Micro-Caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare usando la microscopia a forza atomica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di caratterizzare l'ambiente meccanico locale del parenchima polmonare su una scala spaziale rilevante per le cellule residenti, misurando direttamente le proprietà elastiche locali del tessuto polmonare fresco specchiante utilizzando la microscopia a forza atomica. Ciò si ottiene tagliando il tessuto polmonare di topo gonfiato con un rasoio o una lama di bisturi per preparare strisce di parenchima polmonare di cinque per cinque millimetri di lunghezza e larghezza e 400 micrometri di spessore. Successivamente, le strisce di tessuto polmonare non fissate sono immuno color, che identificano le aree di interesse per una micro indentazione FM.

Quindi viene eseguita una micro indentazione FM su strisce di tessuto in PBS a temperatura ambiente. Al fine di misurare direttamente le proprietà elastiche locali del tessuto polmonare fresco, si ottengono risultati. Ciò mostra notevoli differenze nell'intervallo e nella distribuzione della rigidità tissutale nel parenchima polmonare normale e fibrotico e grandi variazioni spaziali nella rigidità, in particolare all'interno del campione polmonare fibrotico.

Basato su mappe di rigidezza estratte da curve di spostamento forzato ottenute utilizzando una micro indentazione FM. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle misure esistenti come l'allungamento delle strisce di tessuto è che offre una risoluzione spaziale senza precedenti, fornendo una prospettiva unica sulla variazione su microscala della rigidità dei tessuti. Questa misura può aiutare a rispondere a domande chiave come il modo in cui la rigidità varia spazialmente all'interno del tessuto e quale sia l'entità e la scala spaziale delle variazioni di rigidità nella malattia.

Processi che provocano il rimodellamento dei tessuti Per preparare strisce di tessuto polmonare, iniziare stabilizzando la struttura polmonare per il taglio gonfiando i polmoni di topo isolati. Per via intratracheale con 50 millilitri per chilogrammo di peso corporeo caldo, 2% basso punto di gel preparato in PBS, legare la trachea e raffreddare i polmoni gonfiati in un bagno di PBS a quattro gradi Celsius per 60 minuti. Durante questo intervallo, usando un rasoio o un bisturi, tagliare il tessuto polmonare stabilizzato aros in strisce di circa cinque per cinque millimetri di lunghezza e larghezza e 400 micrometri di spessore.

Quindi lavare le strisce in PBS a 37 gradi Celsius per cinque minuti per rimuovere gli aros residui ed escludere grandi vie aeree e vasi. Strisce tagliate da regioni subpleuriche distanti dai bronchi dello stelo principale se si devono visualizzare le vie aeree e i vasi di grandi dimensioni Strisce tagliate dal tessuto polmonare più prossimale ai bronchi dello stelo principale per isolare le aree di interesse per una micro indentazione FM. Visualizzare il tessuto mediante microscopia a contrasto facciale o immunocolorazione e visualizzare mediante microscopia a fluorescenza.

Si prega di consultare la parte scritta di questo protocollo per la procedura. Immediatamente prima di una caratterizzazione FM, attaccare le strisce di tessuto ai vetrini coprioggetti da 15 millimetri rivestiti di poli L lisina sollevando il vetrino coprioggetto da sotto il tessuto galleggiante, assicurandosi che la striscia di tessuto si diffonda uniformemente sulla superficie del vetrino coprioggetti. Se necessario, inserire la striscia con un secondo vetrino coprioggetti pulito e non rivestito e applicare una leggera pressione per facilitare l'adesione del tessuto al vetrino coprioggetti rivestito in poli-L lisina.

Calibrare il sistema A FM seguendo le istruzioni del produttore immediatamente prima di ogni ciclo di esperimenti di microindentazione. Per questo, determinare due parametri critici. La costante della molla a sbalzo utilizzando il metodo della fluttuazione termica in aria e la sensibilità alla deflessione a sbalzo, che è un parametro utilizzato per scalare il segnale di uscita del fotodiodo alla distanza di deflessione a sbalzo effettiva.

Calibrare la sensibilità alla deflessione ottenendo una curva di spostamento forzato standard in PBS su un vetrino pulito. Quindi calcolare la pendenza della curva di spostamento forzato nella misurazione della curva di spostamento forzato. La punta A FM viene estesa e retratta dalla superficie del campione in un'unica posizione con la deflessione del delta D a sbalzo monitorata in funzione del delta di spostamento della punta Z.It si consiglia di utilizzare un cantilever triangolare in nitruro di silicio con una punta sferica in silicato bo di cinque micrometri di diametro utilizzando una sonda FM con una costante elastica di 0,06 newton per metro.

Abbiamo caratterizzato meccanicamente materiali morbidi con una forma pura che va da 100 a 50.000 pascal. Pulire la superficie inferiore del vetrino copricampione con carta velina, quindi fissarlo a un vetrino standard con grasso per vuoto. Montare il vetrino sul tavolino di campionamento A FM e coprire il tessuto con 500 microlitri di PBS a temperatura ambiente.

Quindi posizionare la testina di scansione FM sul campione. Regolare il tavolino del campione del microscopio per impostare il microscopio per la visualizzazione dell'oculare per allineare la punta A FM al centro del campo visivo. Spostare lo stadio di campionamento A FM per scegliere un'area di interesse sul tessuto.

