Modellazione del cancro alla prostata in modelli murini geneticamente modificati: una tecnica di editing genico localizzato mediata da CRISPR/Cas9 nelle cellule del lobo prostatico anteriore del topo

Inizia con un modello murino knock-in CRISPR/Cas9 anestetizzato e preparato con un genoma ingegnerizzato per esprimere endonucleasi Cas9 e proteine fluorescenti verdi, o GFP, da un forte promotore a monte. Una cassetta floxed-STOP o LSL inserita immediatamente a valle del promotore blocca la trascrizione di Cas9 e GFP in condizioni normali.

Incidere la parete addominale del topo per esporre il lobo prostatico anteriore attaccato alla vescicola seminale. Iniettare la sospensione adenovirale desiderata nel lobo anteriore per facilitare la somministrazione mirata del genoma virale nelle cellule. Riposizionare il lobo prostatico nella cavità addominale e suturare l'incisione.

All'interno delle cellule infettate da virus, il genoma virale esprime gli enzimi Cre ricombinasi e gli RNA guida che hanno come bersaglio il gene da mutare. Gli enzimi Cre riconoscono la cassetta LSL e asportano il bloccante della trascrizione floxed. Questo passaggio consente al promotore di guidare l'espressione delle endonucleasi Cas9 e delle GFP.

Successivamente, le endonucleasi Cas9 formano complessi con RNA guida codificati dal virus che dirigono questi complessi verso la sequenza bersaglio all'interno del gene da mutare. Questa localizzazione consente all'endonucleasi Cas9 di scindere il DNA genomico all'interno del gene bersaglio, portando all'alterazione genetica.

Un'alterazione oncogenica fa sì che le cellule mutate diventino cancerose. La co-espressione delle proteine reporter GFP all'interno delle cellule mutate facilita l'identificazione e il monitoraggio della progressione del cancro.

Per veicolare il virus alla prostata, dopo aver anestetizzato un topo maschio di 8 settimane secondo il protocollo di testo, esaminare la profondità dell'anestetico valutando il rilassamento muscolare, il ritiro del pedale e i riflessi palpebrali. Quando si osserva una perdita di riflessi, radere il basso addome dell'animale. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, coprire accuratamente gli occhi dell'animale con un unguento oftalmico veterinario per prevenire la cecità causata dalla xeroftalmia. Quindi, utilizzare il 70% di etanolo e il 10% di iodio povidone per pulire l'addome rasato per disinfettare l'area chirurgica.

Successivamente, utilizzando le forbici chirurgiche sterili, praticare un'incisione cutanea verticale di circa 1 centimetro sulla linea mediana addominale inferiore. Quindi, con una pinza a punta sottile, sollevare il peritoneo per evitare di danneggiare gli organi che si trovano sotto e utilizzare le forbici chirurgiche per praticare con cura un'incisione di 8 millimetri o più corta attraverso il peritoneo. Sposta delicatamente il tessuto adiposo da parte per scoprire la vescicola seminale. Quindi, utilizzando una pinza ad anelli, sollevare con cautela la vescicola seminale fino a identificare la prostata anteriore.

Ora, con una siringa da insulina da 0,5 millilitri e un ago da 30 G x 8 millimetri, iniettare un volume totale di 30 microlitri di soluzione virale nell'epitelio prostatico anteriore. Ridurre al minimo le perdite e assicurarsi che il fluido venga assorbito all'interno del tessuto, formando una piccola bolla. Quindi, riposizionare la vescicola seminale nella cavità addominale.

Per garantire che il fluido venga assorbito all'interno del tessuto in una piccola bolla e senza perdite, assicurarsi di iniettare parallelamente alla vescicola seminale e seguendo la forma del lobo prostatico anteriore.

Con un ago a punta conica e un cerchio di 13 millimetri, 3/8, susurare il peritoneo con due o tre semplici punti interrotti di sutura assorbibile 6-0. Quindi, sollevando la pelle con una pinza per evitare di danneggiare il peritoneo, pinzare la pelle con tre clip sterili da 4,8 x 6,5 millimetri.

Per un migliore recupero dopo l'intervento chirurgico, utilizzare una siringa sterile da 1 millilitro e un ago da 27 G x 1/2 pollice per somministrare l'antidoto anestetico in una dose di 0,1 millilitri per grammo di peso corporeo mediante iniezione intraperitoneale. Quindi, rimetti con cura l'animale nella sua gabbia.