Modellazione del cancro alla prostata in modelli murini geneticamente modificati: una tecnica di editing genico localizzato mediata da CRISPR/Cas9 nelle cellule del lobo prostatico anteriore del topo

Inizia con un modello murino knock-in CRISPR/Cas9 anestetizzato e preparato con un genoma ingegnerizzato per esprimere endonucleasi Cas9 e proteine fluorescenti verdi, o GFP, da un forte promotore a monte. Una cassetta floxed-STOP o LSL inserita immediatamente a valle del promotore blocca la trascrizione di Cas9 e GFP in condizioni normali.

Incidere la parete addominale del topo per esporre il lobo prostatico anteriore attaccato alla vescicola seminale. Iniettare la sospensione adenovirale desiderata nel lobo anteriore per facilitare la somministrazione mirata del genoma virale nelle cellule. Riposizionare il lobo prostatico nella cavità addominale e suturare l'incisione.

All'interno delle cellule infettate da virus, il genoma virale esprime gli enzimi Cre ricombinasi e gli RNA guida che hanno come bersaglio il gene da mutare. Gli enzimi Cre riconoscono la cassetta LSL e asportano il bloccante della trascrizione floxed. Questo passaggio consente al promotore di guidare l'espressione delle endonucleasi Cas9 e delle GFP.

Successivamente, le endonucleasi Cas9 formano complessi con RNA guida codificati dal virus che dirigono questi complessi verso la sequenza bersaglio all'interno del