Name: Micro-Caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare usando la microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Scopri la microindentazione con microscopia a forza atomica per caratterizzare la rigidità del tessuto polmonare normale e fibrotico. Questa tecnica offre risoluzione spaziale senza precedenti per studiare la meccanica tissutale.

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Ringraziamo Tager A. e B. Shea per la collaborazione in corso, e per aver fornito il tessuto polmonare utilizzati a scopo dimostrativo qui. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concedere HL-092961. Questo lavoro è stato eseguito in parte presso il Centro per i sistemi su scala nanometrica (CNS), membro della Rete Nazionale Infrastrutture Nanotechnology, che è sostenuta dalla National Science Foundation sotto premio NSF ECS-0335765. SNC è parte della Facoltà delle Arti e delle Scienze all&#39;Università di Harvard.

1. Preparazione Striscia di tessuto polmonare <ol><li> Tessuto polmonare è altamente compatibile e difficile da tagliare a strisce per la caratterizzazione AFM. Per stabilizzare temporaneamente la struttura del polmone per il taglio, gonfiare i polmoni del mouse isolato intratracheally con 50 ml / kg di peso corporeo del 2% a basso punto di gel di agarosio (preparato in PBS) riscaldato a 37 ° C. Legare la trachea e raffreddare i polmoni gonfiati in un bagno di PBS a 4 ° C per 60 minuti. Il gel di agarosio e si irrigidiscono in spazi aerei per stabilizzare delicatamente la struttura dei polmoni durante questo intervallo 5. Concentrazioni più elevate di agarosio, ovvero il 3-4%, può essere utilizzata per migliorare ulteriormente la stabilizzazione dei tessuti per il taglio. </li><li> Tagliare il agarosio stabilizzato tessuto polmonare mouse con un rasoio o bisturi in strisce di 5 x 5 mm di lunghezza e larghezza e 400 micron di spessore, poi lavare le strisce in un bagno PBS pre-riscaldato a 37 ° C con una da 100 ml bicchiere di vetro su una panchina-top piastra mescolare riscaldato per 5 minuti per rimuovere residui di agarosio. Per escludere le grandi vie aeree e dei vasi, tagliare le strisce subpleuriche da regioni lontane dalle principali bronchi. Se vie aeree ed i vasi di grandi dimensioni devono essere ripreso, tagliare le strisce di tessuto polmonare più prossimale al principale bronchi. </li></ol> 2. AFM micropenetrazione e imaging di fluorescenza <ol><li> Per isolare le aree di interesse per micropenetrazione AFM, il tessuto può essere visualizzata mediante microscopia a contrasto di fase, o immunoistochimica e visualizzati al microscopio a fluorescenza. Per immunostaining, blocco strisce di tessuto con 5% di siero dalla sorgente dell'anticorpo secondario desiderato (in PBS) per 2 ore senza fissazione o permeabilizzazione a temperatura ambiente. </li><li> Incubare la striscia di tessuto con adeguate anticorpo primario (ad esempio di coniglio anti-collagene I per visualizzare collagene interstiziale (diluizione 1:250), di coniglio anti-laminina (diluizione 1:250) per visualizzare membrana basale) in un pozzetto di una 12-pozzetti su un rocker agitando delicatamente per 1 ora, lavare campione 3 volte per 5 minuti ciascuno con PBS, seguita da opportune anticorpo secondario coniugato con tag fluorescenti (ad esempio Alexa Fluor 546 capra anti-coniglio anticorpo secondario (diluizione 1:250)) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le strisce di tessuto molto con PBS e conservare in PBS a 4 ° C </li><li> Immediatamente prima caratterizzazione AFM, attaccare la striscia di tessuto di un poli-l-lisina rivestito di 15 mm coprioggetto sollevando il coprioggetto da sotto il tessuto galleggiante, assicurandosi che la striscia di tessuto si diffonde in modo uniforme sulla superficie del vetrino, se necessario, a sandwich la striscia con un panno pulito secondo, non patinati coprioggetto e applicare una leggera pressione per assistere con attaccamento al tessuto poli-L-lisina rivestite coprioggetto. </li><li> Calibrare il sistema AFM seguenti istruzioni per la fabbricazione è immediatamente prima di ogni turno di esperimenti micropenetrazione. Stabilire due parametri fondamentali: 1) la molla a sbalzo costante con il metodo termico fluttuazione in aria 6, e, 2) la sensibilità di deflessione a sbalzo, che è un parametro utilizzato per scalare il segnale di uscita fotodiodo per la distanza effettiva flessione a sbalzo, Δd. Calibrare la sensibilità flessione ottenendo uno standard di forza-spostamento della curva in PBS su un vetrino pulito quindi calcolare la pendenza della curva forza-spostamento (Fig.1B). In forza-spostamento di misura della curva, la punta AFM è teso verso di retratto e dalla superficie del campione in un unico luogo (senza raster in direzioni XY), con la deflessione del cantilever, Δd, monitorati in funzione della cilindrata punta, Δz . </li></ol> Si consiglia di utilizzare un nitruro di silicio a sbalzo triangolo con un 5-micron di diametro borosilicato