Isolamento basato su SEC di vescicole extracellulari derivate da microglia: una tecnica per isolare vescicole extracellulari da terreni di coltura condizionati con microglia

Le cellule microgliali rilasciano mediatori immunitari sotto forma di vescicole extracellulari o EV, inclusi corpi apoptotici più grandi e vescicole di dimensioni micro più piccole, in terreni di crescita in vitro.

Per isolare le vescicole extracellulari, iniziare prendendo terreni condizionati con microglia. Questo terreno di coltura contiene cellule microgliali insieme alle vescicole extracellulari rilasciate. Centrifugare il mezzo per pellettare le cellule.

Raccogliere il surnatante contenente le vescicole extracellulari, i detriti e gli aggregati proteici in una provetta nuova. Centrifugare nuovamente per rimuovere i detriti cellulari e i grandi corpi apoptotici.

Trasferire il surnatante in una provetta da ultracentrifuga. Centrifugare ad alta velocità.

Scartare il surnatante contenente il terreno esaurito e risospendere l'EV e il pellet di aggregato proteico nel tampone desiderato.

In concomitanza, prelevare una colonna cromatografica ad esclusione dimensionale con un filtro appropriato alla base.

Impacchettare strettamente la colonna con una matrice di filtrazione in gel costituita da perle di gel sferiche che formano un setaccio poroso di dimensioni definite dei pori.

Caricare la sospensione EV e aggregato proteico sopra la fase stazionaria.

Mentre la sospensione passa attraverso la colonna, le vescicole extracellulari di dimensioni maggiori si muovono attraverso gli spazi interparticellari tra le perle di gel, percorrendo un percorso più breve. Al contrario, gli aggregati proteici di dimensioni più piccole si spostano nei pori, seguendo un percorso più lungo.

Di conseguenza, le EV eluiscono per prime dalla colonna.

Raccogli le frazioni contenenti EV e utilizzale per ulteriori analisi.

Trasferire il terreno di coltura condizionato da colture di microglia o macrofagi in una provetta conica e centrifugarlo a 1.200 x g per 10 minuti per pellettare le cellule. Trasferire il surnatante in una nuova provetta conica e centrifugare per altri 20 minuti per eliminare i corpi apoptotici.

Quindi, trasferire il surnatante in un tubo di policarbonato da 10,4 millilitri. Posizionare la provetta in un rotore da 70,1 Ti e centrifugarla a 100.000 x g per 90 minuti a 4 gradi Celsius per pellettare le EV. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS filtrato da 0,2 micrometri.

Per isolare le vescicole extracellulari, preparare una colonna cromatografica ad esclusione dimensionale fatta in casa lavando e sterilizzando una colonna per cromatografia in vetro e posizionando un filtro da 60 micrometri sul fondo. Impilare la colonna con la matrice di base di filtrazione su gel di agarosio reticolato per creare una fase stazionaria di 0,6 centimetri di diametro e 20 centimetri di altezza.

Quindi, risciacquare la fase con 50 millilitri di PBS filtrato da 0,2 micrometri. Se necessario, conservare la colonna a 4 gradi Celsius per un uso successivo. Posiziona il pellet EV risospeso sopra la fase stazionaria e raccogli 20 frazioni sequenziali da 250 microlitri continuando ad aggiungere PBS alla parte superiore della fase stazionaria. Le frazioni possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius.