HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell'uomo e CTL

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare cellule presentanti l'antigene artificiali o A PC per l'espansione ex vivo di CTL umani specifici per l'antigene, per un potenziale utilizzo nella immunoterapia adottiva. Questo viene ottenuto innanzitutto coniugando HLA A two IG e un anticorpo monoclonale anti-CD28 umano a microsferette magnetiche Dyna per ottenere una A PC. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'eseguire il controllo di qualità e il caricamento del peptide sulla A PC. Il terzo passaggio della procedura consiste nell'isolare le cellule T CD8 positive dal sangue periferico umano. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'incubazione delle cellule T CD8 positive con la A PC per una settimana.

I CTL vengono quindi raccolti e caratterizzati prima di essere utilizzati oppure re-stimolati per un'altra settimana al fine di raggiungere il livello desiderato di specificità ed espansione. Alla fine, si possono ottenere risultati di tetramero o di colorazione che mostrano come i CTL espansi in presenza di A A PC presentino una specificità antigenica aumentata. Oggi vi mostrerò un sistema A A PC basato su HI IG e come utilizzare questo sistema per espandere in modo efficiente i CTL umani specifici per il CMV ex vivo, rispetto ad altri metodi esistenti.

La nostra tecnologia A A PC offre diversi vantaggi importanti. È disponibile in commercio, è disponibile in quantità illimitata e, diciamo, l'A A PC può essere utilizzata per tutti i donatori HRAA due positivi. Ok, iniziamo: trasferire un millilitro di perle di epoxi M four 50 da una soluzione madre contenente circa 400 milioni di perle in un vial di vetro sterile con tappo a vite.

Lavare le perle una volta aggiungendo un millilitro di tampone boid e quindi posizionando la provetta di vetro contro un magnete NBC1 mentre le perle aderiscono alla parete della provetta. Rimuovere il surnatante per aspirazione. Sospendere le perle in una miscela di tampone boid, dimero HLA-A2-Ig e anticorpo monoclonale anti-CD28 umano.

Successivamente, per favorire la coniugazione della proteina con le perle, ruotare il vial di vetro su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius per 24 ore. Successivamente, posizionare il tubo su un magnete MPC1 e rimuovere tutto il tampone borato. Dopo aver rimosso il tampone, lavare le perle due volte con un millilitro di tampone per il lavaggio delle perle.

Ora incubare le perle in un millilitro di buffer di lavaggio delle perle e ruotare il vial a quattro gradi Celsius per altre 24 ore per bloccare i siti di legame proteico residui sulle perle. Rimuovere quindi il buffer dal vial di vetro e sostituirlo con un millilitro di buffer di lavaggio delle perle fresco. Trasferire 100 microlitri di buffer di lavaggio fax in provette fax, quindi aggiungere cinque volte 10 alla quinta perle.

Colorare le perle con un microlitro di anti topo IgG, uno PE e un microlitro di anti topo IgG due a fite dopo la colorazione per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere tre millilitri di buffer di lavaggio fax a ciascuno dei campioni colorati. Quindi raccogliere le A A PC centrifugando a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Sospendere nuovamente le cellule A PC in tampone fresco per fax e leggere immediatamente il risultato della colorazione mediante citometria a flusso. Lavare le microsfere due volte con PBS sterile come in precedenza. Successivamente, caricare le microsfere con 10 microlitri di peptide CMV.

Contare le perline mediante emocitometro, quindi etichettarle con la data e la concentrazione delle perline in perline per millilitro. Incubare le A A PC con il peptide per almeno tre giorni a quattro gradi Celsius. Centrifugare circa 100 millilitri di sangue periferico fresco proveniente da un donatore positivo per HLA A due in provette vuoto con 10 unità di eparina sodica a 300 G per 10 minuti.

A temperatura ambiente, rimuovere con attenzione il livello superiore di plasma mediante aspirazione. Sostituire il plasma raccolto con PBS sterile e trasferire il sangue in un flacone da coltura sterile di dimensioni T 75. Mescolare bene il sangue e il PBS mediante pipettaggio dopo aver raccolto tutto il sangue in un volume di 15 millilitri di fial pack più quattro provette coniche da 50 millilitri.

Aggiungere lentamente da 30 a 35 millilitri di cellule sanguigne sopra il fial in ogni provetta. Mantenendo distinta l'interfaccia tra il fial e le cellule sanguigne, centrifugare il gradiente di sangue e fial a 500 ×g per 20 minuti a temperatura ambiente, con la frenata disattivata e l'accelerazione più bassa possibile per mantenere un'interfaccia chiara tra i livelli dopo la centrifugazione. Aspirare il livello superiore di plasma e quindi utilizzare una pipetta serologica per aspirare con attenzione il livello di PBMC. Trasferire i PBMC in una nuova provetta conica da 50 millilitri; una volta raccolti tutti i PBMC, aggiungere 30 millilitri di PBS alle cellule e centrifugarli.

Successivamente, eliminare il soprannatante e lavare il pellet un'altra volta con 30 millilitri di PBS per rimuovere i residui di fi call, quindi arricchire la popolazione di linfociti T CD8 positivi utilizzando un kit di isolamento di linfociti T CD8 positivi umani Milton, seguendo il protocollo del produttore. Contare i linfociti T CD8 positivi e confermare la purezza mediante analisi al fax.

Sospendere 1 milione di CTL in otto millilitri di mezzo di coltura per il fattore di crescita delle cellule T due x più otto millilitri di mezzo RPMI completo e aggiungere una volta 10 alla sesta della miscela A A PC. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 160 microlitri di cellule per pozzetto in una piastra da coltura tissutale a 96 pozzetti con fondo a U. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5% per sette giorni.

Alimentare le cellule al quarto giorno con 80 microlitri per pozzetto di mezzo di coltura con fattore di crescita per linfociti T. Raccogliere le cellule al settimo giorno, quindi posizionare il campione sul magnete per rimuovere l'AA PC vecchio una volta che tutte le perline si saranno attaccate alla parete del flacone.

Raccogliere e trasferire le cellule in un altro tubo conico da 50 millilitri e contare il numero di cellule. Determinare la specificità dell'antigene delle APC AA mediante colorazione con tetramero seguendo il protocollo del produttore. Riutilizzare le cellule raccolte con nuove APC AA nelle stesse condizioni per aumentare il numero di cellule con specificità per l'antigene.

Di seguito è mostrato un risultato rappresentativo di colorazione con tetramero di CTL specifici per CMV generati da A A PC dopo una settimana di coltura. Qui viene mostrato un risultato rappresentativo di colorazione intracellulare per citochine di CTL specifici per CMV generati da A-A-P-C-C-M-V; la specificità era del 61% mediante colorazione con tetramero. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nel campo dei linfociti T, come ad esempio come possiamo identificare le condizioni di coltura ottimali e i requisiti per la modulazione della funzionalità dei linfociti T.

Il metodo semplice ha fornito spunti per il trattamento delle malattie virali. Può inoltre essere applicato ad altri campi, come il cancro.