estremità sferica (Novascan). Utilizzando sonde AFM con una molla costante di 0,06 N / m, abbiamo meccanicamente caratterizzato materiali morbidi con moduli di taglio si estende da 100 a 50.000 Pa. <ol start="6"><li> Pulire la superficie inferiore del coprioggetto campione con la carta velina, fissarla ad un vetrino standard con grasso per vuoto, montare il vetrino sul palco campione AFM, e coprire il tessuto con 500 microlitri di PBS (temperatura ambiente). </li><li> Impostare il microscopio per la visione oculare per allineare la punta AFM al centro del campo visivo, regolando la fase di campione microscopio. Scegli una zona di interesse sul tessuto spostando il palcoscenico campione AFM, quindi passare alla visualizzazione telecamera CCD per registrare contrasto di fase e / o immagini di fluorescenza del tessuto, come desiderato. </li><li> Eseguire standard di funzionamento impegno AFM muovendo la punta AFM lentamente verso il basso fino a quando non è in contatto con il campione. </li><li> Accurata caratterizzazione micropenetrazione AFM di campioni agevolato richiede profondità piccola rientranza per evitare grandi tensioni locali che invalidare il modello di Hertz utilizzato per il calcolo modulo elastico. Per evitare tensioni di grandi dimensioni, effettuare il rientro in modalità attiva impostando la deformazione massima a sbalzo (trigger point) a 500 nm. Questo limite sarà frenare la flessioneforza il rientro massimo a meno del 30 nN (F = molla a sbalzo * spostamento costante, o C max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> La velocità di rientro deve essere selezionato per essere sufficientemente lento per esplorare piuttosto elastico proprietà viscoelastiche del campione di morbidi 7. Una gamma di velocità di 2-20 micron al secondo è adatto per il tessuto polmonare. <ol start="10"><li> Per una singola misura da una zona di interesse, spostare la sonda AFM alla posizione di interesse ed effettuare un rientro solo per raccogliere uno standard di forza-spostamento della curva (la sonda si muove solo in direzione Z senza scansione XY). </li><li> Per la mappatura automatica di una regione di interesse, passare alla modalità di Forza-Map, selezionare il formato di scansione e punti di campionamento all'interno dell'area selezionata. In Forza-Map modalità, il raster punta AFM tutta la superficie del campione tra i movimenti di rientro, e raccoglie i singoli forza-spostamento delle curve in ogni punto all'interno di una griglia di campionamento definito. Punti di prelievo più fornirà maggiore risoluzione spaziale, ma allungare i tempi necessari per la mappatura. Abbiamo trovato pratico utilizzare una griglia di 16 x 16 campione per mappare un 80 x 80 micron zona ad una velocità di rientro di 20 micron al secondo, che può essere completato in circa 10 minuti. </li></ol> 3. AFM Estrazione dei dati <ol><li> Per calcolare il modulo di Young, inserire la forza-spostamento della curva al modello Hertz indentazione sferica con minimi quadrati non lineare curva raccordo 8 (Fig.1 A, C): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="Equazione 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 1"> dove F = k c * Δ d, è la forza di piegare il cantilever, k c è la molla a sbalzo costante, R è punta raggio della sfera, δ = Δ z - Δ d è indentazione e υ è il rapporto di Poisson del campione (υ = 0,4 per il tessuto polmonare 9). </li><li> Per valutare la qualità del fit, calcolare il valore SSR, o la somma dei quadrati delle differenze tra i dati ed i valori in forma, durante il montaggio non lineare curva. Eliminare le misurazioni inaffidabili o non interpretabili dai dati scartando da "cattivo" le curve con i valori SSR di grandi dimensioni. </li><li> Se lo si desidera, convertire modulo elastico (E) al modulo di taglio (G), utilizzando la relazione E = 2 x (1 + υ) x G. Per visualizzare modelli spaziali di rigidità raccolti in Forza-Map modalità, tracciare i dati nel modulo di contorno mappe (per esempio in griglia di 16 x 16 campione che copre una 80 x 80 micron-area). </li><li> Per elaborare una grande quantità di dati curva di forza, un algoritmo personalizzato può essere scritta per adattare automaticamente le curve forza-spostamento, estratto di moduli e / o elastographs trama utilizzando le stesse procedure e parametri, come indicato al punto 3.2 e 3.3 (ad esempio Matlab). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 (A) Schema di micropenetrazione AFM di un campione morbida su un substrato rigido utilizzando una sonda sferica (Riprodotto con il permesso di Dimitriadis E., et al. 2002 Biophys J 8). (B) Rappresentante forza-spostamento curva raccolti da un vetrino pulito in PBS flessione per determinare la sensibilità a sbalzo. (C) Rappresentante forza-spostamento curve raccolti da morbida (blu) e rigida (rosso) i campioni che presentano i parametri corrispondenti (A). 