a temperatura ambiente </li><li> Rimuovere con cura lo strato superiore al plasma per aspirazione. Il plasma può essere usato come supplemento per il terreno di coltura. </li><li> Sostituire il plasma raccolto con PBS sterile e trasferire il sangue in una sterile T75 fiasco cultura o provette coniche da 50 ml. Mescolare il sangue con PBS ben pipettando su e giù. </li><li> Una volta che tutto il sangue viene raccolto, preparare altri quattro tubi conici da 50 ml e aggiungere 15 ml di Ficoll-Paque Plus. </li><li> Lentamente overlay 30-35ml di cellule del sangue sulla parte superiore del Ficoll di ciascun tubo. Mantenere l'interfaccia distinte tra Ficoll e le cellule del sangue. </li><li> Centrifugare a 500xg per 20 minuti a temperatura ambiente. Girare il freno "off" e l'accelerazione più basso possibile di mantenere una chiara interfaccia tra gli strati. </li><li> Usando una pipetta seriological, aspirare con cura lo strato PBMC e raccogliere il PBMC in una fresca 50ml tubo conico. Quando tutti i PBMC vengono raccolti aggiungere 30 ml di PBS e far girare a 400xg per 10 minuti. Scartare il surnatante e lavare una volta con 30 ml di PBS per rimuovere tutti i residui di Ficoll. </li><li> Procedere alla isolamento delle cellule CD8 + T utilizzando Miltenyi umane CD8 + kit di isolamento delle cellule T secondo il protocollo del produttore. Questo kit arricchisce molto per CD8 + (di solito&gt; 95%) mediante deplezione CD8 - cellule. </li><li> Contare le cellule T CD8 +. La purezza attesi dovrebbero essere superiore al 95%. A conferma di ciò 2x10 uso 5 celle ed eseguire una CD4/3/8 analisi FACS. Il CTL rimanente può essere utilizzata subito per l'antigene specifico per la stimolazione aAPC oppure possono essere congelati per un uso futuro. </li></ol> 4. Nel sistema di coltura in vitro aAPC base <ol><li> Preparare un terreno di coltura <ol><li> Per TF (fattore di crescita delle cellule T, realizzato in laboratorio 4) 2X terreno di coltura: medium RPMI completo più il 5% del donatore autologo plasma e l'8% fattore di crescita delle cellule T. </li><lidonatori plasma autologo pu essere sostituito da inattivato al calore umano siero ab.></lidonatori></ol></li><li> Risospendere 1 milioni CTL a 8ml di media cultura TF 2X più 8ml di completo media RPMI, aggiungere 1 × 10 6 aAPC, mescolare bene. </li><li> Utilizzare un multi-canale pipetter alle cellule sulla piastra da 96 pozzetti U fondo piastre di coltura dei tessuti. (160 microlitri per pozzetto) </li><li> Cellule in coltura a 37 ° C, 5% CO 2 incubater per 7 giorni. Nutrire le cellule il giorno 4 con 80 microlitri / e medio TF 2X. </li><li> Le cellule sono pronte per essere raccolte il giorno 7. Dopo la raccolta, posto le cellule contro il magnete e rimuovere il vecchio aAPC. </li><li> Specificità antigenica può essere determinata colorazione tetramero secondo il protocollo del produttore. Fenotipo colorazione e colorazione delle citochine intracellulari sono eseguite in conformità alle nostre 3 precedente studio. </li><li> Cellule raccolte possono essere saltuariamente con aAPC di nuovo nelle stesse condizioni. Numero di cellulare e specificità antigenica è previsto un aumento dopo stimolazione ripetuta. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Un esempio di aAPC dopo coniugazione HLA-A2 Ig e anti-CD28 è mostrata in Figura 4. Coniugazione di proteine ​​di successo è evidente da un chiaro spostamento di colorazione degli anticorpi corrispondenti. Mentre la frequenza di specifici CTL CMV nel sangue periferico è tipicamente 0,5-1%, dopo una sola settimana di aAPC-mediata stimolazione, la specificità può raggiungere il 55 - 93% (Figura 2 e 3). L'espansione del CTL antigene specifico può essere molto variabile tra i diversi donatori, ma i risultati sono riproducibili all'interno dello stesso donatore. Per estrapolazione, l'espansione delle cellule CMV specifiche possono essere migliaia di volte rispetto ai livelli precursore direttamente ex vivo (dati non riportati). Colorazione intracellulare delle citochine (Figura 3) mostra che questi CTL espanso sono polifunzionali, piuttosto che esausto, dopo la coltura cellulare e la proliferazione prolungato significativo. <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso rappresentante di aAPC espansione basata ex vivo di CTL umane per l'immunoterapia adottiva in HSCT allogenico <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Rappresentante tetramero risultato colorazione dei CTL CMV specifiche generate da aAPC dopo una settimana di cultura <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Rappresentante intracellulare risultato colorazione citochine di CTL CMV specifiche generate da aAPC (CMV è stata specificità 61%) <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Risultato colorazione rappresentante di M-450 perle di resina epossidica dopo coniugazione di proteine ​​colorate con anticorpi anti-mouse IgG1-PE e anti-mouse IgG2-FITC