Quindi passa alla visualizzazione con telecamera CCD per registrare immagini a contrasto di fase e/o immagini a fluorescenza del tessuto come desiderato. Spostare lentamente la punta A FM verso il basso fino a quando non è a contatto con il sample accurato. Una caratterizzazione di micro indentazione FM di campioni morbidi richiede piccole profondità di indentazione per evitare grandi deformazioni locali, che invalidano il modello hertz utilizzato per il calcolo del modulo elastico per evitare grandi deformazioni, eseguire l'indentazione in modalità trigger impostando la deflessione massima a sbalzo a 500 nanometri.

Questo limite di deflessione limiterà la forza massima di indentazione a meno di 30 nano newton. La velocità di indentazione deve essere selezionata in modo che sia sufficientemente lenta per esplorare le proprietà elastiche piuttosto che viscoelastiche del campione morbido. Selezionare un intervallo di velocità da due a 20 micrometri al secondo per il tessuto polmonare per una singola misurazione da un'area di interesse.

Spostare la sonda FM A nella posizione di interesse ed eseguire una singola rientranza per raccogliere una curva di spostamento della forza standard. La sonda si muoverà solo in direzione Z. Per la mappatura automatica di una regione di interesse, passare alla modalità di mappatura forzata, selezionare la dimensione della scansione e i punti di campionamento all'interno dell'area selezionata.

L'A FM punta RA sulla superficie del campione tra i movimenti di indentazione e raccoglie le singole curve di spostamento forzato in ogni punto all'interno di una griglia di campionamento definita inde. Abbiamo trovato pratico utilizzare una griglia di campionamento 16 per 16 per mappare un'area di 80 micrometri per 80 micrometri a una velocità di indentazione di 20 micrometri al secondo, che può essere completata in circa 10 minuti. Per calcolare il modulo di Young, adattare la curva di spostamento della forza al modello di indentazione sferica hertz utilizzando l'adattamento della curva non lineare del quadrato sottovento, come mostrato qui, dove F è uguale a K sub C per delta, D è la forza per piegare il cantilever.

K sub C è la costante della molla a sbalzo. R è il delta del raggio della punta della sfera è uguale a delta Z meno delta D è l'indentazione, e nuovo è il rapporto di Poisson dei campioni, che è uguale a 0,4 per il tessuto polmonare. Per valutare la qualità dell'adattamento, calcolare il valore SSR o la somma dei quadrati della differenza tra i dati e i valori di adattamento durante l'adattamento della curva non lineare.

Elimina le misure inaffidabili o non interpretabili eliminando i dati dalle curve errate con valori SSR elevati. Se lo si desidera, convertire il modulo elastico o E in modulo puro. G. Utilizzando la relazione E equivale a due volte la somma di uno più nuovi tempi G.To visualizzare i modelli spaziali di rigidità raccolti in modalità mappa delle forze, tracciare i dati del modulo e le mappe di contorno, ad esempio, in una griglia 16 per 16 che copre un'area di 80 micrometri per 80 micrometri.

Per elaborare una grande quantità di dati della curva di forza, è possibile scrivere un algoritmo personalizzato per adattare automaticamente le curve di spostamento della forza, estrarre mappe di contorno modulari e/o tracciare mappe di contorno o innesti ELA. Utilizzando le stesse procedure e parametri appena descritti, questa figura mostra che sto tagliando e macchiando correttamente il tessuto. Il micro alveolare del parenchima polmonare è ben conservato come osservato dalla colorazione immunofluorescente per il componente della membrana basale, laminina senza fissazione o permeazione.

Questi pannelli mostrano la colorazione immunofluorescente per il collagene, uno nei polmoni freschi non fissati raccolti da topi precedentemente trattati con PBS o trattati con bliomicina per indurre la fibrosi. I grafici di spostamento della forza campione ottenuti da una micro indentazione FM sono mostrati qui con la stessa forza applicata. La punta A FM genera una grande rientranza su una regione morbida che si traduce in una curva di spostamento della forza relativamente piatta mostrata in blu rispetto a una piccola rientranza e una curva di spostamento della forza ripida per una regione più rigida mostrata in rosso.

Per ottenere curve di forza pulite dopo ogni indentazione, la punta A FM deve essere completamente retratta dalla superficie del campione e priva di contatto prima della successiva indentazione. Questo stato libero da contatto corrisponde alla regione piatta della curva in cui la punta trasla senza deflessione a sbalzo. Questa figura mostra una tipica falsa curva senza una regione piatta, che si verifica quando la punta non è completamente retratta dalla superficie del campione, ad esempio quando il campione morbido si attacca alla punta, rendendo impossibile determinare il punto di contatto se la punta è completamente intrappolata nel campione morbido.

La curva può apparire così, senza una chiara deflessione, ma con un piccolo rumore. Questa figura mostra la rigidità. I dati estratti dalle curve di spostamento forzato vengono visualizzati spazialmente come mappe di rigidità denominate innesto ELAs in cui le scale di colori con l'innesto ELAs di rigidità dimostrano notevoli differenze nell'intervallo e nella distribuzione della rigidità tissutale nel parenchima polmonare normale e fibrotico e grandi variazioni spaziali nella rigidità, in particolare all'interno del campione polmonare fibrotico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caratterizzare l'ambiente meccanico locale del parenchima polmonare misurando direttamente le proprietà elastiche locali del tessuto polmonare fresco utilizzando la copia microscopica della forza atomica.