4. Rappresentante dei risultati: Figura 2A mostra una striscia di parenchima polmonare attaccato il poli-L-lisina coprioggetto rivestito in PBS con una sonda AFM al posto direttamente sopra la regione di interesse e pronti per la mappatura micropenetrazione. Figura 2B mostra che nel tessuto opportunamente tagliati e colorati, la microarchitettura alveolare del parenchima polmonare è ben conservata, come osservato dalla colorazione per immunofluorescenza laminina componente membrana basale senza fissazione o permeabilizzazione. Figura 2 mostrano colorazione CD immunofluorescenza per il collagene I polmoni non fissate in fresco raccolto da topi precedentemente trattati con PBS (Fig. 2C), o trattati con bleomicina (Fig. 2D) per indurre fibrosi 10. Figura 3A mostra campione forza-spostamento trame ottenute da micropenetrazione AFM. Con la stessa forza applicata, AFM punta genera un grande rientro su una regione morbido (linea blu), risultando in un relativamente "piatta" forza-spostamento della curva contro una piccola rientranza e una "ripida" curva forza-spostamento per una regione più rigido ( linea rossa). Al fine di ottenere curve di spinta pulito, dopo ogni rientro la punta AFM deve essere ritirato completamente dalla superficie del campione e senza contatto prima il rientro successivo. Questo stato contatto libero corrisponde alla regione pianeggiante della curva in figura 3a, dove la punta si traduce senza flessione a sbalzo. Figura 3B mostra una tipica curva falsa senza una regione pianeggiante che si verifica quando la punta non è completamente ritirato dalla superficie del campione (per esempio, campione morbido unottaches alla punta) che rendono impossibile determinare il punto di contatto. Se la punta è completamente intrappolata nel campione morbido, la curva può apparire come mostrato nella Figura 3C, senza deflessione chiaro, ma il rumore di piccole dimensioni. La Figura 4 mostra i dati di taglio modulo estratto da forza-spostamento curve visualizzate nello spazio come mappe rigidità (elastographs), dove le scale di colore con il modulo di elasticità tangenziale. Elastographs dimostrano notevoli differenze nella gamma e distribuzione di modulo di taglio dei tessuti in condizioni normali (Fig. 4A) e fibrotica (Fig. 4B) parenchima polmonare, e grandi variazioni spaziali nel modulo di taglio, in particolare all'interno del campione polmonari fibrotiche. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. (A) Micrografia contrasto di fase che mostra una sonda AFM su una striscia di parenchima polmonare del mouse. Scala bar, 50 micron. (B) immunocolorazione della laminina nel tessuto polmonare normale del mouse mostra la microarchitettura alveolari del parenchima polmonare normale. Scatola bianca indica tipico 80-by-80μm zona mappatura elasticità. Scala grafica: 20 micron. (C e D) del collagene I immunocolorazione in soluzione salina (C) e bleomicina (D) trattati topo parenchima polmonare. Barre di scala, a 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. (A) Rappresentante interpretabili forza-spostamento curve raccolti da salina (blu) e trattati con bleomicina (rosso) del mouse parenchima polmonare, rispettivamente. Le linee nere sono la migliore misura ottenuta dal modello Hertz sferica e sono etichettate con il loro corrispondente calcolato moduli di Young. (B, C) Rappresentante ONU-interpretabile forza-spostamento delle curve. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Elastographs Rappresentante raccolti da salino (A) e trattati con bleomicina (B) del mouse parenchima polmonare. Le barre di colore indicano modulo di taglio in kilopascal. Etichette degli assi indicano scala spaziale in micrometri. Scala grafica: 20 micron

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare, utilizzando micropenetrazione AFM offre risoluzione spaziale senza precedenti (Fig. 4), che fornisce una prospettiva unica sulle variazioni in microscala rigidità dei tessuti. Come esempio della sua utilità, precedenti macro-scala di misurazione in strisce polmone normale e fibrotica del tessuto indicato un circa 2-3-volte più elevata elastanza con fibrosi 11,12. Al contrario, micropenetrazione AFM rivela che irrigidire il tessuto è altamente localizzata, con alcune regioni espositrici fino a ~ aumenta di 30 volte nel modulo di taglio sopra la media osservata nel tessuto polmonare normale 10. Come matrice di rigidezza è ormai noto per influenzare in modo critico la funzione delle cellule, queste misure locali forniscono parametri inestimabile per migliorare la biofidelity di studiare la cultura di cellule polmonari. Diverse questioni pratiche sorgono con l&#39;uso di sottili strisce di tessuto polmonare. Le superfici delle strisce non sono perfettamente piatte, come il profilo dei tessuti segue l&#39;architettura degli alveoli sottostante. Il sistema regola automaticamente AFM posizione della punta nella direzione Z durante indentazione quando la superficie del campione variazione altezza è inferiore di 15 micron per aiutare a superare questa sfida. Le misurazioni sono effettuate a temperatura ambiente, non 37 ° C, quindi deviazioni