<ol><li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li>
<li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer%3A+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+antigen-presenting+cells%3A+artificial+solution+for+real+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il sistema aAPC che descriviamo qui è un sistema efficiente per l&#39;espansione ex vivo di CTL umana contro una varietà di antigeni. Particolare cura deve essere presa per quanto riguarda la qualità della coniugazione di proteine ​​e la distribuzione anche di aAPC e CTL nella cultura piastra da 96 pozzetti. Utilizzando questo approccio siamo stati in grado di espandere CTL per più di 8 settimane, durante i quali abbiamo ampliato antigene-specifici CTL fino a un milione di volte 4. Ci sono stati vari sistemi APC artificiali che utilizzano linee cellulari o altre piattaforme acellulare 5, tuttavia, secondo i dati pubblicati ogni sistema ha il suo profilo unico per quanto riguarda l&#39;espansione e la specificità supportare le applicazioni differenti. Importante, poiché la qualità del CTL è importante quanto la quantità, la polifunzionalità del CMV-specifici CTL generati dal nostro sistema sono tenuti a conferire superiore anti-virale efficienza.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Vacutainer tubo (contiene eparina) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367874 </td></tr><tr><td> Umane CD8 + kit di isolamento delle cellule T </td><td> Miltenyi </td><td> 130-094-156 </td></tr><tr><td> Dynabeads M-450 epossidica </td><td> Invitrogen </td><td> 140,11 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-1 Magnete </td><td> Invitrogen </td><td> 120-01D </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus. </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 medium </td><td> Gibco </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> HLA-A2-Ig dimero X </td><td> Becton Dickinson </td><td> 551263 </td></tr><tr><td> iTAgMHC tetramero (HLA-A2-CMV)-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> T20099 </td></tr><tr><td> Falcon 96-ben chiaro piastrina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 353077 </td></tr><tr><td> Ratto anti-topo IgG2a-FITC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 553390 </td></tr><tr><td> Capra anti-topo IgG1-PE </td><td> Invitrogen </td><td> P21129 </td></tr><tr><td> Siero umano di tipo AB </td><td> Atlanta biologici </td><td> S40110 </td></tr><tr><td> Topo anti-umano CD8a-FITC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0772 </td></tr><tr><td> Topo anti-umano CD8a-APC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340684 </td></tr><tr><td> Topo anti-umano IFNγ-FITC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340449 </td></tr><tr><td> Topo anti-umana TNF-PE </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340512 </td></tr></tbody></table>

hla-ig celle in base antigen presenting artificiale per efficiente ex vivo estensione dei diritti dell&#39;uomo e ctl

