Un protocollo per il knockout dei geni multipli nei piccoli organoidi intestinali del mouse usando un concatemer CRISPR

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di clonare più RNA guida in un vettore concatemero CRISPR e di ottenere un'elettroporazione altamente efficiente in organoidi intestinali di topo, al fine di ottenere il knockout simultaneo di più geni. Questo metodo può migliorare notevolmente l'efficienza degli studi sulla perdita di funzione, rendendo possibile il superamento del potenziale effetto della compensazione parallela. Il vantaggio principale della nostra strategia CRISPR-concatemer è la comodità di una singola fase di clonazione e la possibilità di eseguire il knockout simultaneo di un massimo di quattro geni diversi.

La dimostrazione della procedura sarà fatta da Alessandra Merenda, una dottoranda del mio laboratorio. Il clonaggio di RNA guida o gRNA nel vettore concatemero CRISPR inizia con una singola reazione per ricuocere i filamenti superiore e inferiore per ciascun oligonucleotide gRNA e per fosforilare le loro estremità. Preparare la miscela di reazione su ghiaccio, per tre concatemeri, utilizzare tre microlitri di gRNA del filamento superiore, tre microlitri di gRNA del filamento inferiore, due microlitri di tampone DNA ligasi T4, un microlitro di polinucleotide chinasi T4 e acqua fino a un volume totale di 20 microlitri.

Miscelare bene pipettando e facendo funzionare il termociclatore utilizzando le seguenti impostazioni, 37 gradi Celsius per 30 minuti, 95 gradi Celsius per cinque minuti, ramp down a 25 gradi Celsius a 0,3 gradi Celsius al minuto e mantenimento a quattro gradi Celsius. Il passo successivo è la reazione di rimescolamento Bbs1, in cui gli oligonucleotidi di gRNA pre-ricotti vengono incorporati nella posizione appropriata del vettore concatemero. Diluire la miscela di reazione da uno a 100 in DNA, acqua priva di RNA per generare tre e quattro vettori concatemeri di gRNA.

Assembla le reazioni di mescolamento Bbs1 sul ghiaccio. Utilizzare 100 nanogrammi di vettore concatemero CRISPR, 10 microlitri di miscela oligo, un microlitro di tampone enzimatico di restrizione, un microlitro di DTT, un microlitro di ATP, un microlitro di enzima Bbs1, un microlitro di ligasi T7 e acqua fino a un volume totale di 20 microlitri. Mescolare bene con il pipettaggio, includere un controllo negativo che contenga il vettore.

Eseguire le reazioni in un termociclatore, utilizzando le seguenti impostazioni, per clonare tre e quattro concatemeri di gRNA, eseguire 50 cicli a 37 gradi Celsius per cinque minuti e 21 gradi Celsius per cinque minuti, mantenere a 37 gradi Celsius per 15 minuti e quindi mantenere a quattro gradi Celsius a tempo indeterminato. Per due concameri di gRNA, eseguire le stesse impostazioni con 25 cicli del passaggio uno. Quando la reazione di rimescolamento Bbs1 è completa, prendere 11 microlitri di ciascuna miscela di legatura e aggiungere 1,5 microlitri di tampone esonucleasi, 1,5 microlitri di ATP, un microlitro di DNA esonucleasi e acqua per un volume totale di 15 microlitri.

Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti seguiti da 70 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, la miscela di reazione viene utilizzata per trasformare i batteri E.Coli chimicamente competenti, seguendo un protocollo standard. Per confermare la presenza di inserti di gRNA nel vettore concatemero CRISPR, prelevare colonie di batteri con un anello di inoculazione e inoculare ciascuna in quattro millilitri di terreno LB.

Coltiva i cloni durante la notte a 37 gradi Celsius in uno shaker orbitale. Il giorno seguente, il DNA viene estratto utilizzando un kit di miniprep plasmidico, secondo le istruzioni del produttore. Mescolare circa 200 nanogrammi di ciascun campione di DNA con 10 unità di EcoR1 e cinque unità di BglII in una reazione di 10 microlitri.

Includere una miscela di reazione separata con il vettore originale corrispondente come controllo positivo per il confronto delle dimensioni. Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per tre ore. Eseguire le reazioni di digestione su un gel di agarosio all'1% a 90 volt per circa 20 minuti.

Visualizza il gel utilizzando un transilluminatore UV per identificare i cloni con la dimensione corretta dell'inserto. Per confermare che i gRNA sono stati clonati nella posizione corretta e di conseguenza tutti i siti di riconoscimento di Bbs1 sono andati persi, digerire i cloni selezionati con cinque unità di Bbs1. Includere una miscela di reazione separata, con il vettore originale corrispondente come controllo.

Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore, eseguire le reazioni di digestione su un gel di agarosio all'1% a 90 volt per circa 20 minuti. Visualizzare il gel utilizzando un transilluminatore UV per identificare i vettori che non vengono tagliati da Bbs1. Quando si dividono gli organoidi per l'elettroporazione, seminare un minimo di sei pozzetti di una piastra a 48 pozzetti per trasvezione.