in proprietà meccaniche causate da questa variazione di temperatura non possono essere valutate, anche se ci si aspetterebbe di essere minorenne. L&#39;influenza dell&#39;architettura sottostante muro alveolare osservato proprietà meccaniche è difficile determinare con la configurazione attuale microscopia ottica. Per esempio, sarebbe auspicabile per determinare se le pareti alveolari presentare anisotropia e proprietà meccaniche diverse, quando rientrato in direzioni allineati con o trasversali al piano della parete. Tuttavia, i campioni attuali sono spesse e il sistema di imaging non ha capacità 3D, quindi non è possibile determinare l&#39;orientamento locale muro alveolare in ogni punto di contatto. Infine, l&#39;influenza dei costituenti cellulari su misura delle proprietà meccaniche deve essere ancora pienamente chiarito. Nei metodi disponibili a questo link, non vengono compiuti sforzi per rimuovere specificamente costituenti cellulari del tessuto. Tuttavia, le cellule presenti in superficie disponibile per l&#39;indentazione difficilmente realizzabile tenuto conto del tempo trascorso dalla raccolta dei tessuti e la necessità di tagliare il tessuto per ottenere l&#39;accesso agli alveoli. Esperimenti specifici per rimuovere le cellule, o ripopolare matrici con cellule vitali, e valutare le conseguenti modifiche delle rigidità del tessuto sembrerebbe giustificata. Perché fresco tessuto non fissato è necessario per queste misurazioni, il tempo trascorso dalla raccolta tessuto misura deve essere ridotta al minimo e campioni devono essere conservati a 4 ° C per evitare cambiamenti nelle proprietà meccaniche. Particolare attenzione deve essere prestata quando le strisce di tessuto sono trasferiti tra i contenitori durante il lavaggio o colorazione in modo che la distorsione minima o danni generati. Per applicazioni AFM in un liquido, un passo fondamentale è quello di tagliare il tessuto più piatta possibile e immobilizzare il campione sul vetrino di sostegno. Se disponibile, una macchina automatica sezionamento come un vibratome affettatrice o tessuto può essere usato per tagliare fette di spessore estremamente uniforme. E &#39;importante collegare le strisce di tessuto immediatamente prima dell&#39;inizio delle misurazioni AFM e minimizzare il tempo trascorso per misure AFM come il campione alla fine si staccano dal coprioggetto. Una osservazione utile è che le più grandi strisce sembrano dare più stabile per coprire scivola e rimane in vigore per periodi più lunghi in PBS più piccole strisce. Micropenetrazione AFM può caratterizzare campioni che abbracciano una vasta gamma da 100 Pa a 50 kPa (modulo di taglio) quando si utilizza uno standard di 0,06 N / m cantilever con un diametro di 5 micron punta sferica. Questa gamma può essere espansa utilizzando sonde con differenti costanti di primavera; sonde AFM con punte di vetro sferica che vanno dal 0,6-12 micron di diametro e costanti molla che vanno dal 0,01-0,58 N / m sono disponibili in commercio (ad esempio Novascan) e di uso comune 3. Con una punta di 5 micron sferica, l&#39;area di contatto teorico tra la punta e il tessuto è di circa 5-9 micron 2 per 400-700 nm indentazione (Fig. 1A). Punte più piccole o più grandi possono essere utilizzate per fornire scale più piccole o più grandi di risoluzione spaziale. Punte piramidali sono stati utilizzati anche in micropenetrazione AFM 13-16, offrendo aree di contatto più piccola e aumentando così la risoluzione spaziale in cartografia, anche se raccordo dei dati è più complessa di questa geometria della punta. Diversi limiti di questo metodo dovrebbe essere notato. Il polmone è stato tradizionalmente caratterizzato meccanicamente in modo non invasivo, per esempio utilizzando la pressione-volume di analisi 17 o punch-indentazione dei polmoni interi 19,20. Metodi invasivi come quello descritto qui alterare l&#39;architettura del polmone in maniera importante con la perdita del aria-liquido interface che normalmente esiste in aria piena di polmone e la perdita di pre-stress, che mantiene l&#39;inflazione parziale del polmone sul rilassamento dei muscoli respiratori. Queste limitazioni sono comuni a tutte le misurazioni effettuate in strisce tessuto polmonare 18. In particolare, tuttavia, la rigidità media misurata nel parenchima del tessuto polmonare normale (modulo di taglio ~ 0.5kPa) non differisce sostanzialmente da stime basate su punch-indentazione dei polmoni intatti a volumi di riposo 19,20. Mentre il tessuto polmonare è noto per esibire non lineare irrigidimento con deformazione crescente, non è possibile testare in modo rigoroso se questa proprietà persiste fino alla micro-scala con i metodi qui. Il modello di Hertz assume l&#39;omogeneità del campione. Tuttavia, la maggior parte dei materiali biologici, tra cui parenchima polmonare, sono sempre più eterogenei a ridurre scale spaziali. L&#39;eterogeneità del campione può causare difetti come la variazione di modulo di Young a seconda della profondità di indentazione, cioè