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL con ottima funzione effettrice giocano un ruolo critico nel mediare la protezione contro varie infezioni intracellulari e cancro. Tuttavia, gli individui possono presentare soppressivi microambiente immunitario e, in contrasto con l&#39;attivazione di CTL, le loro cellule autologhe che presentano l&#39;antigene possono tendere a tolerize o anergize CTL antigene specifico. Come risultato, anche se ancora in fase sperimentale, CTL-immunoterapia adottiva si è evoluto fino a diventare un promettente trattamento per varie malattie come il cancro e le infezioni da virus. In esperimenti iniziali ex vivo ampliato CMV (citomegalovirus) CTL specifici sono stati utilizzati per il trattamento delle infezioni da CMV nei pazienti immunocompromessi trapianto allogenico di midollo osseo. Mentre è comune avere pericolose per la vita viremia CMV in questi pazienti, nessuno dei pazienti trattati ampliato CTL sviluppare malattie legate CMV, che implica l&#39;anti-CMV immunità è stabilito dal adoptively trasferiti CTL 1. Risultati promettenti sono stati osservati anche per il melanoma e può essere estesa ad altri tipi di cancro 2. Mentre ci sono molti modi per ex vivo stimolare e ampliare CTL umane, di approcci attuali sono limitati dai limiti di costo e tecnico. Ad esempio, il gold standard attuale si basa sull&#39;uso di DC autologhe. Questo richiede che ogni paziente di donare un significativo numero di leucociti ed è anche molto costoso e laborioso. Inoltre, dettagliata caratterizzazione in vitro di DC ampliato CTL ha rivelato che questi hanno solo non ottimale funzione effettrice 3. Qui vi presentiamo una efficiente sistema di aAPC base per l&#39;espansione ex vivo di CMV umano CTL specifici per l&#39;immunoterapia adottiva (Figura 1). Il aAPC sono state fatte da accoppiamento cellula magnetica con perline di dimensioni umane HLA-A2-Ig dimero e anti-CD28mAb 4. Una volta aAPC sono fatti, possono essere caricati con peptidi di interesse, e rimangono funzionali per mesi. In questo rapporto, aAPC sono stati caricati con un peptide dominante da CMV, pp65 (NLVPMVATV). Dopo coltura purificata umano CD8 + CTL da un donatore sano con aAPC per una settimana, aspirazione specifici CTL può essere aumentata drammaticamente nella specificità fino al 98% (Figura 2) e amplificato più di 10.000 volte. Se più CMV-specifici CTL sono richiesti, l&#39;ulteriore espansione può essere facilmente ottenuto con stimolazione ripetitiva aAPC. Caratterizzazione fenotipica e funzionale mostra queste cellule espanse hanno fenotipo un effettore-memoria e una notevole quantità di entrambi TNFa e IFNγ (Figura 3).

Un nuovo metodo DC indipendente per l&#39;induzione e l&#39;espansione di antigene-specifica delle cellule T è descritta. HLA-A2 Ig Cellule artificiali basati Antigen Presenting (aAPC) vengono caricati con HLA-A2 peptidi limitato ad ampliare in modo efficace CTL di specificità antigenica diversi. Questa tecnologia ha un grande potenziale per CTL-immunoterapia adottiva.

HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

I linfociti T citotossici (CTL) con una funzione effettrice ottimale svolgono ruoli critici nel mediare la protezione contro diverse infezioni intracellulari e il cancro. Tuttavia, gli individui...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare cellule presentanti l'antigene artificiali o A PC per l'espansione ex vivo di CTL umani specifici per l'antigene, per un potenziale utilizzo nella immunoterapia adottiva. Questo viene ottenuto innanzitutto coniugando HLA A two IG e un anticorpo monoclonale anti-CD28 umano a microsferette magnetiche Dyna per ottenere una A PC. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'eseguire il controllo di qualità e il caricamento del peptide sulla A PC. Il terzo passaggio della procedura consiste nell'isolare le cellule T CD8 positive dal sangue periferico umano. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'incubazione delle cellule T CD8 positive con la A PC per una settimana.I CTL vengono quindi raccolti e caratterizzati prima di essere utilizzati oppure re-stimolati per un'altra settimana al fine di raggiungere il livello desiderato di specificità ed espansione. Alla fine, si possono ottenere risultati di tetramero o di colorazione che mostrano come i CTL espansi in presenza di A A PC presentino una specificità antigenica aumentata. Oggi vi mostrerò un sistema A A PC basato su HI IG e come utilizzare questo sistema per espandere in modo efficiente i CTL umani specifici per il CMV ex vivo, rispetto ad altri metodi esistenti.La nostra tecnologia A A PC offre diversi vantaggi importanti. È disponibile in commercio, è disponibile in quantità illimitata e, diciamo, l'A A PC può essere utilizzata per tutti i donatori HRAA due positivi. Ok, iniziamo: trasferire un millilitro di perle di epoxi M four 50 da una soluzione madre contenente circa 400 milioni di perle in un vial di vetro sterile con tappo a vite.Lavare le perle una volta aggiungendo un millilitro di tampone boid e quindi posizionando la provetta di vetro contro un magnete NBC1 mentre le perle aderiscono alla parete della provetta. Rimuovere il surnatante per aspirazione. Sospendere le perle in una miscela di tampone boid, dimero HLA-A2-Ig e anticorpo monoclonale anti-CD28 umano.Successivamente, per favorire la coniugazione della proteina con le perle, ruotare il vial di vetro su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius per 24 ore. Successivamente, posizionare il tubo su un magnete MPC1 e rimuovere tutto il tampone borato. Dopo aver rimosso il tampone, lavare le perle due volte con un millilitro di tampone per il lavaggio delle perle.Ora incubare le perle in un millilitro di buffer di lavaggio delle perle e ruotare il vial a quattro gradi Celsius per altre 24 ore per bloccare i siti di legame proteico residui sulle perle. Rimuovere quindi il buffer dal vial di vetro e sostituirlo con un millilitro di buffer di lavaggio delle perle fresco. Trasferire 100 microlitri di buffer di lavaggio fax in provette fax, quindi aggiungere cinque volte 10 alla quinta perle.Colorare le perle con un microlitro di anti topo IgG, uno PE e un microlitro di anti topo IgG due a fite dopo la colorazione per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere tre millilitri di buffer di lavaggio fax a ciascuno dei campioni colorati. Quindi raccogliere le A A PC centrifugando a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Sospendere nuovamente le cellule A PC in tampone fresco per fax e leggere immediatamente il risultato della colorazione mediante citometria a flusso. Lavare le microsfere due volte con PBS sterile come in precedenza. Successivamente, caricare le microsfere con 10 microlitri di peptide CMV.Contare le perline mediante emocitometro, quindi etichettarle con la data e la concentrazione delle perline in perline per millilitro. Incubare le A A PC con il peptide per almeno tre giorni a quattro gradi Celsius. Centrifugare circa 100 millilitri di sangue periferico fresco proveniente da un donatore positivo per HLA A due in provette vuoto con 10 unità di eparina sodica a 300 G per 10 minuti.A temperatura ambiente, rimuovere con attenzione il livello superiore di plasma mediante aspirazione. Sostituire il plasma raccolto con PBS sterile e trasferire il sangue in un flacone da coltura sterile di dimensioni T 75. Mescolare bene il sangue e il PBS mediante pipettaggio dopo aver raccolto tutto il sangue in un volume di 15 millilitri di fial pack più quattro provette coniche da 50 millilitri.Aggiungere lentamente da 30 a 35 millilitri di cellule sanguigne sopra il fial in ogni provetta. Mantenendo distinta l'interfaccia tra il fial e le cellule sanguigne, centrifugare il gradiente di sangue e fial a 500 ×g per 20 minuti a temperatura ambiente, con la frenata disattivata e l'accelerazione più bassa possibile per mantenere un'interfaccia chiara tra i livelli dopo la centrifugazione. Aspirare il livello superiore di plasma e quindi utilizzare una pipetta serologica per aspirare con attenzione il livello di PBMC. Trasferire i PBMC in una nuova provetta conica da 50 millilitri; una volta raccolti tutti i PBMC, aggiungere 30 millilitri di PBS alle cellule e centrifugarli.Successivamente, eliminare il soprannatante e lavare il pellet un'altra volta con 30 millilitri di PBS per rimuovere i residui di fi call, quindi arricchire la popolazione di linfociti T CD8 positivi utilizzando un kit di isolamento di linfociti T CD8 positivi umani Milton, seguendo il protocollo del produttore. Contare i linfociti T CD8 positivi e confermare la purezza mediante analisi al fax.Sospendere 1 milione di CTL in otto millilitri di mezzo di coltura per il fattore di crescita delle cellule T due x più otto millilitri di mezzo RPMI completo e aggiungere una volta 10 alla sesta della miscela A A PC. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 160 microlitri di cellule per pozzetto in una piastra da coltura tissutale a 96 pozzetti con fondo a U. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5% per sette giorni.Alimentare le cellule al quarto giorno con 80 microlitri per pozzetto di mezzo di coltura con fattore di crescita per linfociti T. Raccogliere le cellule al settimo giorno, quindi posizionare il campione sul magnete per rimuovere l'AA PC vecchio una volta che tutte le perline si saranno attaccate alla parete del flacone.Raccogliere e trasferire le cellule in un altro tubo conico da 50 millilitri e contare il numero di cellule. Determinare la specificità dell'antigene delle APC AA mediante colorazione con tetramero seguendo il protocollo del produttore. Riutilizzare le cellule raccolte con nuove APC AA nelle stesse condizioni per aumentare il numero di cellule con specificità per l'antigene.Di seguito è mostrato un risultato rappresentativo di colorazione con tetramero di CTL specifici per CMV generati da A A PC dopo una settimana di coltura. Qui viene mostrato un risultato rappresentativo di colorazione intracellulare per citochine di CTL specifici per CMV generati da A-A-P-C-C-M-V; la specificità era del 61% mediante colorazione con tetramero. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nel campo dei linfociti T, come ad esempio come possiamo identificare le condizioni di coltura ottimali e i requisiti per la modulazione della funzionalità dei linfociti T.Il metodo semplice ha fornito spunti per il trattamento delle malattie virali. Può inoltre essere applicato ad altri campi, come il cancro.

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