Seminare gli organoidi in gocce di matrice basamentale da 20 microlitri e farli crescere in 250 microlitri di WENR più terreno di nicotinamide per pozzetto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato. Il secondo giorno, sostituire il terreno WENR più nicotinamide con 250 microlitri di EGF più noggin, inibitore GSK3 e terreno inibitore della roccia senza antibiotici. Il terzo giorno, cambiare il terreno organoidico in EGF più noggin, inibitore di GSK3, inibitore della roccia e dimetilsolfossido all'1,25% senza antibiotici.

Il quarto giorno, distruggere le cupole della matrice basale, utilizzando una punta di pipetta da un millilitro e trasferire gli organoidi in una provetta da 1,5 millilitri. Estrarre il contenuto di quattro pozzetti di una piastra a 48 pozzetti in una provetta. Rompere meccanicamente gli organoidi in piccoli frammenti pipettandoli su e giù con la pipetta P200 circa 200 volte.

Centrifugare a 600 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, rimuovere il terreno da tutte le provette e risospendere le palette in un millilitro di proteasi ricombinante di grado per colture cellulari. Incubare a 37 gradi Celsius per un massimo di cinque minuti.

È importante monitorare attentamente il trattamento con proteasi perché il successo dell'elettroporazione dipende dall'ottenimento di una sospensione cellulare che contenga gruppi di cellule invece di singole cellule. Controllare una goccia di campione da 50 microlitri con un microscopio a luce invertita con un obiettivo quattro volte. Sono auspicabili cluster da 10 a 15 cellule in quanto ciò aumenta la sopravvivenza cellulare dopo l'elettroporazione.

Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri a basso legame e bloccare la dissociazione aggiungendo nove millilitri di terreno basale senza antibiotici. Centrifugare a 600 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere la tavolozza in un millilitro di terreno sierico ridotto.

Contando il numero di celle con una camera di Burkes, è necessario un minimo di una volta per 10 alla quinta cella per reazione di elettroporazione. Iniziare questa procedura aggiungendo nove millilitri di siero ridotto alla provetta da 15 millilitri contenente la sospensione cellulare e centrifugare a 400 volte G per tre minuti a temperatura ambiente. Rimuovere tutto il surnatante e risospendere la tavolozza in una soluzione di elettroporazione.

Aggiungere una quantità totale di 10 microgrammi di DNA a due nuove provette. Quindi, aggiungere la soluzione di elettroporazione fino a un volume finale di 100 microlitri e mantenere la miscela di DNA cellulare sul ghiaccio. Trasferire la miscela di DNA cellulare nella cuvetta di elettroporazione, posizionare la cuvetta nella camera dell'elettroporatore.

Misurare l'impedenza premendo l'apposito pulsante sull'elettroporatore e assicurarsi che sia compresa tra 0,030 e 0,055 ohm. Eseguire l'elettroporazione secondo le impostazioni indicate nel protocollo di testo. Aggiungere 400 microlitri di tampone di elettroporazione più un inibitore di roccia alla cuvetta e poi trasferire tutto il suo contenuto in una provetta da 1,5 millilitri.

Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire alle cellule di riprendersi. Dopo 30 minuti, centrifugare a 400 volte G per tre minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere la tavolozza in 20 microlitri per pozzetto di matrice basamentale.

Seminare circa una volta da 10 a una volta da 10 a una quinta cellula per pozzetto in una piastra a 48 pozzetti e aggiungere EGF più noggin, inibitore di GSK3, inibitore di roccia e terreno di dimetilsolfossido all'1,25%. Incubare a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, cambiare il terreno in EGF più noggin, inibitore di GSK3 e inibitore di roccia e controllare l'efficienza della trasvezione osservando l'espressione di GFP.

Mantieni gli organoidi a 37 gradi Celsius. Due giorni dopo, sostituire il terreno con un terreno fresco. Quattro giorni dopo l'elettroporazione, cambiare il terreno in WENR più nicotinamide e mezzo inibitore della roccia e continuare a incubare le cellule a 37 gradi Celsius.

La presenza del numero corretto di inserti di gRNA nel vettore concatemero è confermata dalla digestione a doppia restrizione con EcoR1 e BglII. La dimensione attesa della banda inferiore è di circa 1,6 kilobasi per un vettore concatemero a quattro gRNA e 1,2 kilobasi per un vettore concatemero a tre gRNA. Inoltre, la digestione con Bbs1 conferma che i gRNA sono stati clonati nella giusta posizione e, di conseguenza, tutti i siti di riconoscimento di Bbs1 sono persi.

I costrutti confermati vengono somministrati agli organoidi intestinali di topo mediante elettroporazione per ottenere un'efficienza di trasvezione fino al 70%, come dimostrato dall'espressione di GFP. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare vettori concatenatori di gRNA e come consegnarli in modo efficiente a colture di organoidi 3D utilizzando l'elettroporazione, al fine di ottenere il knockout di più geni contemporaneamente.