a seconda del livello o componente che è deformante. L&#39;eterogeneità del piano xy può essere limitato a scegliere con cura la dimensione appropriata estremità sferica a seconda della microstruttura del biomateriale come proposto dal Dimitriadis EK et al. 8 E &#39;molto più difficile da prevedere e correggere l&#39;errore Hertz modello a causa di materiale eterogeneità nella direzione z. Azeloglu et al. recentemente proposto un modello ibrido di calcolo per caratterizzare le proprietà elastiche del substrato eterogeneo con inclusioni discrete incorporate 21. La loro nuova tecnica offre un potenziale strumento per calcolare le proprietà inserimento di materiali eterogenei superare i limiti di analisi hertziane. Il modello di Hertz si assume altresì assoluto comportamento elastico, mentre i materiali biologici tipicamente display del tempo-dipendente comportamenti viscoelastico. Una caratterizzazione viscoelastica completa del tessuto può essere ottenuto variando la velocità di rientro usato. Importante, precedente macro-scala prove meccaniche del tessuto polmonare normale e fibrotica dimostra la dipendenza debole frequenza delle proprietà meccaniche del tessuto polmonare, e la conservazione delle differenze tra le proprietà dei tessuti normali e fibrotico meccanica su tutte le frequenze testate 11. Questi risultati suggeriscono fortemente che la misura delle proprietà meccaniche con una velocità di solo rientro con AFM coglie un aspetto essenziale dei cambiamenti nelle proprietà meccaniche dei tessuti che accompagnano la fibrosi. Il rapporto di Poisson di 0,4 per tessuto polmonare utilizzati in questo lavoro è di una misura macroscopica 9. Purtroppo, il rapporto di Poisson in micro-scala e qualsiasi cambiamento in condizioni di malattia non sono disponibili in letteratura. Come alternative alla E, E / (1-υ 2) o (1-υ 2) / πE (indicata la costante elastica k) 22 può essere calcolata da micropenetrazione AFM e segnalato quando il rapporto di Poisson è sconosciuta. Per la maggior parte dei biomateriali rapporto di Poisson è nel range di 0,4-0,5 a causa del loro alto contenuto di acqua. All&#39;interno della gamma 0,3-0,5, il fattore 1 / (1-υ 2) varia solo 1,10-1,33, tali che le variazioni ragionevoli in rapporto di Poisson hanno soltanto effetti modesti sul modulo riportato. L&#39;aumento del modulo di taglio che riportiamo di tessuto fibrotico rispetto al tessuto normale è diverse volte in grandezza, il che implica che gli errori associati a variazioni nel rapporto di Poisson sono minimi rispetto ai cambiamenti nelle proprietà meccaniche osservato. L&#39;algoritmo attuale e codice che può essere utilizzato per l&#39;analisi della forza-spostamento dati è soggetto alla condizione specifica applicazione e le caratteristiche delle successive diverse popolazioni di forza-spostamento curve. Se più sofisticate analisi è di interesse, si può consultare il lavoro di Lin et al. 23. Gli autori hanno compilato una serie di strategie sinergiche in un algoritmo che risolve molte delle complicazioni che hanno precedentemente ostacolato gli sforzi per automatizzare il montaggio di modelli di dati Hertz rientro. Diverse altre aree sono disponibili per l&#39;ulteriore sviluppo e valorizzazione di questo metodo. Nei casi in cui uno è interessato a visualizzare le pareti alveolari senza etichettatura di anticorpi, sia elastina e collagene possono essere visualizzati dal loro segnale autofluorescenti nello spettro verde. D&#39;altra parte, una migliore immagine, usando sezioni di tessuto più sottile, le tecniche di imaging 3D, o entrambi, potrebbe migliorare la capacità di correlare l&#39;architettura dei tessuti con proprietà meccaniche di base. Mentre i metodi attuali consentono colorazione e la visualizzazione dei componenti della matrice extracellulare come collagene e laminina, ulteriori sforzi potrebbero rivolgersi a colorazione marcatori di superficie delle cellule per identificare popolazioni di cellule specifiche e per caratterizzare la microambienti meccanica nelle vicinanze di queste popolazioni. Alternatively, il tessuto potrebbe essere raccolto da topi che esprimono fluorescente-tagged lignaggio o marcatori delle cellule proteine ​​specifiche per perseguire lo stesso obiettivo. Infine, il metodo dettagliato appare qui ben si adatta a caratterizzare le altre caratteristiche anatomiche del polmone, come ad esempio le navi che rimodellare nell&#39;ipertensione, e le vie respiratorie che rimodellare in asma. In base al suo stato attuale di sviluppo e potenzialità di ulteriore potenziamento, micropenetrazione AFM sembra pronto a dare preziose informazioni i cambiamenti nella rigidità dei tessuti che accompagnano la progressione della malattia nei polmoni, e sarà senza dubbio di valore nel caratterizzare i cambiamenti spaziali e temporali nel la rigidità di una varietà di altri tessuti molli.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> AFM punta </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 micron borosilicato tallone, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina coprioggetto </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 millimetri rotonda No.1 vetro </td></tr><tr><td> Agarosio, gelificanti bassa temperatura </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Coniglio anti-collagene I (Rb PAB) anticorpi </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 di capra anti-coniglio di anticorpi </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Coniglio anti-laminina </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare usando la microscopia a forza atomica

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrice di rigidezza influenza fortemente la crescita, la differenziazione e la funzione delle cellule aderenti 1-3. Su scala macro la rigidità dei tessuti e organi nel corpo umano arco di diversi ordini di grandezza 4. Molto meno si sa su come la rigidità varia spazialmente all&#39;interno di tessuti, e ciò che la portata e la scala spaziale dei cambiamenti rigidità sono in processi patologici che provocano rimodellamento del tessuto. Per capire meglio come i cambiamenti nella matrice di rigidezza contribuire alla fisiologia cellulare in salute e malattia, la misurazione della rigidità tessuti ottenuti su scala territoriali attinenti alle cellule residenti sono necessari. Ciò è particolarmente vero per il polmone, un tessuto altamente compatibile ed elastico in cui rimodellamento della matrice è una caratteristica importante in malattie come l&#39;asma, enfisema, ipertensione e fibrosi. Per caratterizzare l&#39;ambiente locale meccaniche del parenchima polmonare in una scala territoriali attinenti alle cellule residenti, abbiamo sviluppato metodi per misurare direttamente le proprietà elastiche del locale fresco tessuto polmonare murino utilizzando microscopia a forza atomica (AFM) micropenetrazione. Con la scelta appropriata di AFM penetratore, a sbalzo, e la profondità di indentazione, questi metodi consentono misure di modulo di taglio del tessuto locale in parallelo con contrasto di fase e di imaging di fluorescenza della regione di interesse. Campionamento sistematico delle strisce di tessuto fornisce mappe delle proprietà meccaniche del tessuto locale, che rivelano le variazioni spaziali nel modulo di elasticità tangenziale. Correlazioni tra proprietà meccaniche e caratteristiche anatomiche sottostanti e patologiche illustrare come la rigidità varia con deposizione di matrice nella fibrosi. Questi metodi possono essere estesi ad altri tessuti molli e processi di malattia di rivelare come le proprietà meccaniche del tessuto locale variano tra lo spazio e la progressione della malattia.

La rigidità della matrice extracellulare influenza fortemente i comportamenti multipli di cellule aderenti. Matrice di rigidezza varia spazialmente in tutto un tessuto, e subisce modifiche nelle condizioni patologiche diverse. Qui sviluppare metodi per la caratterizzazione variazioni spaziali della rigidità nei tessuti del mouse normale e fibrotica del polmone mediante microscopia a forza atomica micropenetrazione.

Micro-Caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare usando la microscopia a forza atomica

La rigidità della matrice influenza fortemente la crescita, il differenziamento e la funzione delle cellule aderenti1-3. Su scala macroscopica, la rigidità di tessuti e organi...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è caratterizzare l'ambiente meccanico locale del parenchima polmonare a una scala spaziale rilevante per le cellule residenti, misurando direttamente le proprietà elastiche locali di tessuto polmonare fresco mediante microindentazione al microscopio a forza atomica. Questo viene ottenuto tagliando il tessuto polmonare di topo gonfiato con agarosio mediante lama di rasoio o bisturi, per preparare strisce di parenchima polmonare di cinque millimetri per cinque millimetri di lunghezza e larghezza, e di 400 micrometri di spessore. Successivamente, le strisce di tessuto polmonare non fissate e non permeabilizzate vengono sottoposte a immunomarcatura, che identifica le aree di interesse per la microindentazione al microscopio a forza atomica.Successivamente, viene eseguita un'indentazione microscopica con FM su strisce di tessuto in PBS a temperatura ambiente. Per misurare direttamente le proprietà elastiche locali del tessuto polmonare fresco si ottengono risultati che mostrano differenze evidenti nell'intervallo e nella distribuzione della rigidità tissutale nei parenchimi polmonari normali e fibrotici, nonché ampie variazioni spaziali della rigidità, in particolare all'interno del campione polmonare fibrotico.In base a mappe di rigidità estratte da curve di spostamento forzato ottenute mediante microindentazione con microscopio a forza atomica (FM). Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle misurazioni esistenti, come lo stiramento di strisce di tessuto, è che offre una risoluzione spaziale senza precedenti, fornendo una prospettiva unica sulle variazioni su scala microscopica della rigidità del tessuto. Questa misura può aiutare a rispondere a domande fondamentali, come in che modo la rigidità varia spazialmente all'interno del tessuto e quali siano l'entità e la scala spaziale delle variazioni di rigidità nella malattia.Processi che portano al rimodellamento dei tessuti. Per preparare strisce di tessuto polmonare, iniziare stabilizzando la struttura del polmone per il taglio, gonfiando i polmoni isolati di topo. Per via intratracheale, con 50 millilitri per chilogrammo di peso corporeo di agarosio al 2% a basso punto di gel, preparato in PBS; legare l'organo alla trachea e raffreddare i polmoni gonfiati in un bagno di PBS a quattro gradi Celsius per 60 minuti. L'agarosio formerà un gel e si indurirà negli spazi aerei, stabilizzando delicatamente la struttura del polmone. Durante questo intervallo, utilizzando un rasoio o un bisturi, tagliare il tessuto polmonare di topo stabilizzato con agarosio in strisce di circa cinque per cinque millimetri di lunghezza e larghezza, e 400 micrometri di spessore.Quindi lavare le strisce in PBS a 37 gradi Celsius per cinque minuti per rimuovere l'aros residuo ed escludere le vie aeree di grandi dimensioni e i vasi. Tagliare le strisce dalle regioni sottopleuriche distanti dai bronchi principali se si desidera visualizzare le vie aeree e i grossi vasi; tagliare le strisce dal tessuto polmonare più prossimale ai bronchi principali per isolare le aree di interesse per una microindentazione in FM. Visualizzare il tessuto mediante microscopia a contrasto di fase o immunomarcatura e osservare mediante microscopia a fluorescenza.Consultare la parte scritta di questo protocollo per la procedura. Immediatamente prima di una caratterizzazione in microscopia a fluorescenza (FM), fissare le strisce di tessuto su coprioggetti da 15 millimetri rivestiti con poli-L-lisina sollevando il coprioggetto dal basso rispetto al tessuto in galleggiamento, assicurandosi che la striscia di tessuto si distribuisca uniformemente sulla superficie del coprioggetto. Se necessario, posizionare una seconda striscia pulita non rivestita sopra la striscia di tessuto e applicare una leggera pressione per favorire l'adesione del tessuto al coprioggetto rivestito con poli-L-lisina.Calibrare il sistema AFM seguendo le istruzioni del produttore immediatamente prima di ogni serie di esperimenti di microindentazione. A tale scopo, determinare due parametri fondamentali: la costante elastica della mensola, utilizzando il metodo delle fluttuazioni termiche in aria, e la sensibilità di deflessione della mensola, che è un parametro utilizzato per convertire il segnale di uscita del fotodiodo nella reale distanza di deflessione della mensola.Calibrare la sensibilità di deflessione ottenendo una curva standard di spostamento forzato in PBS su un vetrino pulito. Quindi calcolare la pendenza della curva di spostamento forzato nella misurazione della curva di spostamento forzato. La punta AFM viene avvicinata e allontanata dalla superficie del campione in un'unica posizione, monitorando la deflessione della mensola delta D in funzione dello spostamento della punta delta Z. Si raccomanda di utilizzare una mensola triangolare in nitruro di silicio con una punta sferica in borosilicato di cinque micrometri di diametro, impiegando sonde FM con una costante elastica di 0,06 newton al metro.Abbiamo caratterizzato meccanicamente materiali morbidi con modulo di taglio compreso tra 100 e 50.000 pascal. Pulire la superficie inferiore del vetrino del campione con carta da laboratorio, quindi fissarlo a un normale vetrino in vetro con grasso da vuoto. Montare il vetrino in vetro sul portacampioni dell'AFM e ricoprire la carta con 500 microlitri di PBS a temperatura ambiente.Quindi posizionare la testa di scansione FM sopra il campione. Regolare la piastra del campione del microscopio per impostare il microscopio sulla visione attraverso l'oculare, in modo da allineare la punta FM al centro del campo visivo. Spostare la piastra del campione FM per selezionare un'area di interesse sul tessuto.Quindi passare alla visualizzazione con la telecamera CCD per registrare l'immagine in contrasto di fase e/o le immagini di fluorescenza del tessuto secondo necessità. Spostare lentamente la punta del microscopio a forza atomica (AFM) verso il basso finché non entra in contatto accurato con il campione. La caratterizzazione mediante microindentazione AFM di campioni morbidi richiede profondità di indentazione ridotte per evitare deformazioni locali elevate, che renderebbero non valido il modello di Hertz utilizzato per il calcolo del modulo elastico; per evitare grandi deformazioni, eseguire l'indentazione in modalità trigger impostando la deflessione massima della mensola a 500 nanometri.Questo limite di deflessione limiterà la forza massima di indentazione a meno di 30 nanonewton. La velocità di indentazione deve essere scelta in modo da essere sufficientemente lenta da esplorare le proprietà elastiche piuttosto che quelle viscoelastiche del campione morbido. Selezionare un intervallo di velocità compreso tra due e 20 micrometri al secondo per il tessuto polmonare per una singola misurazione da un'area di interesse.Spostare la sonda A FM nella posizione di interesse ed eseguire una singola indentazione per acquisire una curva forza-spostamento standard. La sonda si muoverà soltanto nella direzione Z. Per la mappatura automatica di una regione di interesse, passare alla modalità mappa di forza, selezionare le dimensioni della scansione e i punti di campionamento all'interno dell'area selezionata.La punta AFM si sposta sulla superficie del campione tra un'indentazione e l'altra, raccogliendo singole curve forza-spostamento in ciascun punto di una griglia predeterminata. Abbiamo trovato pratico utilizzare una griglia di 16 per 16 punti per mappare un'area di 80 micrometri per 80 micrometri con una velocità di indentazione di 20 micrometri al secondo, operazione completabile in circa 10 minuti. Per calcolare il modulo di Young, si adatta la curva forza-spostamento al modello di indentazione sferica di Hertz mediante un fitting non lineare ai minimi quadrati, come mostrato qui, dove F è uguale a K con pedice C moltiplicato per delta D, ovvero la forza necessaria per flettere la mensola.K sub C è la costante elastica della mensola. R è il raggio della sfera della punta, delta uguale a delta Z meno delta D è l'indentazione, e nu è il rapporto di Poisson del campione, che è pari a 0,4 per il tessuto polmonare. Per valutare la qualità dell'adattamento, calcolare il valore SSR, ovvero la somma dei quadrati delle differenze tra i dati e i valori stimati durante l'adattamento non lineare della curva.Eliminare le misurazioni non affidabili o non interpretabili scartando i dati provenienti da curve difettose con valori elevati di SSR. Se necessario, convertire il modulo elastico o E in modulo di taglio G, utilizzando la relazione E uguale a due volte la somma di uno più nu per G. Per visualizzare i modelli spaziali di rigidità raccolti in modalità mappa di forza, tracciare i dati del modulo e le mappe di contorno, ad esempio, in una griglia 16 per 16 che copre un'area di 80 micrometri per 80 micrometri.Per elaborare una grande quantità di dati di curve di forza, può essere scritto un algoritmo personalizzato per adattare automaticamente le curve forza-spostamento, estrarre moduli e/o tracciare mappe di contorno o innesti ELA. Utilizzando le stesse procedure e parametri appena descritti, questa figura mostra che il tessuto è stato correttamente tagliato e colorato. La microarchitettura alveolare del parenchima polmonare è ben preservata, come osservato mediante colorazione immunofluorescente per il componente della membrana basale, la laminina, senza fissazione né permeabilizzazione.Questi pannelli mostrano la colorazione immunofluorescente per il collagene, eseguita su polmoni freschi non fissati ottenuti da topi precedentemente trattati con PBS o con bleomicina per indurre fibrosi. Qui vengono mostrati grafici di spostamento-forza ottenuti mediante microindentazione FM con la stessa forza applicata. La punta AFM genera una grande indentazione in una regione morbida, producendo una curva forza-spostamento relativamente piatta, mostrata in blu, rispetto a una piccola indentazione e a una curva forza-spostamento ripida in una regione più rigida, mostrata in rosso.Per ottenere curve di forza pulite dopo ogni indentazione, la punta del microscopio a forza atomica (AFM) deve essere ritratta completamente dalla superficie del campione e libera da qualsiasi contatto prima della successiva indentazione. Questo stato senza contatto corrisponde alla regione piatta della curva, in cui la punta si sposta senza deflessione della mensola. Questa figura mostra una tipica curva errata priva di regione piatta, che si verifica quando la punta non viene ritratta completamente dalla superficie del campione, ad esempio quando un campione morbido aderisce alla punta, rendendo impossibile determinare il punto di contatto se la punta rimane completamente intrappolata nel campione morbido.La curva può apparire di questo tipo, senza deflessioni chiare, ma con un lieve rumore. Questa figura mostra la rigidità. I dati estratti dalle curve di spostamento forzato sono visualizzati spazialmente come mappe di rigidità relative all'innesto di ELAs, in cui la scala cromatica corrisponde alla rigidità. Gli innesti di ELAs mostrano differenze evidenti nell'intervallo e nella distribuzione della rigidità del tessuto nel parenchima polmonare normale e fibrotico, nonché ampie variazioni spaziali della rigidità, in particolare all'interno del campione polmonare fibrotico.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caratterizzare l'ambiente meccanico locale del parenchima polmonare misurando direttamente le proprietà elastiche locali del tessuto polmonare fresco mediante microscopia a forza atomica.

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